异迷迭香酸苷介导乳腺癌细胞凋亡的作用及机制

异迷迭香酸苷介导乳腺癌细胞凋亡的作用及机制
吴元肇;曾勇;郑克思;吴林斌
【摘要】目的:研究异迷迭香酸苷介导乳腺癌细胞凋亡的作用及机制.方法:体外培
养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,在培养液中加入不同浓度异迷迭香酸苷(0.1、1、10μmol/L)进行干预.MTT法检测细胞增殖率,AO/EB法观察细胞凋亡情
况,Western blotting分析内质网应激通路及凋亡相关蛋白表达.结果:异迷迭香酸
苷浓度为0.1、1、10μmol/L时,细胞增殖率分别为(81.56±6.76)％、
(69.33±6.40)％、(44.54±7.37)％,较空白对照组[(100.00±7.69)％]降低
(P<0.05,P<0.01);细胞凋亡比例分别为(155.67±14.38)％、(183.14±15.18)％、(224.52±17.26)％,较空白对照组[(100.00±16.54)％]增加
(P<0.05,P<0.01);GRP78表达量分别为(1.78±0.16)、(1.83±0.27)、(2.52±0.25),较空白对照组(1.00±0.12)增加(P<0.05,P<0.01);ATF4表达量分别为(1.67±0.15)、(1.69±0.08)、(2.21±0.29),较空白对照组(1.00±0.05)增加
(P<0.05,P<0.01);CHOP表达量分别为(1.12±0.07)、(1.23±0.07)、(2.06±0.20),
较空白对照组(1.00±0.07)增加(P<0.05,P<0.01);p-PERK表达量分别为
(1.14±0.07)、(1.18±0.13)、(1.42±0.10),较空白对照组(1.00±0.04)增加
(P<0.05);p-eIF2α表达量分别为(1.54±0.02)、(1.65±0.12)、(1.67±0.17),较空白对照组(1.00±0.18)增加(P<0.05,P<0.01);c-caspase3表达量分别为(1.30±0.14)、(1.51±0.22)、(2.01±0.18),较空白对照组(1.00±0.17)增加(P<0.05,P<0.01);Bcl-
2/Bax表达量分别为(0.80±0.06)、(0.74±0.10)、(0.42±0.08),较空白对照组
(1.00±0.10)降低(P<0.05,P<0.01).结论:异迷迭香酸苷可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,其机制包括上调GRP78/CHOP信号通路和干扰Bcl2/Bax平衡两方面,从而激活内质网应激反应,诱发细胞凋亡.
【期刊名称】《中国中西医结合外科杂志》
【年(卷),期】2018(024)006
【总页数】5页(P749-753)
【关键词】异迷迭香酸苷;乳腺癌;细胞内葡萄糖调节蛋白/C/EBP同源蛋白信号通路;内质网应激;凋亡
【作者】吴元肇;曾勇;郑克思;吴林斌
【作者单位】浙江省温州市人民医院肿瘤外科温州 325035;浙江省温州市人民医院肿瘤外科温州 325035;浙江省温州市人民医院肿瘤外科温州 325035;浙江省温州市人民医院肿瘤外科温州 325035
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌数量占女性肿瘤的29%，致死率高达15%[1]。

中国地区每年新发乳腺癌人口占比上升显著，城市发病率高于农村地区，且出现年轻化发展势态。

目前临床治疗主要以化疗、放疗为主，虽可有效改善生存时间与生活质量，但其死亡率在众多癌症中仍高居不下[2]。

传统中药具有历史悠久、疗效优及毒副弱等优势，在肿瘤治疗方面取得了明显进展[3-4]。

夏枯草( prunella vulgaris labiatae)属唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有清肝泻火、明目、软坚散结等功效，常用于目赤肿痛、肉痛眩晕、乳痈或乳癖等治疗[5]。

已有临床观察与实验研究表明，夏枯草具有良好的抗肿瘤活性[6-7]。

异迷迭香酸苷是夏枯草中重要的酚酸类化合物，具有良好的抗氧化活性[8]，但异迷迭香酸苷作为重要的潜在质控成分[9]是否参与夏枯草抗
乳腺癌作用尚不清楚。

本实验拟围绕抗增殖、促凋亡等途径，从分子水平考察异迷迭香酸苷干预乳腺癌的作用与机制。

1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂异迷迭香酸苷（Y-089-161230），成都瑞芬思生物科技有限公司提供；胎牛血清，购自美国Gemini公司；MTT、二甲亚砜，购自美国Sigma Aldrich公司；AO/EB试剂盒与BCA蛋白定量试剂盒，购自南京碧云天生物技术研究所；ECL化学发光液，购自美国GE公司；细胞内葡萄糖调节蛋白(glucoseregulated protein, GRP78)、转录激活因子(activating transcription factor 4, ATF4)、C/EBP 同源蛋白 (C/EBP-homologous protein, CHOP)、Bcl-
2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha,eIF2α)、p-eIF2α、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase3)、c-caspase3、B细胞淋巴瘤因子
2(B-cell lymphoma 2, Bcl2)抗体，购自美国CST公司；β-Tubulin、二抗，购自南京巴傲得生物科技有限公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 细胞培养与传代人乳腺癌细胞株 MDAMB-231，购自上海中科院细胞库。

取人乳腺癌细胞，采用RPMI1640（10% FBS+1% P/S）进行重悬，放置在37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养。

隔天待细胞贴壁融合，以1：2的比例进行传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖率取对数生长期MDA-MB-231细胞，加入RPMI1640重悬稀释至5×104个/mL接种于96孔培养板，每孔100μL，培养24 h。

待细胞贴壁，每孔加入异迷迭香酸苷（0.01、0.1、1μmol/L）进行孵育。

继续培养24 h，根据MTT法检测细胞活性。

每组设置6复孔，实验重复3次。

1.4 AO/EB法观测细胞凋亡取对数生长期MDA-MB-231细胞，加入RPMI1640重悬稀释至1×105个/mL接种于含无菌玻片的24孔板。

培养24 h，待细胞贴壁，
每孔加入异迷迭香酸苷（0.01、0.1、1 μmol/L）进行孵育。

继续培养24 h，取
出玻片并覆盖AO/EB 混合液4μL，置荧光显微镜下进行形态学观察。

每组设置3
复孔，实验重复3次。

1.5 Western blotting检测内质网应激通路及凋亡相关蛋白表达取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于6孔板内，加入不同浓度异迷迭香酸苷进行干预。

处
理后收集细胞裂解液，进行BCA蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。

浸于
5%BSA封闭，分别用GRP78、ATF4、CHOP、Bax、PERK、p-PERK、eIF2α、
p-eIF2α、caspase3、c-caspase3及Bcl2一抗过夜孵育（1:2000，4℃）。

次日漂洗，加入二抗孵育30min（1:5000，常温）。

再漂洗，ECL化学发光、显影。

ImageQuant软件扫描并分析相应灰度值，检测需重复3次。

1.6 统计学分析运用 SPSS17.0 统计软件对数据进行分析，计量资料先采用Shapiro-Wilk检验判断数据是否为正态分布，所有数据均呈正态分布且方差齐性，以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P ＜ 0.05 为差异有
统计学意义。

2 结果
2.1 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞增殖的影响检测细胞增殖率发现，与空白对照组（100.00±7.69）%比较，异迷迭香酸苷0.1μmol/L组（81.56±6.76）%、
1μmol/L组（69.33±6.40）%及10 μmol/L组（44.54±7.37）%细胞增殖率均
得到有效抑制（P＜0.05，P＜0.01）。

在各给药组中，以10 μmol/L异迷迭香酸苷作用最强。

见图1。

图1 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231增殖率的影响（, n=6）注：与空白组比较，aP＜0.05, aaP＜0.01
图2 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231凋亡的影响（, n=3）注：与空白组比较，aP ＜0.05, aaP＜0.01
2.2 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞凋亡的影响 AO/EB法观察结果表明，异迷迭香酸
苷干预可明显促进细胞凋亡。

计算凋亡率发现，异迷迭香酸苷0.1μmol/L组（155.67±14.38）%、1μmol/L组（183.14±15.18）% 及10μmol/L组（224.52±17.26）%，与空白对照组（100.00±16.54）%比较增加明显。

当异迷迭香酸苷浓度为0.1 μmol/L和1 μmol/L时，视野中出现橘黄色荧光，表明细胞
受到损伤。

当浓度提高至10 μmol/L时，视野中橘黄色荧光更为明显，提示细胞
损伤情况严重。

由此可知，异迷迭香酸苷可加剧乳腺癌细胞凋亡，且呈浓度依赖性。

见图2。

2.3 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞中GRP78/CHOP信号通路的调控作用Western bloting结果显示，异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，
GRP78 表达量分别为（1.78±0.16）、（1.83±0.27）、（2.52±0.25），较空白对照组（1.00±0.12）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，ATF4表达量分别为（1.67±0.15）、（1.69±0.08）、
（2.215±0.29），较空白对照组（1.00±0.05）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，CHOP表达量分别为
（1.12±0.07）、（1.23±0.07）、（2.06±0.20），较空白对照组（1.00±0.07）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，p-PERK表达量分别为（1.14±0.07）、（1.18±0.13）、（1.42±0.10），较空白
对照组（1.00±0.04）增加（P＜0.05）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10
μmol/L时，p-eIF2α表达量分别为（1.54±0.02）、（1.65±0.12）、
（1.67±0.17），较空白对照组（1.00±0.18）增加（P＜0.05，P＜0.01）。

由此可知，异迷迭香酸苷可激活GRP78/CHOP信号通路，加剧内质网应激反应。

见图3。

图3 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231中GRP78/CHOP相关蛋白表达的影响（,
n=3）注：与空白组比较，aP＜0.05, aaP＜0.01
2.4 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白的调控作用 Western bloting结果显示，异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，c-caspase3表达量分别为（1.30±0.14）、（1.51±0.22）、（2.01±0.18），较空白对照组（1.00±0.17）增加（P＜0.05，P＜0.01）；迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，Bcl-
2/Bax 表达量分别为（0.80±0.06）、（0.74±0.10）、（0.42±0.08），较空白对照组（1.00±0.10）降低（P＜0.05，P＜0.01）。

由此可知，不同浓度异迷迭香酸苷均可有效促进乳腺癌细胞的凋亡。

见图4。

图4 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231中c-caspase3、Bcl-2及Bax表达的影响（, n=3）注：与空白组比较，aP＜0.05, aaP＜0.01
3 讨论
乳腺癌属中医“乳岩”范畴。

宋代《妇人良方大全》指出：“起初内结小核，或如鳖棋子，不赤不痛……此属肝脾郁怒，气血亏虚”。

因此，中医临床常采用疏肝解郁、清热解毒等法则进行治疗[10]。

中药夏枯草具有清肝明目、软坚散结等功效[5]，经临床组方后常用于乳腺癌的治疗。

其成分主要包含三萜、甾体、黄酮、香豆素和有机酸等[11]，并可通过磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶、核转录因子κB等信号通路发挥抗肿瘤活性[12]。

异迷迭香酸苷是夏枯草中重要成分之一，其药理活性有待深入挖掘。

本实验拟体外培养人乳腺癌细胞，并给予不同浓度异迷迭香酸苷进行干预，从而探讨该成分如何介导信号传导发挥抗乳腺癌的作用。

细胞凋亡是机体清除异常细胞的关键途径，多数肿瘤的发生与细胞凋亡受阻有关，因此诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略之一[13]。

内质网广泛存在真核生物细胞中，是主要的蛋白质合成折叠场所，参与细胞凋亡进程，且该机制不同于死亡受体与线粒体凋亡途径[14-15]。

当体内出现低糖、缺氧、钙平衡失调或氧化应激等情况时，均可导致大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白积累，继而诱发内质网应激
（endoplasmic reticulum stress，ERS），而GRP78作为ERS分子标志物也随之高表达。

在长期ERS刺激作用下，PERK与GRP78发生解离并活化，通过激活eIF2α促进ATF4进行转录，最终上调细胞内CHOP的表达水平[16]，这将意味着ERS反应已切入亢进状态。

因此，激活GRP78/CHOP信号通路可加剧内质网应激，促进乳腺癌细胞凋亡。

本实验结果表明，异迷迭香酸苷可有效增加GRP78、ATF4、CHOP表达，激活PERK、eIF2α。

提示异迷迭香酸苷通过激活
GRP78/CHOP信号通路，加剧乳腺癌内质网应激反应，促进细胞凋亡，从而发挥其抗乳腺癌作用。

CHOP 作为ERS中间信号调控点，参与细胞凋亡调控。

以往研究发现，CHOP可减少Bcl-2表达，使Bax从从胞浆向线粒体易位，继而加剧caspase3的活化过程[17-18]。

caspase-3处于蛋白酶级联反应的核心位置，可通过水解多种负责细胞生化和形态学改变的底物，最终导致细胞凋亡、损伤[19]。

本实验结果提示，异迷迭香酸苷可明显促进Bax、c-caspase3表达，减少细胞内Bcl2水平，加速乳腺癌细胞凋亡，并可有效抑制其生长活力。

异迷迭香酸苷可通过激活GRP78/CHOP信号通路，加剧内质网应激反应，促进乳腺癌细胞凋亡，从而发挥其抗乳腺癌活性。

本实验研究为乳腺癌的治疗提供了潜在策略，同时为中药夏枯草抗乳腺癌的临床应用补充科学依据。

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