一种单组份TMB显色液,其制备方法及试剂盒[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011044413.1
(22)申请日 2020.09.28
(71)申请人 北京森康维特生物技术研究所
地址 101499 北京市怀柔区杨宋镇凤翔一
园23号
(72)发明人 黄思斯　武子函　季志华　张雨　
刘伯华　杨鹏　
(74)专利代理机构 北京丰浩知识产权代理事务
所(普通合伙) 11781
代理人 李学康
(51)Int.Cl.
C12Q 1/28(2006.01)
G01N 33/58(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
(54)发明名称
一种单组份TMB显色液，其制备方法及试剂
盒
(57)摘要
本发明涉及体外检测领域，具体讲，涉及一
种单组份TMB显色液，其制备方法试剂盒。

该显色
液含有TMB、过氧化氢、缓冲液、pH调节剂、聚乙烯
吡咯烷酮K30、二甲基亚砜和1,2,6‑己三醇。

本发明的单组份TMB显色液能在2～8℃条件下稳定放
置2年，显色效果可以持续1小时，而且显色的强
度明显增强，同时没有增加本底，提高了检测的
灵敏度，达到了稳定高效的目的，满足酶联免疫
试剂盒对显色底物液的各项要求。

权利要求书1页 说明书10页 附图1页CN 112280824 A 2021.01.29
C N 112280824
A
1.一种单组份TMB显色液，该显色液中含有TMB、过氧化氢、缓冲液和pH调节剂，其特征在于，所述显色液中还含有聚乙烯吡咯烷酮K30、二甲基亚砜和1,2,6-己三醇。

2.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，每1000mL所述显色液中含有TMB 0.4～0.6g、过氧化氢400～600μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 12～16g、二甲基亚砜8～12mL和1,2,6-己三醇4～6g；
优选的，每1000mL所述显色液中含有TMB 0.5g、过氧化氢500μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 14g、二甲基亚砜10mL和1,2,6-己三醇5g。

3.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，所述显色液的pH值为3.0～
4.0，优选3.5～3.8。

4.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，所述显色液中还含有硫代硫酸钠，优选的，每1000mL所述显色液中含有硫代硫酸钠2.5～3.5mg，更优选为3mg。

5.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，所述显色液中还含有乙二胺四乙酸二钠，优选的，每1000mL所述显色液中含有乙二胺四乙酸二钠0.2～0.3g，更优选为0.24g。

6.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，所述显色液中还含有稳定剂，所述稳定剂优选甘油和海藻糖中的至少一种；
优选的，每1000mL所述显色液中含有甘油4.5～5.5mL，更优选为5mL；每1000mL所述显色液中含有海藻糖9～10g，更优选为9.46g。

7.根据权利要求1所述的显色液，其特征在于，所述缓冲液采用醋酸-柠檬酸缓冲液，优选的，每1000mL所述显色液中含有柠檬酸0.95～1.05g和乙酸钠8～8.4g，更优选的，每1000mL所述显色液中含有柠檬酸1g和乙酸钠8.2g；
所述pH调节剂选自摩尔浓度为6～12mol/L的HCl，优选的，每1000mL所述显色液中含有HCl 4～9mL。

8.一种如权利要求1～7任一项所述显色液的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、按比例量取pH调节剂加入水中，得到pH调节剂水溶液；按比例称取TMB溶于二甲基亚砜中，得到TMB溶液；优选的，所述pH调节剂水溶液的pH值为1.69；
S2、在所述pH调节剂水溶液中按比例加入聚乙烯吡咯烷酮K30，然后加入所述TMB溶液；S3、再按比例加入1,2,6-己三醇和缓冲液成分，调节pH值，加入过氧化氢，定容，过滤，即得所述显色液；
优选的，按比例加入硫代硫酸钠、1,2,6-己三醇、柠檬酸、甘油、海藻糖和乙二胺四乙酸二钠，用乙酸钠溶液调节pH值到3.6后再加入过氧化氢。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液的浓度8～8.4g/L，优选为8.2g/L；优选的，所述过滤为采用0.45μm的滤器进行过滤。

10.一种酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～7任一项所述的显色液。

权　利　要　求　书1/1页CN 112280824 A
一种单组份TMB显色液，其制备方法及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及体外检测领域，具体讲，涉及一种单组份TMB显色液，其制备方法试剂盒。

背景技术
[0002]TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。

HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+H2O2→D+H2O，上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。

在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。

TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。

其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。

在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。

[0003]TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。

另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA 中应用日趋广泛。

酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。

但是TMB比较难溶于水中，而且在溶液状态中性质不稳定，比较难以存放，这就造成了市场上常规TMB显色液稳定性差，显色不够持久，经过长时间放置后显色强度降低等问题。

目前国内TMB显色底物液多采用双组分，分A液和B液，即将TMB和过氧化物分开，使用前按比例混匀。

此方法可以虽然稳定，但增加了试验步骤，双组分混合时容易产生批间差异，从而影响ELISA检测结果。

但目前市面上的单组份TMB显色底物液的稳定性差，保存时间短，且存在显色背景高，均一性不好的缺陷。

[0004]鉴于此，特提出本发明。

发明内容
[0005]本发明的首要发明目的在于提供一种单组份TMB显色液。

[0006]本发明的第二发明目的在于提供该显色液的制备方法。

[0007]本发明的第三发明目的在于提供采用该单显色液的试剂盒。

[0008]为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
[0009]本发明涉及一种单组份TMB显色液，该显色液中含有TMB、过氧化氢、缓冲液和pH调节剂，其特征在于，所述显色液中还含有聚乙烯吡咯烷酮K30、二甲基亚砜和1,2,6-己三醇。

[0010]可选的，每1000mL所述显色液中含有TMB 0.4～0.6g、过氧化氢 400～600μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 12～16g、二甲基亚砜8～12mL和 1,2,6-己三醇4～6g；
[0011]优选的，每1000mL所述显色液中含有TMB 0.5g、过氧化氢500μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 14g、二甲基亚砜10mL和1,2,6-己三醇5g。

[0012]可选的，所述显色液的pH值为3.0～4.0，优选3.5～3.8。

[0013]可选的，所述显色液中还含有硫代硫酸钠，优选的，每1000mL所述显色液中含有硫代硫酸钠2.5～3.5mg，更优选为3mg。

[0014]可选的，所述显色液中还含有乙二胺四乙酸二钠，优选的，每1000mL 所述显色液中含有乙二胺四乙酸二钠0.2～0.3g，更优选为0.24g。

[0015]可选的，所述显色液中还含有稳定剂，所述稳定剂优选甘油和海藻糖中的至少一种；
[0016]优选的，每1000mL所述显色液中含有甘油4.5～5.5mL，更优选为5 mL；每1000mL所述显色液中含有海藻糖9～10g，更优选为9.46g。

[0017]可选的，所述缓冲液采用醋酸-柠檬酸缓冲液，优选的，每1000mL 所述显色液中含有柠檬酸0.95～1.05g和乙酸钠8～8.4g，更优选的，每 1000mL所述显色液中含有柠檬酸1g 和乙酸钠8.2g；
[0018]所述pH调节剂选自摩尔浓度为6～12mol/L的HCl，优选的，每1000mL 所述显色液中含有HCl 4～9mL。

[0019]本发明还涉及上述显色液的制备方法，至少包括以下步骤：
[0020]S1、按比例量取pH调节剂加入水中，得到pH调节剂水溶液；按比例称取TMB溶于二甲基亚砜中，得到TMB溶液；优选的，所述pH调节剂水溶液的pH值为1.69；
[0021]S2、在所述pH调节剂水溶液中按比例加入聚乙烯吡咯烷酮K30，然后加入所述TMB 溶液；
[0022]S3、再按比例加入1,2,6-己三醇和缓冲液成分，调节pH值，加入过氧化氢，定容，过滤，即得所述显色液；
[0023]优选的，按比例加入硫代硫酸钠、1,2,6-己三醇、柠檬酸、甘油、海藻糖和乙二胺四乙酸二钠，用乙酸钠溶液调节pH值到3.6后再加入过氧化氢。

[0024]可选的，所述乙酸钠溶液的浓度8～8.4g/L，优选为8.2g/L；优选的，所述过滤为采用0.45μm的滤器进行过滤。

[0025]本发明还涉及一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒中含有上述的显色液。

[0026]本发明至少具有以下有益的效果：
[0027]本发明的单组份TMB显色液能在2～8℃条件下稳定放置2年，显色效果可以持续1小时，而且显色的强度明显增强，同时没有增加本底，提高了检测的灵敏度，达到了稳定高效的目的，满足酶联免疫试剂盒对显色底物液的各项要求。

附图说明
[0028]图1为实施例4的稳定性折线图。

具体实施方式
[0029]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0030]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。

如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0031]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032]本发明实施例涉及一种单组份TMB显色液，该显色液中含有TMB、过氧化氢、缓冲液和pH调节剂，还含有聚乙烯吡咯烷酮K30、二甲基亚砜和1,2,6-己三醇。

本发明实施例通过加入有机溶剂二甲基亚砜对TMB进行溶解，同时添加了聚乙烯吡咯烷酮K30作为助溶剂，从而显著增强了试剂组分的均一性，配制的显色液稳定，加入1,2,6-己三醇阻止OH、O的形成，保护TMB免于被O2-、OH-氧化，保证了TMB显色液的储存稳定性。

[0033]可选的，每1000mL显色液中含有TMB 0.4～0.6g、过氧化氢400～ 600μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 12～16g、二甲基亚砜8～12mL和1,2,6-己三醇4～6g；如果聚乙烯吡咯烷酮K30添加量过大则溶液变浑浊，添加量过小则不能很好的溶解TMB。

如果二甲基亚砜添加量过大则增加成本，添加量过小则不能很好的溶解TMB。

如果1,2,6-己三醇添加量过大则导致最终OD读数减小，添加量过小则对显色液的稳定性带来不利影响。

[0034]进一步可选的，每1000mL显色液中含有TMB 0.45～0.55g、过氧化氢450～550μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 13～15g、二甲基亚砜9～11mL和 1,2,6-己三醇4.5～5.5g。

更优选的，每1000mL显色液中含有TMB 0.5g、过氧化氢500μL、聚乙烯吡咯烷酮K30 14g、二甲基亚砜10mL和1,2,6- 己三醇5g。

[0035]具体的，本发明实施例的显色液的pH值为3.0～4.0，如果超出范围则会使TMB不稳定。

优选的，本发明实施例的显色液的pH值为3.5～3.8。

[0036]具体的，本发明实施例的显色液中还含有还原剂。

还原剂选自硫代硫酸钠，可选的，每1000mL显色液中含有硫代硫酸钠2.5～3.5mg，如果添加量过大则影响最终OD读数，如果添加量过小则起不到保护作用。

优选的，每1000mL显色液中含有硫代硫酸钠2.7～3.3mg。

更优选的，每 1000mL显色液中含有硫代硫酸钠3mg。

[0037]具体的，本发明实施例的显色液中还含有螯合剂，螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠，加入EDTA螯合过度金属盐如铁和铜，阻止通过哈伯.韦斯反应进一步形成自由基，也可防止TMB被氧化。

可选的，每1000mL显色液中含有乙二胺四乙酸二钠0.2～0.3g，如果添加量过大则容易析出，如果添加量过小则不能完全熬合溶液中痕量的金属离子，导致TMB溶液不稳定保存期缩短。

优选的，每1000mL显色液中含有乙二胺四乙酸二钠 0.22～0.28g，更优选为每1000mL显色液中含有乙二胺四乙酸二钠0.24g。

[0038]具体的，本发明实施例的显色液中还含有稳定剂，稳定剂可选自甘油和海藻糖中的至少一种；甘油、海藻糖可有效保护双氧水的稳定性，进一步提高显色液的储存稳定性。

每1000mL显色液中含有甘油4.5～5.5mL，如果添加量过大或过小都会影响最终读数。

优选为4.8～5.2mL，更优选为5mL。

[0039]具体的，每1000mL显色液中含有海藻糖9～10g，如果添加量过大则不能完全溶解；如果添加量过小则不能起到保护作用。

优选为9.3～9.6g，更优选为9.46g。

[0040]具体的，本发明实施例的显色液缓冲液采用醋酸-柠檬酸缓冲液，优选的，每
1000mL显色液中含有柠檬酸0.95～1.05g和乙酸钠8～8.4g，更优选的，每1000mL所述显色液中含有柠檬酸1g和乙酸钠8.2g；
[0041]具体的，本发明实施例的pH调节剂选自HCl，盐酸的摩尔浓度为 6～12mol/L。

优选的，每1000mL显色液中含有浓HCl 4～9mL。

使用浓度为12mol/L的HCl，用量则为4.32mL，使用浓度为6mol/L的HCl，用量则为8.64mL。

[0042]具体的，本发明实施例的显色液的配方为：每1000mL显色液中含有：
[0043]
[0044]
[0045]优选为，每1000mL显色液中含有：
[0046]
[0047]
[0048]本发明实施例还涉及上述显色液的制备方法，至少包括以下步骤：
[0049]S1、按比例量取pH调节剂加入水中，得到pH调节剂水溶液；按比例称取TMB溶于二甲基亚砜中，得到TMB溶液；优选的，pH调节剂水溶液的pH值为1.69；
[0050]S2、在pH调节剂水溶液中按比例加入聚乙烯吡咯烷酮K30，然后加入TMB溶液；[0051]S3、再按比例加入1,2,6-己三醇和缓冲液成分，调节pH值，加入过氧化氢，定容，过滤，即得显色液；
[0052]优选的，按比例加入硫代硫酸钠、1,2,6-己三醇、柠檬酸、甘油、海藻糖和乙二胺四乙酸二钠，用乙酸钠溶液调节pH值，后加入过氧化氢。

[0053]在S3中，乙酸钠溶液的浓度为8～8.4g/L，优选为8.2g/L。

[0054]具体的，在S3中，过滤为采用0.45μm的滤器进行过滤。

[0055]同时，配制过程注意避免强光照射，配制得到的溶液用棕色瓶避光保存。

[0056]本发明实施例还涉及一种酶联免疫试剂盒，含有上述显色液。

该试剂盒中还含有酶标抗体和终止液。

[0057]实施例1：TMB底物显色液配制
[0058]具体方法为：
[0059]1、量取摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸4.32mL，边搅拌边将其缓慢加入200mL水中，得到pH值为1.69的pH调节剂水溶液；加入14g聚乙烯吡咯烷酮K30，使之充分溶解；[0060]2、将0.5gTMB溶于10mL二甲基亚砜中，充分混匀后加入盐酸溶液中；再依次加入硫
代硫酸钠3mg、1,2,6-己三醇5g、柠檬酸1g、甘油5mL、海藻糖9.46g、乙二胺四乙酸二钠
0.24g，搅拌使之充分溶解；
[0061]3、使用浓度为8.2g/L的乙酸钠调节pH值到3.5～3.8，加过氧化氢 500μL，定容至1L，使用0.45μm滤器过滤，棕色瓶避光保存。

[0062]配置过程注意避免强光照射。

上述水为去离子水，所用化学试剂为分析纯及以上，具体来源见表1。

[0063]表1
[0064]名称厂家规格
浓盐酸北京化工厂500mL
聚乙烯吡咯烷酮K30国药化学试剂100g，GR
3,3',5,5'-四甲基联苯胺Sigma5g
二甲基亚砜Sigma1L
硫代硫酸钠Sigma98％,25g
1,2,6-己三醇Sigma96％,100g
柠檬酸Fluka1Kg
甘油Sigma1L
海藻糖ANGUS1Kg
乙二胺四乙酸二钠Sigma500g
醋酸钠Sigma500g
双氧水Alfa Aesar500ml,35％
[0065]实施例3：TMB底物显色液配制
[0066]具体方法为：
[0067]1、量取摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸4.32mL，边搅拌边将其缓慢加入200mL水中，得到pH值为1.69的pH调节剂水溶液；加入12g聚乙烯吡咯烷酮K30，使之充分溶解；[0068]2、将0.4gTMB溶于10mL二甲基亚砜中，充分混匀后加入盐酸溶液中；再依次加入硫代硫酸钠2.5mg、1,2,6-己三醇4.5g、柠檬酸1g、甘油 4.5mL、海藻糖9g、乙二胺四乙酸二钠0.2g，搅拌使之充分溶解；
[0069]3、使用浓度为8.2g/L的乙酸钠调节pH值到3.5～3.8，加过氧化氢 500μL，定容至1L，使用0.45μm滤器过滤，棕色瓶避光保存。

[0070]配置过程注意避免强光照射。

上述水为去离子水，所用化学试剂为分析纯及以上，具体来源见表1。

[0071]实施例3：TMB底物显色液配制
[0072]具体方法为：
[0073]1、量取摩尔浓度为12mol/L的浓盐酸4.32mL，边搅拌边将其缓慢加入200ml水中，得到pH值为1.69的pH调节剂水溶液；加入16g聚乙烯吡咯烷酮K30，使之充分溶解；[0074]2、将0.6gTMB溶于10mL二甲基亚砜中，充分混匀后加入盐酸溶液中；再依次加入硫代硫酸钠3.5mg、1,2,6-己三醇5.5g、柠檬酸1g、甘油 5.5mL、海藻糖10g、乙二胺四乙酸二钠0.3g，搅拌使之充分溶解；
[0075]3、使用浓度为8.2g/L的乙酸钠调节pH值到3.5～3.8，加过氧化氢 500μL，定容至1L，使用0.45μm滤器过滤，棕色瓶避光保存。

[0076]配置过程注意避免强光照射。

上述水为去离子水，所用化学试剂为分析纯及以上，具体来源见表1。

[0077]实验例1
[0078]一种酶联免疫试剂盒，含有实施例1制备的单组份TMB显色液、终止液。

采用该酶联免疫法试剂盒检测方法包括以下步骤：
[0079]以实施例1制备的TMB底物显色液，代替商品化底物：Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(IDEXX Laboratories,Inc.)中TMB显色液，按试剂盒使用方法对不同浓度的标准品进行检测，具体实验步骤为：
[0080](1)取出包被板，将100μL系列标准品加入孔中，26℃反应1h，洗板3次，拍干；[0081](2)每孔加入100μL酶标抗体，26℃反应1h，洗板3次，拍干；
[0082](3)每孔加入100μL显色液，26℃孵育15min；
[0083](4)每孔加入100μL终止液终止反应；
[0084](5)酶标仪于650nm波长处读取吸光值。

[0085]对比商品化底物显色液进行检测，获得不同浓度标准品所得的OD值 (λ＝650nm)，具体试验结果如表2所示：
[0086]表2标准品检测结果
[0087]
[0088]从实验结果可以看出最低检出量为10μg/ml，测试标准品0-1000pg/ml 的检测结果可视为底物的本底值，可见实施例1的本底值较为稳定，根据实验检测结果，商品化底物显色液的本底为0.061，实施例1的本底值为 0.060，本发明配制的底物显色液本底较低。

[0089]实施例1检测的(S/N)＝0.094/0.060＝1.567，大于商品化底物显色液测定的(S/ N)＝0.071/0.061＝1.164，应用到试剂盒中检测的样本灵敏度高。

[0090]同时测定不同显色时间下的OD值，具体试验结果如表3所示。

[0091]表3
[0092]
[0093]实验例2
[0094]将实施例1中的TMB底物显色液与商品化底物(Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(IDEXX Laboratories,Inc.)中TMB显色液)同时同等量放入37℃恒温培养箱中，放置0天、7天、14天、21天、28天后，同时取出对比验证，检测方法同实施例2，具体试验结果如表4所示：
[0095]表4
[0096]
[0097]
[0098]通过表4的数据对比可知，经过37℃恒温放置可见实施例1具有较高的抗高温能力，减少了高温天气运输对试剂盒的影响。

[0099]实验例3
[0100]以实施例1中制备的TMB底物显色液与商品化底物同时同等量进行保存期实验，放置2℃～8℃保存0d、6个月、12个月、18个月、24个月、 30个月，同时取出对比验证，检测方法同实施例2，结果见表5，其中 10μg/ml的折线图如图1所示。

[0101]表5
[0103]从表5和图1所示的试验结果可以看出，实施例1的底物储存稳定性很好，按上述试验的稳定性考察已累积了2年以上，显色剂表现良好。

其所制显色剂的性能能满足使用要求。

[0104]对比例
[0105]对比例1：采用实施例1的方法制备TMB底物显色液，区别在于不添加1,2,6-己三醇。

[0106]对比例2：采用实施例1的方法制备TMB底物显色液，区别在于不添加甘油。

[0107]对比例3：采用实施例1的方法制备TMB底物显色液，区别在于不添加海藻糖。

[0108]按照实验例1、2的方法进行实验，得到的实验数据如表6～表8所示。

[0109]表6
[0111]表7
[0112]
[0113]表8
[0114]
[0115]从表6～表8所示的试验结果可以看出，对比例1和2会导致阴性0 pg/ml背景值升高，溶液颜色变蓝，对比例3阳性OD值会降低。

[0116]本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

图1。