盐酸林可霉素产生菌扩大培养工艺选择

盐酸林可霉素产生菌扩大培养工艺选择
张晓华;肖作为;陆广琴;焦志莎;黄绍国
【摘要】试验在单因素试验基础上,选取摇瓶间温度、湿度、摇床转速、培养时间为自变量,PH值、还原糖含量、氨基氮含量为比较对象,通过正交试验分析法,研究各自变量交互作用及其对种子发酵的影响;以镜检结果下,菌丝生长状况和菌浓为选育标准,确定盐酸林可霉素扩大培养的最佳工艺条件为:温度30℃,湿度45％～48％,摇床转速220 r/min,培养时间48h.
【期刊名称】《湖南中医药大学学报》
【年(卷),期】2013(033)010
【总页数】3页(P5-7)
【关键词】盐酸林可霉素;摇瓶间温度;湿度;摇床转速;培养时间;菌浓
【作者】张晓华;肖作为;陆广琴;焦志莎;黄绍国
【作者单位】湖南永州市中心医院,湖南永州425006;湖南永州市中心医院,湖南永州425006;湖南永州市中心医院,湖南永州425006;湖南永州市中心医院,湖南永州425006;湖南永州市中心医院,湖南永州425006
【正文语种】中文
【中图分类】R978.19
盐酸林可霉素又名洁霉素（L i n c o m y c i n Hydrochloride）为白色结晶性粉末；有微臭或特殊臭；味苦。

在水或甲醇中易溶，在乙醇中略溶[1]。

可治疗各种感染，属抑菌剂，是窄谱抗生素，作用机制与红霉素相似，主要抑制细菌细胞蛋白
质的合成，对革兰阳性球菌有较好作用，特别对厌气菌、金葡菌及肺炎球菌高效[2]。

在人体内分布广，可进入骨髓和骨组织，临床上广泛用于呼吸系统、骨髓炎
及软组织感染等病症的治疗，尤其适用于对青霉素过敏的病人[3]。

林可霉素的生物合成及代谢调节机制是极为复杂交错的生理生化现象[4]，工业化
生产主要是通过林可霉素产生菌好氧发酵制取[5]。

本文则通过正交试验，分析盐
酸林可霉素产生菌扩大培养的最佳工艺。

1.1 主要原料与试剂
1.1.1 实验原料菌种LA02，由南阳化工厂中心实验室提供[6]；玉米浆，由华北制药康欣有限公司提供；自制豆饼粉，过80目筛。

1.1.2 实验试剂玉米淀粉，由河南巨龙淀粉实业有限公司提供；葡萄糖，由天津市科密欧化学试剂有限公司提供；硫酸铵，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；碳酸钙，为南阳市蒲山化工厂提供；琼脂，北京奥博星有限公司提供。

1.2 实验仪器与设备
托盘天平，深圳市瑞鑫达仪器有限公司；旋转摇瓶机XDW 50/50，乐山三九长征药业股份有限公司；高压灭菌锅F01-01-181，上海坤肯生物化工有限公司；净化台(F01-01-141)SW-CJ-1CU，深圳市瑞鑫达仪器有限公司；恒温恒湿机HS-
125DBD系列，无锡海力斯环境设备有限公司；美德时温湿度表：TH602F，加升环球实业有限公司；电热恒温鼓风干燥箱-DHG-9070A，杭州汇尔仪器有限公司；普通温度计；容声电冰箱。

1.3 实验方法
1.3.1 斜面培养基制备流程投料→配置斜面培养基→灭菌→接种→培养
1.3.2 母瓶培养基制作流程配料→配置母瓶培养基→灭菌→接种→培养→并瓶
1.3.3 母瓶培养基PH调控母瓶培养基的PH是通过碳酸钙和NaOH控制的，将
按配方称量好的各营养组分用饮用水进行糊化，微沸调碱至PH6.60,加入已称量好
的16 g碳酸钙进行高压灭菌。

检测消后各项指标[7]。

接种后，将本批母瓶置于摇瓶间发酵培养两天后，与母移各检测指标进行对比，并通过显微镜观察菌丝生长状况，以菌丝伸展年轻有力为宜[8]。

1.3.4 母瓶发酵环境的单因子试验
（1）摇瓶间温度控制试验：将摇瓶间的温度分别调至25℃，30℃，35℃。

摇瓶
发酵后对母移指标进行比较，观察菌丝生长状况，确定最佳培养温度。

（2）摇瓶间湿度控制试验：将摇瓶间的湿度分别调至40%，45%，50%。

摇瓶
发酵后对母移指标进行比较，观察菌丝生长状况，确定最佳摇瓶间湿度。

（3）摇床旋转速度调控试验：将摇床的转速分别调至180 r/min，220 r/min，260 r/min。

摇瓶发酵后对母移指标进行比较，观察菌丝生长状况，确定最佳转速。

（4）摇瓶时间的确定：接种后的母瓶置于摇瓶间44 h，48 h，52 h分别摘取3
支母瓶进行各项指标检测，同时进行镜检，观察菌丝生长状况，确定最佳摇瓶时间。

1.3.5 种子发酵培养环境的工艺确定
1.4 发酵培养结果检测方法
发酵效价：藤黄八叠球菌28001为检定菌的生物效价测定[9]。

氨氮：甲醛测定法[10]。

还原糖：斐林氏滴定法[11]。

菌丝浓度：准确吸取10 mL培养液，3000 r/ min，离心5 min，测上清液体积V，根据（10-V）/10×100%求得菌丝浓度[12]。

菌丝形态：显微镜观察。

2.1 摇瓶间温度对发酵种子菌丝生长的影响
母瓶培养基接种后置于摇瓶间的培养温度对种子生长状况有显著影响。

温度过低或过高，都不利于种子发酵，表现在培养基中营养素的变化及菌丝的伸展形态上。

把接种后的母瓶置于不同温度的培养间，48 h后从摇床上摘下种子进行各指标检验，
见图1。

不同温度控制下菌丝生长状况镜检菌丝描述如下：25 ℃温度控制下菌丝黄褐色，
着色兰，颗粒稍细，挂瓶度一般，部分实团，颗粒不明显，偏年轻。

30 ℃温度控
制下菌丝着色深蓝，颗粒细，挂瓶度高，稍粘稠，实团粗壮，边缘伸展有力。

35℃温度控制下黄褐色，菌丝大团网，边缘束状散开，体不实，多空泡，模糊，菌丝偏老。

结果表明，接种后摇瓶发酵最适温度为30 ℃。

当温度较低时，种子发酵过程生长缓慢，菌丝偏年轻；总糖及氨基氮利用率不高；没有达到理想状况。

而温度较高时，种子发酵速度快，营养成分消耗快，影响种子中后期发酵，菌丝较老，伸展力度不高。

2.2 摇瓶间湿度对发酵种子菌丝生长的影响
母瓶培养基接种后置于摇瓶间的培养湿度对种子生长状况也有较大影响。

湿度过低或过高，都会影响培养基中水分蒸发，进而影响营养成分的含水量，不利于种子发酵，表现在培养基中营养素的变化及菌丝的伸展形态上。

因此把接种后的母瓶置于不同温度的培养间，48 h后从摇床上摘下种子进行各指标检验，结果绘成柱状图，见图2。

不同湿度控制下观察菌丝生长状况，镜检拍照形态描述如下：40%湿度控制下菌
丝颗粒稍细，呈现黄褐色，着色兰，挂瓶度一般，部分实团，边缘伸展粗壮。

45%湿度控制下菌丝颗粒细，挂瓶度高，稍粘稠，粗壮，着色深蓝，实团，边缘伸展有力。

50%湿度控制下，菌丝黄褐色，菌丝大团网，边缘束状散开，挂瓶度适中，着色兰，边缘伸展。

结果显示，湿度在45%左右对菌丝生长无明显影响。

种子消耗培
养基中的碳源和氮源进行发酵，菌丝伸展粗壮有力。

摇瓶间的湿度应控制在45%～48%。

2.3 摇床转速对发酵种子菌丝生长的影响
摇床转速影响到培养基中的空气流动，则会影响母瓶中含氧量，盐酸林可霉素的生产是通过林可霉素产生菌好氧发酵生产。

本实验控制摇床转速分别为180 r/min，220 r/min，260 r/min，48 h后检测到母移指标，对比结果见图3。

不同转速控制下菌丝生长状况镜检结果描述如下：摇床转速为180 r/min时，菌
丝颗粒稍细，挂瓶度较低，黄褐色，着色兰，部分实团有空泡，边缘伸展纤弱。

控制转速为220 r/min时，菌丝颗粒细挂瓶度高，稍粘稠，着色深蓝，实团，边缘
伸展粗壮有力。

转速为260 r/min时，菌丝黄褐色，菌丝大团网，边缘束状散开，挂瓶度适中，着色兰，边缘伸展粗壮。

由此可知，转速过高，氧气含量高时，种子发酵速度快，菌丝生长有偏老迹象；而转速较慢时，含氧量低不利于发酵过程的进行。

因而，摇床转速控制在220 r/min 为宜。

2.4 培养时间对发酵种子菌丝生长的影响
为研究不同的发酵时间对产品品质的影响，本试验将接种后的母瓶培养基在30 ℃的温度下摇瓶培养44 h、48 h、52 h，定时摘取母瓶进行指标检测，将结果绘图，见图4。

不同培养时间条件下菌丝生长状况镜检描述如下：培养44 h后，镜检菌丝颗粒稍细，挂瓶度较低，黄褐色，着色兰，部分成实团，边缘伸展有力。

48 h时，菌丝
颗粒细，挂瓶度高，稍粘稠，着色深蓝，实团，边缘伸展粗壮有力。

52 h时，菌
丝黄褐色，菌丝大团网，边缘束状散开，挂瓶度适中，着色兰，边缘伸展粗壮，菌丝偏老。

从表中检测结果可比较得出，摇瓶时间为48 h较为合适，时间过长，菌丝生长较老，不利于接入小罐继续生长。

2.5 种子发酵培养环境条件正交试验分析结果
种子接正常量母瓶，按不同工艺培养后从摇床上取下检测平均效价和菌丝浓度见表
3。

由表中的极差分析可知,对林可霉素产生菌LA02发酵水平的影响主次顺序为B＞D ＞A＞C，其中B、A、D对发酵水平具有显著性影响，C无显著性影响。

经正交方差分析得出最佳配比A2B2C3D1。

对九组实验分别取样涂片，镜检结果见表4。

镜检观察结果与正交试验基本一致，从而可确定母瓶培养基最佳配比方案为：摇瓶间温度30℃，湿度45%，摇床转速220 r/min，培养48 h。

此时的平均效价最高，菌丝生长状态较为理想，与直观最佳配比A2B3C3D1基本一致。

种子接入小罐后有更顽强的生命力，产量更高。

【相关文献】
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[2] 张骁,束梅英.林可霉素产销现状及展望[J].中国药房,1995,6(6):5.
[3] 吴为忠.盐酸克林霉素合成工艺[J].中医药工业杂志,1997,28(8):352-353.
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