死亡马来穿山甲肠道中细菌的分离培养与鉴定

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广西畜牧兽医2021 年 Vol. 37(3)
(03) *
*181 -186.收简日期：2020-12 - 25基金项目：林护预(桂)2017010
作者简介:何梅红(1978 -)，女，广广崇左,技术员，大学专科，主要
从事学生产物救护研究、疾病治疗、临床医学、病原体与李物 疾病方面的研究。

* 通讯作者'E-mail ：jhjczx@126. com 。

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死亡马来穿山甲肠道中细菌的分离培养与鉴定
何梅红，谭罗昊,何永燕，吴媛琼，韦永结，李英姣，钟艳丽，阙腾程*
(广西壮族自治区陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心，广西南宁530000)
中图分类号:S858.395.1 文献标识码：B 摘要:为了解马来穿山甲病变肠道菌群的组成,本研究
通过对一只死亡的马来穿山甲的肠道细菌分别进行接 种培养、革兰氏染色及对其16S rRNA 基因序列进行
PCR 扩增等，对穿山甲病变肠道菌群的组成进行鉴定。

高通量测序后，共获得有效序列77 441条,8个OUTs ,
细菌分类归属3门3纲5目6科8属。

属含量从高到 低分别为变形杆菌属(53.46%)、埃希氏菌属-志贺氏
菌属"28.46%)、肠球菌属(17. 22%)、假单胞菌属
(0.7%)、普罗威登斯菌属(0.07%)、葡萄球菌属
(0. 05% )、拟杆菌属(0. 02% )和乳杆菌属(0. 02% )。

结合细菌的属性及马来穿山甲病变肠道的症状分析， 该马来穿山甲可能因为感染了志贺氏菌属的细菌导致 严重的肠道出血而引起死亡。

关键词：马来穿山甲；病变肠道菌群;PCR ；16S rRNA ；
鉴定
文章编号：1002 -5235(2021)03 -0102 -04 doi ： 10. 3969/j. isn. 1002 -5235.2021.03. 002
1引言
穿山甲(Manis')在分类上属于特有的单型目
鳞甲目、单型科穿山甲科、单型属穿山甲属,是哺乳
动物纲中最小的类群之一。

全球现存的穿山甲有 8种，分另提中华穿山甲(M. pentadactyl")、马来穿 山甲又称瓜哇穿山甲(M. pavanica )、印度穿山甲 (M. crassicaudata )、巴拉望穿山甲又称菲律宾穿山
的(M. culionenss )、大穿山甲(M. gigantea )、南非穿
山甲(M. temmincCH )、长尾穿山甲(M. teyradactyla ) 和树穿山甲(M. tricuspis) [1]，其中前4种分布于亚
洲,后4种分布于非洲。

2017年2月，穿山甲被列 为《华盛顿公约》CITES 附录I 级保护动物,而国际
自然及自然资源保护联盟(Tltemational Union for
Conservetion of Nature and Naturaa Resources , IT- CN )将马来穿山甲和中华穿山甲列为极度濒危物
种,印度穿山甲和菲律宾穿山甲列为濒危物种，可
见保护与研究穿山甲在全球的重要性。

肠道是开放性器官，容易受到外界环境的影响
而造成肠道微生物的紊乱，外界环境的致病菌也容
广西畜牧兽医2021年Vol.37(3)103
易通过其进入机体，改变机体内环境，从而影响机体的健康。

同样,穿山甲肠道含有大量微生物，对穿山甲肠道的正常功能以及疾病发生有着重要的影响。

但是国内外，对穿山甲肠道微生物的研究较少，学者们都是通过生态学、行为学和疾病等方面对圈养和野生穿山甲进行研究[2-8]o本文将通过对马来穿山甲体内病变肠道菌群的分子生物学鉴定，初步掌握穿山甲病变肠道细菌种群的组成。

一方面有利于认识穿山甲病变肠道的细菌组成和分析肠道疾病;另一方面为穿山甲的死亡提供更科学的诊断依据，更为穿山甲病变肠道菌群的研究提供新的数据支持。

2材料
2.1动物
死亡马来穿山甲一只，雌性，体重2.5ki,年龄2岁~3岁。

2.2仪器
生化培养箱（北京水光明医疗仪器，SPX-150）、PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司，001-60615）、电泳仪（北京市六一仪器厂，DYCP-31BN/DYCP）、凝胶成像仪（上海天能科技有限公司,TANON-2500）、超净台（江苏苏洁净化设备, SJ-CJ-2FD）、恒温培养摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司,KYC-100B）、微波炉（上海格兰仕微波生活电器,G70F20-CN1L-DG）、纯水仪（东莞市陶氏水处理设备,TS-RO-20-30L/H）、立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂, 60G150114）、移液器（Eppenforf）、显微镜（OLYM­PUS,CX41）、电子天平（瑞安市安特称重设备有限公司,JE1002）、接种环、酒精灯、剪刀、镊子、药勺、三角瓶、载玻片、EP管、PCR管等。

2.3主要试剂与耗材
营养琼脂平皿（苏州广恒生物科技有限公司，KM0071）、革兰氏染色剂盒（北京陆桥技术股份有限公司）、2k Es Tap MasterMix（康维世纪）、DNA maker"DL2000）（康维世纪）、TAE缓冲液（康维世纪）、琼脂糖（Biowest）、漠化乙锭"EB）（Biotium）、营养肉汤（百思）、蒸蒸水等。

3方法
3.1液体培养基的配制
称取营养肉汤粉末9d加热溶解于500mL蒸水水中，1211高压灭菌15min,置于41冰箱中备用。

3.2细菌的接种与培养
3.2.1固体培养基中细菌的接种与培养穿山甲解剖后，用灭菌接种环粘取出血病变的小肠内容物直接接种到营养琼脂平皿内，置于371生化培养箱中培养。

3.2.2液体培养基中细菌的培养用灭菌接种环粘取出血病变的小肠内容物直接接种于营养肉汤中,置371恒温摇床中摇晃过夜。

3.3革兰氏染色
取洁净的载玻片，滴加1~2滴生理盐水于载玻片中央，用灭菌接种环挑取培养平板上菌落置于载玻片的生理盐水中，涂成直径为1厘米左右。

将涂片在酒精灯火焰上固定,低价结晶紫染色液染色lmin,水洗。

滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。

滴加95%酒精，约30s,水洗。

滴加沙黄复染液复染1min,水洗，干燥后镜检。

3.4引物设计与PCR扩增
利用细菌通用引物（上游引物338F：5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3；下游弓|物806R：5,GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3,[9]对细菌的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，扩增长度为468bp左右。

PCR反应条件：95l预变性3min;30个循环的程序:951变性30s,551退火30s,721延伸45s,最后721再延伸10min,41保存。

PCR反应体系50（L：如表1所示。

表1PCR反应体系
试剂体积"（L）2X Es Tap MasterMio25
上游引物338F1
下游引物806R1
菌液2
超纯水21
3.5PCR产物检测与测序
PCR产物用已加入EB的2%的琼脂糖凝胶于1xTAE缓冲液中电泳，电压100V,电泳时间约30min°电泳完成后用凝胶成像系统检测并拍照。

3.6序列的分析
送公司进行高通量测序后，人工校对测序结果，利用NCBI数据库对测序序列进行BLAST比对,根据比对结果分析细菌种类。

4结果
4.1细菌的培养
104广西畜牧兽医
2021 年 Vol. 37(3)
对死亡穿山甲解剖后发现，其肠道有出血症
状，对其肠道内容物进行细菌接种后培养。

观察接 种后的培养基，存在不同形态、大小及颜色的菌落。

说明穿山甲肠道中存在两种或两种以上的细菌。

4.2细菌的革兰氏染色
将细菌进行革兰氏染色后同样发现，穿山甲病
变肠道内容物接种后的菌液当中存在形态大小不
一的不同细菌。

更进一步说明穿山甲肠道中存在
两种或两种以上的细菌。

4- 3 细菌的16S rRNA PCR 扩增
细菌的16S rRNA 基因序列经PCR 扩增后，利
用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果扩增出目的
基因片段的电泳条带清晰，长度约为500bp °
4.4序列的分析
表2
16S rRNA 扩扩产物序列分析结果
将细菌的16S rRNA PCR 扩增产物进行高通
量测序后，利用NCBI 数据库的BLAST 检索进行同
源性分析。

分析结果如表2所示，共获得8个
OUTs ,有效序列77 441条，细菌分类为3门3纲5
目6科8属。

细菌中菌群含量从高到低分别为变 形菌门（82. 68% ）、厚壁菌门（17. 29% ）和拟杆菌
门（0.02%）。

这些菌群都可以分类到属，含量从
高到低分别为变形杆菌属"53. 46% ）、埃希氏菌属
-志贺氏菌属（28. 46% ）、肠球菌属（17. 22% ）、假 单胞菌属（0. 7% ）、普罗威登斯菌属（0. 07% ）、葡
萄球菌菌（0. 05% ）、拟杆菌属（0. 02% ）和乳杆菌
属（0.02%）。

其中有0.07%可以鉴别到种，分别 为产黑色素拟杆菌"0. 02%）和缓慢葡萄球菌
（0. 05%）0
OTU8 41 397
OTUS 序列
OTU119OTU222 043OTU353OTU4
539OTU5
35
OTU613 336OTU719分类
域-细菌;门-拟杆菌门;纲-拟杆菌纲；目-拟杆菌前科-拟杆菌科;属-拟杆菌属;种-拟杆菌 域-细菌+门-变形菌门;纲-变形菌纲；目-肠杆菌前科-肠杆菌科;属-埃希氏菌属-贺志菌属 域-细菌+门-变形菌门;纲-变形菌纲；目-肠杆菌前科-肠杆菌科;属-普罗威登斯菌属 域-细菌+门-变形菌门;纲-变形菌纲；目-假单胞菌前科-假单胞菌科;属-假单胞菌属
域-细菌+门-硬壁菌门;纲-杆菌纲;目-芽抱杆菌前科-葡萄球菌科;属-葡萄球菌属;种-缓慢葡 萄球菌
域-细菌;门-硬壁菌门;纲-杆菌纲;目-乳杆菌目；科-肠球菌科;属-肠球菌属 域-细菌+门-硬壁菌门;纲-杆菌纲;。

目-乳杆菌前科-乳杆菌科;属-乳酸菌属 域-细菌+门-变形菌门;纲-变形菌纲；目-肠杆菌前科-肠杆菌科;属-变形杆菌属
5讨论
穿山甲是哺乳动物纲中最小的类群之一，主要
分布于我国南部、尼泊尔和中南半岛等地。

由于穿
山甲具有极高的食用价值和药用价值，这些价值所
带来的巨大经济利益刺激人们疯狂捕杀穿山甲。

特别是近几十年来的乱捕滥猎和对栖息地的破坏,
使得该物种的种群数量急剧下降,直至枯竭的边
缘。

现今，野外已很难见到穿山甲的足迹。

2017 年2月，穿山甲已被列为一级保护动物。

穿山甲对 环境适应能力较差，对生态环境选择要求较高，属
狭食性动物，主要以白蚁为食，偶尔也会食用黑蚁
或蚁的幼虫和其他昆虫的幼虫。

目前，对穿山甲体内细菌的研究较少，已报道
的细菌主要有大肠杆菌、产气克雷伯（氏）杆菌、普
通变形杆菌、荧光假单胞菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、
粪链球菌和支原体属的一些细菌，而已报道的马来 穿山甲体内细菌就只有支原体属的一些细
菌叫⑵。

16S rRNA 基因是细菌上编码rRNA 相
对应的DNA 序列，普遍存在于细菌的基因组中。

16S rRNA 基因相对较短，约1 500bp ，具有10个保
守区和9个高变区，高变区和保守区交错排列，因 此通常在其保守区设计通用型引物［13］o 16SrRNA
基因序列在细菌分类学研究和分类识别中具有重
要作用，其在公共数据库中注册的基因序列正在大
量增加。

因此16S rRNA 基因是一种常用的识别 细菌的工具［14］。

本研究主要针对马来穿山甲病变肠道菌群进
行研究，利用PCR 扩增细菌的16S rRNA 基因片段 后测序，分析鉴定肠道中细菌的种类，进而了解实 验中穿山甲病变肠道内细菌的菌落构成，不仅有利
于认识穿山甲病变肠道的细菌组成和分析肠道疾 病，也为穿山甲的死亡分析提供科学性的诊断依 据，而且可以增强人们对穿山甲的保护意识，更为
穿山甲病变肠道菌群的的研究提供新的数据支持。

经接种后细菌培养及革兰氏染色结果显示，在
马来穿山甲病变肠道中存在两种或两种以上的细
菌。

为了进一步确定这些细菌的种类，我们对其进
行了 PCR 扩增并且且行高通量测序。

测序后后行
同样性分析，结果显示，马来穿山甲病变肠道细菌 的菌群按照属来分类可分为8个属,含量从高到低
分别为变形杆菌属（53.46%）、埃希氏菌属-志贺
氏菌属（28.46%）、肠球菌属（17.22%）、假单胞菌属（0.7%）、普罗威登斯菌属（0.07%）、葡萄球菌本（0.05%）$拟杆菌属（0.02%）和乳杆菌属（0.02%）。

乳杆菌属的细菌广泛分布在自然界中,是肠道益生菌中较常见的一种，一般不致病。

变性杆菌属、肠球菌属、假单胞菌属及普罗威登斯菌属的细菌一般为条件致病菌,在某种特定条件下可引起泌尿系统感染、创口感染，呼吸道、咽部、耳、眼部感染,坏死性肺炎及坏死性肠炎等[15]o埃希氏菌属的细菌一般为大肠杆菌，根据其致病因素可以导致各种疾病,包括主要的肠道疾病，例如新生儿腹泻、断奶后腹泻和水肿，也会引起全身感染,例如败血症、浆膜炎、乳腺炎、泌尿道感染等叫拟杆菌属的细菌正常栖息于任何动物的肠道、口腔、上呼吸道和生殖道中，属条件致病菌,若长期应用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，而使机体免疫功能紊乱或菌群失调时，能导致内内性感染[15]o葡萄球菌属的细菌多数为非致病菌，少数为致病菌,致病菌可引起肠毒素型食物中毒、疱疹性和剥脱性皮炎等。

而志贺氏菌属的细菌通称为痢疾杆菌,是一类肠道致病菌。

痢疾杆菌都具有强烈的内毒素，能破坏黏膜，形成炎症、溃汤，出现典型的脓血黏液便等症状M打
解剖死亡的马来穿山甲时发现其肠道严重出血,并伴有脓血便症状,结合细菌属性分析,可得出其死亡原因可能是因为感染了志贺氏菌属的细菌导致严重的肠道出血。

由于其他细菌在一定条件下也能引起一些肠道疾病,而未曾有针对穿山甲肠道微生物多样性的研究，因此还不能从细菌的种类和含量来更准确地分析其死亡原因。

经过本次实验我们可以分析出马来穿山甲可以感染志贺氏菌属的细菌,并可引起严重的肠道出血。

这是首次在马来穿山甲肠道中鉴定出有志贺氏菌属的感染，为穿山甲肠道疾病的诊断和治疗提供了数据支持，有利于我们针对此类细菌的感染做出相应的预防措施,尽量避免其他穿山甲的感染，为穿山甲的保护工作提供参考。

接下来我们将会对该肠道菌群进行分离培养，进行药敏试验,进而选择对该病症有效的药物进行治疗。

除此之外，我们也将对正常穿山甲肠道微生物的多样性进行研究，了解穿山甲肠道微生物的组成,争取为从肠道微生物来分析穿山甲的肠道疾病及其消化过程提供数据支持。

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（本栏责任编辑邹优敬）
表5中猪阶段试验各组发酵饲料占比#%）
组别对照组1组2组3组4组5组6组7组
发酵饲料比例040%40%40%40%20%(配方1#)60%(配方3#)20%(配方4#)
2试验结果
2.1小猪阶段试验结果
小猪阶段采食量和增重见表6。

表6小猪阶段各组日均采食量及全期头均增重（kg）
组别对照组发酵组1发酵组2发酵组3发酵组4
采食量11.812.39.09.510.07
增重8.8 1.780.4 1.420.8
表6说明:各组日均采食量差异不大,但各发酵组均增重远低于对照组。

2.2中猪阶段喂养结果
经过20日喂养，收集数据如表7。

从表7看,各组差异不大。

表7中猪阶段头均采食量及增重（kg）组别对照组
1组2组3组4组5组6组7组
采食量42.540.539.640.640.543.039.843.8增重23.020.821.619.621.022.119.922.2
3 试验结果分析
3.1小猪阶段
单从釆食量看虽然差异不大，但消化率差异却很大，各发酵饲料组腹泻较严重（腹泻等原因淘汰12头），说明小猪消化不了这类饲料。

从增重看,对照组的增重明显高于4个发酵料组。

因此得出结论，在小猪阶段（20kg〜30kg）不宜喂象草发酵料，原因在于小猪消化系发育尚未完善。

3.2中猪阶段
发酵饲料部分代替全价料喂养中猪，没有出现小猪阶段的消化不良、腹泻等状况，说明此阶段的猪已经适应了试验配方饲料的特性，采食量和增重没有很明显的差异。

3.3饲料成本
饲料成本比较（以添加40%发酵料计）,发酵饲料成本为每吨2700元，其中包含全价料的1 950元，象草发酵料部分成本为750元（包含象草收购加工发酵）；全价料成本为3250元，添加象草发酵料喂养,每吨成本减少550元，减少16.92%,经济效益明显。

4结论
本试验表明，中大猪消化系统生长发育已完成，已逐渐适应发酵饲料的特性。

从采食量、增重等指标上看，中大猪阶段用含不同比例象草的发酵饲料部分代替全价饲料喂养，是可行的，并可降低成本，经济效益明显。

（本栏责任编辑覃树华）
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