Smad7基因转染人胰腺癌细胞后uPA及PAI-1表达的变化

Smad7基因转染人胰腺癌细胞后uPA及PAI-1表达的变化恽栋;顾斌;李慧;于鸿
【摘要】目的: 通过对人胰腺癌细胞BxPC3转染Smad7基因,观察转染阳性细胞克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)表达的改变,进一步阐明Smad7在胰腺癌侵袭和转移中的作用.方法: 经脂质体介导将含有Smad7重组表达质粒转染BxPC3细胞,用G418筛选及RT-PCR、蛋白质印迹法鉴定;又分别采用RT-PCR与蛋白质印迹法检测转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1的表达.结果: 成功建立高表达Smad7的阳性BxPC3克隆(F-16、F-21),并证实其uPA、PAI-1 mRNA及蛋白表达均显著增加.结论: Smad7可能通过增强胰腺癌组织内uPA及PAI-1的生成而起到促进胰腺癌进展的作用.
【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(020)006
【总页数】5页(P492-495,506)
【关键词】胰腺癌;Smad7;尿激酶型纤溶酶原激活物;纤溶酶原激活物抑制因子-1【作者】恽栋;顾斌;李慧;于鸿
【作者单位】泰州市人民医院急诊科,江苏,泰州,225300;泰州市人民医院急诊科,江苏,泰州,225300;复旦大学上海医学院病理系,上海,200032;泰州市人民医院病理科,江苏,泰州,225300
【正文语种】中文
【中图分类】R730.23
胰腺癌是常见消化道恶性肿瘤，早期容易侵犯周围组织器官和发生远处转移，加以并无明显和特异的症状和体征，确诊时多属晚期，已失去根治手术机会，5年生存率＜5%，预后极差［1］。

因此，积极探索胰腺癌发病机制及其新的治疗方法是
目前亟待解决的重要课题。

大量实验研究表明，TGF-β/Samds信号传导通路的异常在胰腺癌的发生、发展过程中具有重要作用，有半数以上的胰腺癌有 TGF-
β/Samds信号通路异常，其发生机制主要包括Samds基因家族突变和表达异常，也涉及TGF-β超家族及其受体的改变［2］。

Smad7是Smads家族的抑制性成员，是相对分子质量为46 000的胞质内蛋白，编码基因位于人染色体的18q21.1，Smad7具有与其他Smads显著不同的 N端功能域，后者可能决定Smad7在细
胞内的分布，也可协助Smad7 MH2功能域与Tβ-R结合，从而更为有效地抑制TGF-β的信号转导［3］。

作为 TGF-β/S amds信号通路中负调控因子的Smad7
基因，目前对其在胰腺癌发生、发展中所起作用尚不清楚。

本实验采用细胞转基因技术，将重组Smad7 cDNA经脂质体介导转染人胰腺癌细胞系BxPC3，观察转
基因BxPC3克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子-1(plasminogen activator
inhibitor-1，PAI-1)基因的表达，以进一步了解Smad7在胰腺癌发病机制中的作用，为实施胰腺癌基因治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法
1.1 重组Smad7真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备
pcDNA3.0－Smad7由日本早稻田大学医学部Takeshi Imamuna博士提供，经
本实验室常规方法酶切鉴定［4］，送测序(联合基因公司)后大量扩增，以Qiagen 试剂盒(Gibco BRL公司)纯化。

1.2 Smad7基因转染入BxPC3及阳性细胞克隆的筛选
人胰腺癌BxPC3细胞系由复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科刘鲁明教授提供，
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco BRL公司)在37℃培养箱中培养。

实验用BxPC3为其第10代。

转染按照Lipofectin脂质体说明书进行。

为了筛选
稳定克隆，在转染后72 h采用G418(600 μg/ml，Gibco BRL公司)筛选3周，
然后以含300 μg/ml G418培养液进行维持培养。

1.3 含有Smad7基因BxPC3克隆的鉴定
1.3.1 RT-PCR法细胞消化，加入Trizol(Promega公司)，根据说明书提取总RNA。

逆转录反应采用以下步骤:5 μg RNA、Oligo dT 0.5 μl(50 mg/ml)、核糖
核酸酶抑制因子(RNAsi)0.5 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、MLV 逆转录酶2 μl，加水至总体积20 μl，37℃孵育60 min。

PCR反应采用以下步骤:94℃预变性
7 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。

然后
取10 μl的反应产物进行1.5%(W/V)的琼脂糖凝胶电泳。

扩增Smad7的引物，L:5'-CCCATCTTCATCAAGTCCG-3';R:5'-GCTGTAGGCTTTCTCATAGTCA-3'。

PCR 产物长度为335 bp。

扩增内参照GAPDH引物，L:5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';R:5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

PCR产物长度为450 bp。

1.3.2 蛋白质印迹法蛋白的提取按文献［5］所提供的方法进行。

20 μl蛋白样本
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用半干法转到硝酸纤维素膜上。

NC膜用含有5%奶粉的TBS封闭过夜，一抗37℃孵育1 h，TBS冲洗之后，辣根过氧化物酶标记
的二抗37℃封闭1 h，TBS洗涤之后DAB法显色，洗片。

一抗为兔抗人Smad7
多克隆抗体(1∶200稀释)，二抗为生物素化山羊抗兔抗体(1∶500，ABC试剂盒，Vector公司)。

1.4 RT-PCR法检测uPA及PAI-1 mRNA
总RNA抽提、逆转录反应及PCR反应条件同上述。

逆转录反应PCR引物如下:内
参照GAPDH同上。

uPA，L:5'-AATCGAACTGTGGCTGTC-3';R:5'-ATCCCTCTTTCTTCTCAAGG-3'，PCR 产物长度为406 bp。

PAI-1，L:5'-CCTCTCCGCCATCACCAACA-3';R:5'-TGTGCCGCTCTCGTTCACCT-3'，PCR 产物长度为261 bp。

分别设未转染组和
空载体转染组，与其作对比观察和分析。

1.5 蛋白质印迹法检测uPA及PAI-1蛋白
蛋白质印迹法方法同上述。

一抗为兔抗人uPA多克隆抗体(1∶200稀释)及兔抗人PAI-1多克隆抗体(1∶200稀释)，二抗为生物素化山羊抗兔(1∶500，ABC试剂盒，Vector公司)。

分别设未转染组和空载体转染组，与其作对比观察和分析。

1.6 定量和统计分析
用凝胶成像仪进行拍照记录，Kodak Digital Science 1D测定条带的积分光密度，经SPSS 13.0统计软件对数据进行标准差计算。

2 结果
2.1 转染Smad7的BxPC3鉴定
人重组pcDNA3.0－Smad7，测序结果显示，与基因库(GI:299890810)人
Smad7序列完全一致。

又经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定，证明Smad7基因已被正确地重组至pcDNA3.0载体中(图1)。

转染的BxPC3经G418筛选后，共获得56个克隆，经RT-PCR及蛋白质印迹检测，其中F-16与F-21
两克隆稳定高表达 Smad7。

F-16克隆Smad7 mRNA的表达比空载体组高约2.4倍，F-21克隆的表达水平大致与F-16克隆接近(图2);F-16克隆Smad7蛋白表达比空载体组高约2.6倍，F-21克隆的表达水平大致与F-16克隆接近，Smad7相
对分子质量为46 000(图3)。

图1 重组真核表达质粒pcDNA3.0-Smad7的鉴定结果Fig 1 Confirming of recombinant plasmid pcDNA3.0-Smad71:DNA标准参照物;2:pcDNA3.0-
Smad7经单酶切显示6.7 kb的条带;3:pcDNA3.0-Smad7经双酶切显示1.3 kb cDNA及5.4 kb质粒载体两条带
图2 RT-PCR检测Smad7 mRNA结果Fig 2 RT-PCR analysis for detecting Smad7 mRNA1:DNA标准参照物;2:未转染的BxPC3;3:转空载体Bx-PC3;4:F-16;5:F-21
图3 蛋白质印迹法检测Smad7蛋白的结果Fig 3 Western blot analysis for detecting Smad7 protein1:未转染的BxPC3;2:转空载体BxPC3;3:F-16;4:F-21 2.2 阳性BxPC3克隆uPA mRNA与蛋白表达的改变
RT-PCR结果显示，F-16与F-21细胞克隆uPA mRNA的表达均显著增加(图4)。

蛋白质印迹结果显示，其uPA蛋白表达比对照组高约2.3倍，uPA相对分子质量为50 000(图5)。

图4 RT-PCR检测uPA mRNA结果Fig 4 RT-PCR analysis for detecting uPA mRNA1:未转染的BxPC3;2:转空载体BxPC3;3:F-16;4:F-21;5:DNA标准参照物
图5 蛋白质印迹检测uPA蛋白的结果Fig 5 Western blot analysis for detecting uPA protein1:未转染的BxPC3;2:转空载体BxPC3;3:F-16;4:F-21
2.3 阳性BxPC3克隆PAI-1 mRNA与蛋白表达的改变
RT-PCR结果显示，F-16与F-21细胞克隆PAI-1 mRNA的表达均显著增加(图6)。

蛋白质印迹结果显示，其PAI-1蛋白表达比对照组高约2.1倍，PAI-1相对分子质量为45 000(图7)。

图6 RT-PCR检测PAI-1 mRNA结果Fig 6 RT-PCR analysis for detecting PAI-1 mRNA1:未转染的BxPC3;2:转空载体BxPC3;3:F-16;4:F-21;5:DNA标准参照物
图7 蛋白质印迹法检测PAI-1蛋白结果Fig 7 Western blot analysis for detecting PAI-1 protein1:未转染的BxPC3;2:转空载体BxPC3;3:F-16;4:F-21
3 讨论
TGF-β信号转导通路是由TGF-β超家族、TGF-β受体、Samds蛋白家族及其核
内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路，该转导通路的异常可使细胞逃避TGF-β介
导的生长抑制效应，导致多种肿瘤发生［6］。

作为Smads家族中的抑制性成员，Smad7不仅可阻断Smad2和Smad3与Ⅰ型Tβ-R的结合及其磷酸化，还可通过直接与活化的Tβ-R结合，而减少细胞膜上的Tβ-R的数量，以及与细胞内各转录
因子组氨酸去乙酰基酶结合，影响它们的乙酰化而抑制TGF-β的信号通路［7］。

近年来，Smad7基因在胰腺癌中的改变已引起了越来越多研究者的重视，尽管还没有发现Smad7的激活突变和基因扩增，但有研究表明，在胰腺癌中Smad7表达增高，并且转染了Smad7基因的胰腺癌细胞恶性度增高，裸鼠中成瘤能力增强，表明Smad7表达的异常将有助于肿瘤的发生、发展［8］。

Kuang等［9］通过
显微注射技术获得转Smad7基因小鼠，发现转基因小鼠胰腺的导管上皮发生了恶性转变，提示胰腺组织中Smad7的高表达通过抑制TGF-β信号通路，在胰腺癌
发生早期起着重要作用。

实验研究证实，肿瘤发生侵袭、转移与其自身分泌蛋白酶降解细胞外基质密切相关，其中纤溶酶及其抑制剂是参与肿瘤侵袭、转移的一个重要降解酶系统［10］。

uPA可通过多途径促进肿瘤侵袭转移［11］。

PAI-1是一种蛋白酶抑制物，可以
通过与uPA形成牢固的复合物进而抑制uPA的作用。

但一些研究结果显示，在乳腺癌和子宫内膜癌中uPA和PAI-1同步高表达与肿瘤的进展有关，提示PAI-1在肿瘤发生、发展过程中作用机制的复杂性［12］。

目前认为PAI-1促进肿瘤细胞
的侵袭和转移的作用机制是:①肿瘤组织中表达的PAI-1对肿瘤血管生成是必要的，PAI-1可能参与血管生成的调节;②PAI-1在肿瘤中的表达，可以防止肿瘤组织自身及基质的降解，起到保护肿瘤的作用［13］。

本研究进一步观察了Smad7对
uPA及PAI-1表达的影响，结果发现转染Smad7的BxPC3细胞克隆uPA及
PAI-1表达均显著增加，这表明，Smad7也介导了uPA/PAI-1系统的代谢过程，
同时我们认为Smad7可能通过增加胰腺癌组织内uPA及PAI-1的表达，进而促进胰腺癌的侵袭和转移。

然而大量研究表明，胰腺癌的发生、发展是一个极其复杂的过程，是多因素、多信号通路共同参与的结果，因此对于Smad7究竟是通过抑制TGF-β信号通路，还是直接参与核内转录过程，或两者兼而有之，抑或和其他信号通路间相互作用，还有待作进一步实验研究加以证实。

尽管对Smad7的作用机制还未阐明，但可以预见随着今后更多、更深入的实验研究，Smad7有可能成为新的基因治疗的靶点。

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