局部化脓实验设计

实验设计:局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选
小组成员：范子文孙琦黄必胜雍之瑶【实验病例】
❝刘正春，男，38岁，建筑工人，上班时被石头砸断了胳膊，由于长时间不接受正规治疗，他的胳膊上的伤口感染开始化脓，发热1天，伤口肿胀疼痛
❝体检：体温39℃，伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁
❝血象：血白细胞12x109/L，中性粒细胞80%，淋巴细胞28%。

要求：
1 脓汁标本病原菌的分离和鉴定；
2 选择敏感抗生素治疗
【实验目的】掌握病原菌的分离和鉴定，掌握化脓性细菌的主要特点
选择合理的敏感抗生素进行治疗
【设计思路】
球菌是细菌中的一个大类，根据格兰染色的不同，可分为革兰阳性和革兰阴性两类。

阳性：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌等
阴性：脑膜炎球菌、淋球菌等
病原性球菌中常引起人类化脓性疾病的细菌，又称为化脓性球菌。

上述细菌均为化脓性球菌，它们形态、培养上各有特点，可供鉴别。

所可能用到的检查方法：染色镜检、分离培养、生化反应、血清学实验、动物接种。

所以，我们小组的实验设计即围绕取样，检查，确定，选用抗生素治疗的主线流程，结合上述检查方法，最终确定出引起患者化脓的致病菌并治疗。

【初步观察】
在病例中，患者的明显体征为伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁，根据金黄色葡萄球菌的致病特点，在发生局部感染时，皮肤化脓感染的特点是脓汁粘稠，病灶局限，界限清楚。

其中患者黄色粘稠脓汁与此特征相符，初步怀疑为金黄色葡萄球菌，需要进一步检验。

肺炎球菌多导致呼吸道炎症，大叶性肺炎，与胳膊外伤无关，可排除。

肠球菌所致感染中常见的为心血管系统感染和尿路感染，可以排除。

脑膜炎球菌主要有呼吸道感染转变为菌血症或者败血症，可以排除。

淋球菌引起人类泌尿生殖系统急慢性化脓性感染，可以排除。

所以实验的目的为分辨引起患者伤口化脓的细菌是葡萄球菌还是链球菌，或者二者兼有。

【标本采集】
在本病例中，患者为伤口感染化脓，即开放性脓肿，所以我们采取标本的方法为：用无菌棉拭采取脓液及病灶深部分分泌物。

采集患者的血液标本，检测病人有无菌血症或者败血症。

关于标本采集的一些备注，参见附录
【染色镜检】
将浓汁直接涂片，用格兰染色观察细菌形态、排列及染色性，根据结果特点初步判断。

成单个、成双、四连体或短链排列可能为葡萄球菌属
革兰阳性
链状排列，短链状或双球状可能为链球菌属
由于成双或者成短链状排列为二者共有的排列特性，所以在这个步骤不能鉴别出病原菌。

【分离培养】
采集标本，使用三区划线法在普通平板和血琼脂平板上分别进行病原菌的分离培养，观察菌落特征。

在普通琼脂平板上形成直径约1~2mm的圆形，隆起，表面光滑，有光泽，边缘
整齐的菌落，可能会产生不同的颜色，如金黄色，白色或者柠檬色等，此菌落
即为葡萄球菌属菌落，致病性葡萄球菌可以在血琼脂平板上形成溶血环菌落
特性在血琼脂平板上形成灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5~0.75mm的细小菌落，可能会产生一定的溶血现象，则此菌落为链球菌属。

若两种菌落都有出现，那么病原菌即为混合菌。

【实验检测】
触酶试验
取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％H2O2 1滴，立即观察结果。

葡萄球菌属细菌为阳性，链球菌属细菌为阴性。

凝固酶实验
使用玻片法做凝固酶实验，若结果为阳性，则病原菌为致病性葡萄糖菌属。

甘露醇发酵试验
取可以菌落接种于甘露醇发酵管中，37℃破诶杨18~24h，金葡菌能分解甘露醇，产酸不产气。

【防治治疗】
一．若致病菌为葡萄球菌属，根据菌落颜色可以确定具体细菌，然后进行敏感性实验。

敏感性试验
1．扩散法琼脂加上细菌所需要的各种养料，将培养基融化后，倒入无菌培养皿中，冷却，凝成一个平面或叫平板（平皿），这时将含有少数细菌的菌液涂到平板上，培养后细菌就会分别在平皿上裂殖，如果在平皿的培养基内事先加入抗生素纸片，由于药物在培养基中扩散，起了抑（杀）菌作用，形成了不长菌落的抑制圈，抑制圈的大小，反映某一抗生素对该菌抑菌的程度，
2．稀释法常用药敏稀释法可分试管稀释法，琼脂稀释法两种：（1）试管稀释法先将测试抗菌药物作一系列倍比稀释，然后各试管加入适当稀释的试验菌液，摇匀，经培养后观察，以抗菌药物最小抑
菌浓度（MiC）管，即为试验菌株的敏感度，（2）琼脂稀释法将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基，接种测试菌于该培养基上，经培养后观察，被检菌生长情况，最低药物抑制细菌生长者，即最小抑菌浓度（Mic）， 3．自动分析法国内采用AUTOBAC仪器作细菌药敏测定，仪器由测定环药物低片，培养振荡机及光度计主机等来检定数据，按耐药，中等耐药，敏感，并把最小抑菌浓度都打印出来，该仪器仅适用于测定需氧菌及兼性厌氧菌，不适于专性厌氧菌及结核分枝杆菌的测试。

根据药物敏感性实验的结果，选用敏感抗生素，防止耐药菌株扩散。

二．若致病菌为链球菌属，可以根据溶血现象判断具体细菌。

治疗时青霉素G为首选药物。

三．若致病菌为二者混合菌，则采取综合治疗方法加以治疗。

【相关附录】
知识点
一）、创伤、组织和脓肿标本采集
1、对损伤范围较大的床上，应从不同部位采集多份标本，采集部位应首先清楚污物，以碘酒、究竟消毒皮肤，防止表面污染均混入标本影响检测结果。

2、开放性脓肿的采集，用无菌棉拭采取脓液及病灶深部分泌物。

3、封闭性脓肿，则以无菌干燥注射器穿刺抽取，疑为厌氧菌感染者，取脓液后立即排净注射器内的空气，针头插入无菌橡皮塞送检，否则标本接触空气导致厌氧菌死亡而降低临床分离率。

4、标本采取后应及时检查，如不能立即检验应置冰箱中保存，以防杂菌污染。

5、对可疑为败血症病人，按无菌操作采血5ml，立即注入葡萄糖肉汤培养基内增菌，12~18h后再做分离培养。

二）、肉眼观察
观察脓汁性状、色调、有无恶臭气味等，如脓汁带绿色是，可能又绿脓杆菌的感染，如有恶臭气味可能有厌氧菌感染。

三）、染色镜检
将脓汁直接涂片，用革兰染色观察细菌形态、排列及染色性，根据结果特点初步判断。

四）、分离培养和鉴定
根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初步诊断。

根据可疑菌生长特性，选择合适的培养基，提供合适的气体条件、温度和PH，根据细菌生化反应结果和血清学实验，对分离菌做出鉴定。

在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。

五）、可能涉及到的试验
1、血浆凝固酶试验
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可凝固新鲜的人血浆或兔血浆。

检测此种酶的试验，常用语鉴定葡萄球菌的致病力，以区别非致病性葡萄球菌。

（1）、玻片法
在载玻片对照侧滴盐水一滴，取葡萄球菌平板培养物放生理盐水中混成均匀菌液，在实验侧加入兔血浆一滴，去葡萄球菌平板培养物放兔血浆中用接种环混成均匀菌液，观察结果。

阴性对照中生理盐水应无凝集块出现，实验组中血浆中有明显小凝块为阳性结果，无凝块的胃阴性。

此法较简便，但不如试管法锐敏、准确。

（2）、试管法
吸取1:4稀释的兔血浆放于二支灭菌小试管中，每管0.5ml，用灭菌接种环沾取葡萄球菌培
养物一满环，在一小试管内壁徐徐研磨使成均匀玄烨。

另一试管作为对照，将二试管放在37℃的水域想中，每半小时观察一次结果，观察至4h，观察时试管倾斜，凡血浆呈现胶冻样凝集者即为阳性，仍呈液状者为阴性。

2、甘露醇发酵试验：取可以菌落接种于甘露醇发酵管中，37℃破诶杨18~24h，金葡菌能分解甘露醇，产酸不产气。

3、胆汁（胆盐）溶解试验
肺炎球菌能被胆汁或胆盐溶解，甲型溶血性链球菌则不能，故可用作二者的鉴别。

（1）、取灭菌小试管二支，每管加生理盐水0.9ml，用灭菌接种环沾取试验菌18~24h 培养物分别在两只小试管内支撑均匀玄烨，然后，其中一只加入10%脱氧胆酸钠溶液
0.1ml（或纯牛胆汁0.2ml），另一只再加生理盐水0.1ml作为对照。

（2）、摇匀，置37摄氏度水浴箱，10~15min观察结果，阴性对照管中仍为浑浊菌玄烨，若试验管便透明为阳性结果，判断为肺炎球菌，若试验管仍为浑浊悬液为阴性结果，判断为甲型溶血性链球菌。

六）细菌形态染色与培养
1.化脓性球菌的染色
葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑莫奈瑟菌、淋病奈瑟菌的形态均为球形，他们的排列情况为：葡萄球菌呈葡萄串状，链球菌呈链状，肺炎球菌、脑莫奈瑟菌和淋病奈瑟菌常成双排列。

格兰染色显示结果为：葡萄球菌、链球菌和肺炎球菌呈革兰阳性；脑莫奈瑟菌和淋病奈瑟菌呈革兰阴性。

2.葡萄球菌在普通琼脂平板上菌落特点
金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌为圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落，直径约1-2mm，能产生只溶性色素，分别为金黄色、白色和柠檬色。

3.不同球菌在平板上菌落的特点
仔细观察金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型链球菌和肺炎球菌菌落，主要观察其溶血性。

七）抗链球菌溶血素“O”快速胶乳试验（Anti-streptolysin，ASO test）
血清中ASO的测定，用于链球菌感染的诊断。

乙型溶血性链球菌能产生溶解人或家兔红细胞的溶血毒素“O”，它是一种含—SH基的蛋白质，不耐热、益易氧化，如与空气接触稍久，即失去溶血能力，在还原剂作用下，可重新恢复溶血能力。

溶血素“O”具有很强的抗原性，人感染乙型溶血性链球菌2-3周就能产生抗链球菌溶血素“O”抗体，次抗体可抑制溶血素“O”的活性，且病愈后数月至数年余才消失。

因此，推测病人血清中抗链球菌溶血素“O”的抗体增长情况，可对是否新进或反复受过乙型溶血性链球菌的感染作出判断，在临床上可作为风湿活动期、急性肾小球炎及风湿性关节炎的辅助诊断手段。

高滴度的病人血清被适量的溶血素中和了正常水平的抗体后还多余抗体，这些多余的抗体即与ASO胶乳试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒。

ASO胶乳试剂系聚苯乙烯胶乳与溶血素“O”工价交联的产物。