原核蛋白包涵体纯化

原核蛋白包涵体纯化
1、实验目的
原核重组蛋白中试包涵体纯化
2、实验准备
2.1实验材料:上一步收集的中试菌体。

2.2 试剂与耗材：NaCL（国药沪试10019318）），磷酸氢二钠（国药沪试20040718）；30%丙烯酰胺（华兴博创），SDS（Bomei LS0227），Glycine(Bomei GG0167),Tris(Bomei ST0497)，咪唑（国药沪试），尿素（国药沪试）
2.3 仪器与设备：海智城ZYW-2102C型双层摇床，15ml塑料离心管，Ultrasonic 超声仪，Thermo台式离心机miro 17R，伯乐蛋白电泳槽1658001，；北京六一DYY-6c电泳电源，镍亲和填料；
3.实验步骤
3.1菌体破碎菌体加入裂解液（每400ml培养体积对应菌体加30ml裂解液，如果菌体较多可以适当增加裂解液体积），将重悬菌体放置4℃冰箱等待超声，超声前加1% Triton。

3.2按超声仪使用说明超声重悬的菌体，如使用6号探头，设置功率为85%，超声3s，冷却6s，总时间25分钟即可。

超声时，要将装有菌体的离心管浸入冰中，并保证裂解样品温度在4℃左右。

3.3破碎菌液离心分上清沉淀，破碎完毕后，立即高速离心（15min,4℃，18000xg），然后去掉上清，保留沉淀待用。

3.4 再次加入裂解buffer重选沉淀，超声按照1% Triton加入，超声10分钟，如使用6号探头，设置功率为85%，超声3s，冷却6s。

二次超声完毕后，立即高速离心（15min,4℃，18000xg），然后去掉上清，保留沉淀待用。

3.5 加入2M Urea ,pH8.0，50mM tris wash buffer，重悬沉淀，超声3min，超声3s，冷却6s。

然后立即高速离心（15min,4℃，18000xg），然后去掉上清，保留沉淀待用。

3.6 加入50ml ddH2o,重选打散沉淀，超声3min，超声3s，冷却6s。

然后立即高速离心（15min,4℃，18000xg），然后去掉上清，保留沉淀待用。

3.7 加入10mL 8M urea ,pH8.0，50mM tris ，重悬沉淀，超声3min，超声3s，冷却6s。

然后立即高速离心（15min,4℃，18000xg），收集上清，去掉沉淀。

3.8包涵体蛋白电泳分析、反馈:准备好1.5mlEP管，每孔中加15ul 5Xloading buffer，然后依次取样本，取好后，100摄氏度煮样5min电泳分析。