第三章-细胞生物学研究方法【可编辑的PPT文档】
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
制备程序：
取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片 染色 观察
取材与固定
常用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等
单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常 需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和 四氧化锇双重固定。
戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快， 不但能固定蛋白，还能固定糖类特别是糖原。 一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类 的固定作用不强，样品仅用戊二醛固定后， 其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。
3、激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理
物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共 聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物 镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样
品一般经免疫荧光标 记）经透镜汇聚成像， 被检测器检出。通过 样品其他部位的激光 即激光发出的荧光不 会聚焦成像，因而检 测器不能检出。
电磁透镜
要求真空 利用样品对电子的
（1.33x10-5～ 散射和透射形成明 1.33x10-3Pa） 暗反差
（3）透射电镜主要制样样本内部超微结构。
电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切片， 样品须先制备超薄切片。
超薄切片厚度：50～100nm
家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径20nm) （陈立华、翟中和）
制备过程简单，只需将样品制成悬液， 直接滴于载网上，然后用重金属物质染 液染色。即可在EM下观察。
重金属物质散射电子的能力较样品本身 强，电镜下两者显示出明显的明暗对比， 样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色， 这样样品表面的微细结构就被衬托出来。
常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液
电镜观察
大鼠骨髓干细胞的超薄切片 （引自G.M.Wright et al）
2）负染色技术
（Negative staining）
染色背景，衬托出样品的精细结构。
Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.
扫描电镜（Scanning electron microscope，
SEM）
1、透射电镜 （TEM） （1）透射电镜基本构造
（2）电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领
200nm LM
100nm
光源 可见光 紫外光
TEM 0.1nm
电子束
透镜
真空
成像原理
玻璃透镜 玻璃透镜
不要求真空 不要求真空
利用样品对光的吸 收形成明暗反差和 颜色变化
Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
常用染色剂：2％磷 钨酸水溶液
第三章 细胞生物学 研究方法
本章学习要求
概要了解细胞生物学常用研究方法， 包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分 析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微 操作技术等。
本章主要教学内容
细胞形态结构观察方法 细胞组分分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操
作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy)
四氧化锇：是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反 应，是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后 的脱水过程中可被还原形成锇黑，使样品反 差增强。但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和 抗原活性破坏较大。
脱水 固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或
丙酮进行脱水。
包埋 脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定
的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄 切片，并使切片能承受电子束轰击。
肉眼的分辨率：0.2mm； 光镜分辨率： 0.2um； EM分辨率可达到0.2nm
1m=103mm=106um=109nm
1、普通光学显微镜技术
分辨率 区分开两个质点间的最小距离。
光镜样本制作：样品经过固定剂（如甲醛等） 固定后包埋到包埋剂（如石蜡等）中，之后切成 5um的薄片进行观察。观察前一般要染色，如伊红 和美蓝能特异结合蛋白质，使蛋白质显色；品红特 异显示DNA所在部位。
2、荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术
应用：在光镜水平用于特异蛋白质等生 物大分子的定性定位。
如: 将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注 射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白 分子组装成肌动蛋白纤维。
将可产生荧光的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein ，GFP）基因与某 种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋 白的细胞中，便可直接观察到该蛋白 的动态变化。
常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等
环氧树脂：国产618环氧树脂、Epon812等
丙烯酸树脂：有LR White、LR Gold、 Lowi-crvls等
切片 包埋好的组织块需在超薄切片机上用 玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。
超薄切片一般收集在金属载网上进行 观察。常用铜网为200～400目，此外 根据不同的实验要求还可选用金网、 镍网等。
载网上一般包被一层支持膜，以支撑 载网上的超薄切片，增加其稳定性。 最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲 醛)、火棉胶、碳等。
染色与观察
生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组 成的，这些元素的原子序数低，散射电子的 能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通 常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行 染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和 力不同，因此染色后不同结构对电子的散射 能力亦不同，从而增强了细胞结构的反差。
应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强图像反 差 和 提 高 分 辨 率 (1.4—1.7 倍 ) ， 可 重 构 样品的三维结构。
二、 电子显微镜技术
透射电镜（TEM） 透射电镜的基本构造 透射电镜主要制样技术
1) 超薄切片技术 2) 负染色技术 3) 冰冻蚀刻技术 4) 真空喷镀技术 5) 电镜三维重构技术
取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片 染色 观察
取材与固定
常用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等
单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常 需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和 四氧化锇双重固定。
戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快， 不但能固定蛋白，还能固定糖类特别是糖原。 一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类 的固定作用不强，样品仅用戊二醛固定后， 其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。
3、激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理
物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共 聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物 镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样
品一般经免疫荧光标 记）经透镜汇聚成像， 被检测器检出。通过 样品其他部位的激光 即激光发出的荧光不 会聚焦成像，因而检 测器不能检出。
电磁透镜
要求真空 利用样品对电子的
（1.33x10-5～ 散射和透射形成明 1.33x10-3Pa） 暗反差
（3）透射电镜主要制样样本内部超微结构。
电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切片， 样品须先制备超薄切片。
超薄切片厚度：50～100nm
家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径20nm) （陈立华、翟中和）
制备过程简单，只需将样品制成悬液， 直接滴于载网上，然后用重金属物质染 液染色。即可在EM下观察。
重金属物质散射电子的能力较样品本身 强，电镜下两者显示出明显的明暗对比， 样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色， 这样样品表面的微细结构就被衬托出来。
常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液
电镜观察
大鼠骨髓干细胞的超薄切片 （引自G.M.Wright et al）
2）负染色技术
（Negative staining）
染色背景，衬托出样品的精细结构。
Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.
扫描电镜（Scanning electron microscope，
SEM）
1、透射电镜 （TEM） （1）透射电镜基本构造
（2）电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领
200nm LM
100nm
光源 可见光 紫外光
TEM 0.1nm
电子束
透镜
真空
成像原理
玻璃透镜 玻璃透镜
不要求真空 不要求真空
利用样品对光的吸 收形成明暗反差和 颜色变化
Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).
常用染色剂：2％磷 钨酸水溶液
第三章 细胞生物学 研究方法
本章学习要求
概要了解细胞生物学常用研究方法， 包括细胞形态结构观察方法、细胞组分分 析方法、细胞培养方法、细胞工程与显微 操作技术等。
本章主要教学内容
细胞形态结构观察方法 细胞组分分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操
作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy)
四氧化锇：是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反 应，是膜结构最佳固定剂。四氧化锇在随后 的脱水过程中可被还原形成锇黑，使样品反 差增强。但四氧化锇渗透缓慢，对酶活性和 抗原活性破坏较大。
脱水 固定好的样品一般要经过浓度递增的乙醇或
丙酮进行脱水。
包埋 脱水后将样品包埋在树脂中，使之获得一定
的硬度、弹性和韧度，这样才易于切成超薄 切片，并使切片能承受电子束轰击。
肉眼的分辨率：0.2mm； 光镜分辨率： 0.2um； EM分辨率可达到0.2nm
1m=103mm=106um=109nm
1、普通光学显微镜技术
分辨率 区分开两个质点间的最小距离。
光镜样本制作：样品经过固定剂（如甲醛等） 固定后包埋到包埋剂（如石蜡等）中，之后切成 5um的薄片进行观察。观察前一般要染色，如伊红 和美蓝能特异结合蛋白质，使蛋白质显色；品红特 异显示DNA所在部位。
2、荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术
应用：在光镜水平用于特异蛋白质等生 物大分子的定性定位。
如: 将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注 射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白 分子组装成肌动蛋白纤维。
将可产生荧光的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein ，GFP）基因与某 种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋 白的细胞中，便可直接观察到该蛋白 的动态变化。
常用的包埋剂为环氧树脂和丙烯酸树脂等
环氧树脂：国产618环氧树脂、Epon812等
丙烯酸树脂：有LR White、LR Gold、 Lowi-crvls等
切片 包埋好的组织块需在超薄切片机上用 玻璃刀或钻石刀切成超薄切片。
超薄切片一般收集在金属载网上进行 观察。常用铜网为200～400目，此外 根据不同的实验要求还可选用金网、 镍网等。
载网上一般包被一层支持膜，以支撑 载网上的超薄切片，增加其稳定性。 最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲 醛)、火棉胶、碳等。
染色与观察
生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组 成的，这些元素的原子序数低，散射电子的 能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通 常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行 染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和 力不同，因此染色后不同结构对电子的散射 能力亦不同，从而增强了细胞结构的反差。
应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强图像反 差 和 提 高 分 辨 率 (1.4—1.7 倍 ) ， 可 重 构 样品的三维结构。
二、 电子显微镜技术
透射电镜（TEM） 透射电镜的基本构造 透射电镜主要制样技术
1) 超薄切片技术 2) 负染色技术 3) 冰冻蚀刻技术 4) 真空喷镀技术 5) 电镜三维重构技术