柱前衍生化－高效液相色谱法检测疫苗中游离甲醛含量

柱前衍生化－高效液相色谱法检测疫苗中游离甲醛含量
马秋冉;张璐;戴青;杨星;于晓辉
【摘要】Pre-column derivatization HPLC method was established in order to determine the free formaldehyde content in vaccine with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)as the derivatization reagent.The Waters Atlantis T3 (4.6 mm ×250 mm,5 μm)was used in the analysis.The mobile phase was a mixture of acetonitrile and water with a ratio of 65 to 35 by volume.The flow rate was 1 .0 mL/min.UV detection was made at the wavelength of 365 nm.The recovery of samples was in a range of
98.28%~105.24%,with relative standard deviation (RSD)of 2.3%.The detection limit was 0.4 mg/L and the quantitation limit was 1 .6 mg/L.The free formaldehyde content in vaccine showed good liner relationship to
the peak area within a content range of 0.0040~1.1930 mg/mL (r2
=0.9991 ).This method is separable,specific,simple and not easy to be affected by vaccine’s ground substance and color,and might be used for determination of formaldehyde content in vaccine.%建立了测定疫苗中游离
甲醛含量的柱前衍生化－高效液相色谱法。

采用2，4－二硝基苯肼衍生疫苗中游
离甲醛，乙腈！水（65！35）为流动相，流速为1．0 mL／min，色谱柱为Waters Atlantis T3柱（4．6 mm ×250 mm，5μm），检测波长为365 nm。

在此方法下，3个不同甲醛浓度样品回收率为98．28％～105．24％，相对标准
偏差（RSD）为2．3％。

本方法检测限为0．4 mg／L，定量限为1．6 mg／L。

游离甲醛浓度在0．0040～1．1930 mg／mL范围内，与甲醛衍生物峰面积呈良
好的线性关系（r2＝0．9991）。

结果表明，该方法分离度高，专属性强，操作简单且不易受疫苗基质和颜色影响，可用于测定疫苗中游离甲醛含量。

【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】2016(050)008
【总页数】4页(P20-23)
【关键词】高效液相色谱;柱前衍生化;甲醛;疫苗
【作者】马秋冉;张璐;戴青;杨星;于晓辉
【作者单位】中国兽医药品监察所，北京 100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京 100081;中国兽医药品监察所，北京 100081;中国兽医药品监察所，北京 100081
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
甲醛是一种原生质毒物，对人的神经系统、肺、肝脏均有损害，对皮肤和黏膜有强烈的刺激作用，还是可疑致癌物[1]。

在疫苗中常添加甲醛以达到灭活、防腐的目的[2]，《中国兽药典》对兽用疫苗游离甲醛含量有明确规定[3]。

目前常采用乙酰丙酮分光光度法、亚硫酸品红比色法检测疫苗中游离甲醛含量。

乙酰丙酮分光光度法在应用过程中，抗干扰性差，灵敏度稍低[4]；而亚硫酸品红比色法，在游离甲醛含量较低时对其难以进行准确测定，并且显色剂和甲醛标准溶液放置时间长短会对测定结果产生较大影响[5]。

因此，本实验就建立柱前衍生化-高效液相色谱法检测疫苗中游离甲醛进行了研究，并进行了方法学验证，以期为测定疫苗中游离甲醛含量提供新方法。

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器PDA2998)；色谱
工作站处理软件Empower 2；Waters Atlantis® T3柱：4.6 mm×250 mm，5 μm；微孔滤膜0.45 μm；分析天平：感量0.01 mg；恒温水浴锅；移液器：2～20 μL，Brand公司。

1.2 试剂与试液甲醛溶液标准品(含量37.0%，批号：141127，天津化学药品厂)；2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH，批号：20141110，国药集团化学试剂有限公司)溶液：3.0 g/L，称取2,4-DNPH约300 mg溶于100 mL乙腈中；中性红试液：称取中性红(批号：20150325，国药集团化学试剂有限公司)适量，加水制成浓度为0.1%的中性红溶液；酚红试液：称取酚红适量(批号：F20110616，国药集团化学试剂有限公司)，加1 mol/L氢氧化钠制成浓度为0.01%的酚红溶液；乙腈为色谱纯；水为纯化水；氢氧化钠为分析纯；鸡新城疫疫苗(批号：2015003)；小鹅瘟精制蛋黄抗体(批号：20141001、20141003)；猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-
SX07株)(批号：201503003、2015003-1)；猪支原体肺炎灭活疫苗(批号：2015003-2)。

2.1 样品测定
2.1.1 样品溶液制备量取疫苗溶液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐温-乙醇
溶液10 mL，分数次洗涤吸管，洗液并入50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强烈振摇，静置，分取下层清液备用，如下层清液不澄清，需经过滤，弃去初滤液，取续滤液，滤液即为样品溶液。

2.1.2 对照品溶液制备按照所需浓度，精密量取甲醛溶液标准品适量，加水进行稀释，摇匀；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐温-乙醇溶液10 mL，再加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.3 衍生化反应量取样品溶液/对照品溶液0.25 mL，置10 mL量瓶中，加
3.75 mL水、1.5 mL 2,4-DNPH溶液，再加乙腈稀释至刻度，摇匀置60 ℃水浴20 min后，待溶液冷却至室温，滤过，滤液供HPLC测定。

以保留时间定性，外标法定量，同时做空白试验，计算疫苗中游离甲醛含量。

2.2 色谱条件流动相：乙腈︰水(65︰35)；流速1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检
测波长：365 nm；进样量为10 μL。

2.3 专属性考察将中性红试液，酚红试液、甲醛阴性对照溶液(水溶液)、甲醛溶液标准品，按2.1.3项下方法进行衍生化后，按2.2项下方法进行测定，试验结果见图1-图4。

结果显示，按2.2项下的色谱条件，出峰顺序依次为2,4-DNPH、甲
醛衍生物，且两者分离度大于1.5。

甲醛阴性对照溶液、酚红试液及中性红试液色谱图中，在甲醛衍生物位置不出峰。

结果表明该色谱分离条件能够有效分离2,4-DNPH及甲醛衍生物，且中性红、酚红对测定结果无影响，具有较好的专属性。

2.4 线性关系考察取甲醛溶液标准品适量，配制浓度为4.9710 mg/mL的甲醛对
照品储备液。

分别精密量取甲醛对照品储备液6.0、5.0、4.0、2.0、0.5、0.2、0.02 mL置25 mL量瓶中加水稀释至刻度，配制浓度分别为1.1930、0.9942、0.7954、0.3977、0.0994、0.0398、0.0040 mg/mL的甲醛对照品溶液。

将不同浓度的甲醛对照品溶液按2.1.3项下衍生化后，按2.2项下方法进行测定。

以甲醛衍生物吸收峰峰面积为纵坐标(y)，进样浓度(x，mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线(图5)，计算回收方程为y=8×106+6x+85972，r2=0.9991。

试验表明，游离甲
醛在0.0040～1.1930 mg/mL浓度范围内与甲醛衍生物吸收峰峰面积线性关系良好。

2.5 准确度考察取甲醛溶液标准品适量，配制浓度为5.0685 mg/mL的甲醛对照
品储备液。

分别量取9份5 mL鸡新城疫疫苗供试品溶液，置50 mL量瓶中，加20%吐温-乙醇溶液10 mL，分数次洗涤吸管，洗液并入50 mL量瓶中，分别加
入0.64、0.80、0.96 mL甲醛对照品储备液，每个浓度3份，加水稀释至刻度，
强烈振摇，静置，分取下层清液备用，如下层清液不澄清，需经过滤，弃去初滤液，取续滤液。

得到甲醛浓度分别为0.0649、0.0811、0.0973 mg/mL的样品溶液。

按2.1.1项下方法，平行制备2份鸡新城疫疫苗样品溶液，作为空白样品溶液。

将上述11份样品溶液，按2.1.3项下方法衍生化后，按2.2项下方法进行测定，每
个样品重复测定2次，计算加样回收率、平均回收率及RSD值。

试验结果见表1。

2.6 检测限、定量限考察取甲醛溶液标准品适量，配制浓度为100 μg/mL的甲醛对照品储备液。

分别精密量取5.0、4.0、
3.0、2.0、1.0、0.5 mL甲醛对照品储备液置50 mL量瓶中加水稀释至刻度，配制浓度为10、8、6、4、2、1 μg/mL的
甲醛对照品溶液。

按2.1.3项下方法衍生化后，按2.2项下方法进行测定。

测定结果显示，浓度为1 μg/mL时，游离甲醛衍生物的信噪比(S/N)约等于3；浓度为4 μg/mL时，游离甲醛衍生物的信噪比(S/N)>10。

确定本方法的检出限为0.4
mg/L，定量限为1.6 mg/L。

2.7 样品测定取5批兽用疫苗，按2.1项下测定方法进行检测，计算样品中游离
甲醛含量，结果见表2。

5批兽用疫苗的游离甲醛含量均符合2010年版《中国兽
药典》规定，均不高于0.8 mg/mL。

3.1 衍生化反应体系的优化纪宏等 [5]曾采用稀盐酸溶解2,4-DNPH，王连珠等[6-7]采用乙腈溶解,但陈笑梅等 [8]发现甲醛与2,4-DNPH在弱酸缓冲溶液中反应结
果不稳定，并有2,4-DNPH晶体析出。

经试验发现，当2,4-DNPH为3.0 g/L时，在稀盐酸溶液中不能完全溶解，但易溶于乙腈，故本研究采用乙腈溶解2,4-DNPH。

3.2 2,4- DNPH用量的选择当甲醛浓度为1 mg/mL时，甲醛衍生物峰面积随
2,4-DNPH加入量的增加而增加。

当加入量为1.5～2.5 mL时，甲醛衍生物吸收
峰峰面积基本一致，说明甲醛已反应完全。

本试验选用3 mg/mL 2,4-DNPH溶液1.5 mL进行衍生化反应。

3.3 小结本实验建立了柱前衍生化-高效液相色谱法检测疫苗中的游离甲醛含量，
该方法分离效率高，选择性好，操作简单且不易受疫苗中基质和颜色影响，可用于
疫苗中游离甲醛含量的测定。

【相关文献】
[1] 都丽萍，梅丹. 免疫接种的安全性及不良事件[J] .药物不良反应杂志,2010, 12(4)：255-261.
[2] 赵铠，章以浩，李河民. 医学生物制品学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2007: 805-816.
[3] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典 [M]. 三部. 北京：中国农业出版社，2010: 附录20.
[4] 李忠军，邹训重，黎彧，等. 甲醛测定方法的进展概述[J]. 广东微量元素科学，2014, 21(6): 28-32.
[5] 纪宏，马迅，祁进，等. 衍生毛细管气相色谱法测定流感病毒裂解疫苗中游离甲醛含量[J]. 中国
生物制品学杂志，2014, 27(8): 1097-1102.
[6] 王连珠，王登飞，梁鸣，等. 高效液相色谱法测定化妆品中甲醛[J]. 理化检验：化学分册，2006, 42(9): 723-725.
[7] SN/T 1547-2005. 进出口食品中甲醛含量测定-液相色谱法[S].
[8] 陈笑梅，施旭霞，朱卫建，等. 高效液相色谱直接测定甲醛衍生物反应条件的研究[J]. 分析化学，2004, 32(11): 1489-1491.。