M2型抗线粒体抗体的靶抗原三联体克隆表达技术改良

论著 基础研究
M２型抗线粒体抗体的靶抗原三联体克隆表达技术改良∗
张婕婕１,杨自华２ә
(深圳市人民医院:１．医务科;２．检验科,广东深圳５１８０００)
㊀㊀摘㊀要:目的㊀改良构建M２型抗线粒体抗体(AMAＧM２)靶基因三联体重组表达载体技术,建立检测AMAＧM２的酶联免疫吸附法(E L I S A)并进行评价.方法㊀通过聚合酶链反应(P C R)扩增基因三联体B P O,构建表达载体p G E XＧ４TＧ１ＧB P O,转入大肠杆菌B L２１表达,经异丙基硫代半乳糖苷(I P T G)诱导得到重组蛋白,并通过亲和层析纯化得到目的蛋白,建立E L I S A检测AMAＧM２.结果㊀获得纯度大于９５％的重组蛋白;检测３２６例临床样本,４３例原发性胆汁性肝硬化(P B C)患者中有４１例呈AMAＧM２阳性,灵敏度为９５．３％(４１/４３),特异度为９８．２％(２７８/２８３),P B C组与非P B C组的A M AＧM２检出率差异有统计学意义(P＜０．０５).结论㊀该改良技术获取的目的蛋白可以用于A M AＧM２检测,A M AＧM２对P B C的临床诊断具有较高的灵敏度和特异度.
关键词:抗线粒体抗体;㊀肝硬化;㊀自身免疫
D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．１０．００６中图法分类号:R５７５．２＋２
文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)１０Ｇ１１７６Ｇ０４文献标识码:A
An o v e l s t r a t e g y f o r c l o n i n g a n d e x p r e s s i o no fA u t oＧa n t i g e n t r i m e r o fM２A n t iＧm i t o c h o n d r i a l a n t i b o d y∗
Z HA N GJ i e j i e１,Y A N GZ i h u a２ә
(１．D e p a r t m e n t o f m e d i c a l s e r v i c e s;２．D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,S h e n z h e n
P e o p l eᶄsH o s p i t a l,S h e n z h e n,G u a n g d o n g５１８０００,C h i n a)
A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T om o d i f y r e c o m b i n a n t p l a s m i d c o n s t r u c t i o no f
B P Ot r i m e r,a n d e s t a b l i s h t h e d e t e cＧt i o no fM２t y p e a n t iＧm i t o c h o n d r i a l a n t i b o d y(AMAＧM２)u s i n g E L I S A．T om o d i f y t h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n v e c t o r o f t h e t a r g e t g e n e t r i p l e t o fAMAＧM２,a n d t oe s t a b l i s ha n de v a l u a t e a ne n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A)f o r t h e d e t e c t i o n o fAMAＧM２．M e t h o d s㊀T h e e x p r e s s i o n v e c t o r p G E X４T１B P Ow a s c o n s t r u cＧt e d t h r o u g h t h e g e n e a m p l i f i c a t i o n o f t r i p l e t B P Ob y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(P
C R),a n d e x p r e s s e d i n E．c oＧl i B L２１,a n d t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i nw a s i n d u c e db y i s o p r o p y lT h i o g l u c o s i d e(I P T G)．T h e t a r g e t p r o t e i nw a s p u r i f i e db y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y,a n dE L I S A w a se s t a b l i s h e dt od e t e c tAMAＧM２．R e s u l t s㊀T h er e c o m b iＧn a n t p r o t e i nw i t ha p u r i t yg r e a t e r t h a n９５％w a s o b t a i n e d．３２６c a s e so f c l i n i c a l s a m p l e sw a s e x a m i n e d,a n d i n ４３c a s e so f p r i m a r y b i l i a r y c i r r h o s i s(P B C),４１c a s e ss h o w e d AMAＧM２p o s i t i v e,t h es e n s i t i v i t y w a s９５．３％(４１/４３),t h es p e c i f i c i t y w a s９８．２％(２７８/２８３),a n dt h ed i f f e r e n c eo fAMAＧM２d e t e c t i o nr a t eb e t w e e nP B C g r o u p a n dn o nP B C g r o u p w a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t．C o n c l u s i o n㊀T h et a r g e t p r o t e i no b t a i n e db y t h e i mＧp r o v e d t e c h n o l o g y c a nb eu s e df o rAMAＧM２d e t e c t i o n．AMAＧM２h a sh i g hs e n s i t i v i t y a n ds p e c i f i c i t y f o r t h e c l i n i c a l d i a g n o s i s o fP B C．
K e y w o r d s:a n t iＧm i t o c h o n d r i a l a n t i b o d y;㊀c i r r h o s i s;㊀a u t o i mm u n i t y
㊀㊀原发性胆汁性肝硬化(P B C)是一种原因不明的慢性胆汁淤积性自身免疫性疾病,好发于成年女性,确诊时往往已经发展到较严重的阶段.抗线粒体抗体(AMA)是诊断P B C的主要血清指标,有M１~M９共９个亚型,其中M２型AMA是P B C的特异性抗体[１],M２型抗体的靶抗原为线粒体上的２Ｇ氧酸脱氢酶复合体(２ＧO A D C)的一些组分,２ＧO A D C主要包括侧链二氧酸脱氢酶复合体E２亚基(B C O A D CＧE２)㊁丙酮酸脱氢酶复合体E２亚基(P D CＧE２)和２Ｇ氧戊二酸脱氢酶复合体E２亚基(O G D CＧE２).J I A N G等[２]已成功应用基因工程的方法把３个线粒体表位共同表达,建立了检测AMAＧM２的新方法.本实验采用另一种构建三联体表达载体的方法,不仅简化了操作步骤,而且达到预期的应用效果,有较好的临床应用价值.
１㊀资料与方法
１．１㊀一般资料㊀收集深圳市第一人民医院确诊P B C 患者的血清４３例,其中男４例㊁女３９例,年龄２０~８０
６７１１ 国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０１８,V o l．３９,N o．１０
∗基金项目:深圳市科技计划资助项目(J C Y J２０１７０３０７０９５９２２５５３).
㊀㊀作者简介:张婕婕,女,副主任检验技师,主要从事医学免疫学研究.㊀ә㊀通信作者,EＧm a i l:６０３００７６００＠q q．c o m.
㊀㊀本文引用格式:张婕婕,杨自华．M２型抗线粒体抗体的靶抗原三联体克隆表达技术改良[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(１０):１１７６Ｇ１１７９．
岁,平均(４４ʃ１５)岁,P B C诊断标准采用２０００年美国肝病学会P B C指导建议[３].收集同期自身免疫性肝炎(A I H)患者１５例,乙型病毒性肝炎患者３０例,丙型病毒性肝炎患者３０例,类风湿关节炎(R A)患者３３例,系统性红斑狼疮患者(S L E)３２例,以及１００例健康体检者的血清标本.
１．２㊀材料与试剂㊀将B C O A D CＧE２㊁P D CＧE２和O GＧD CＧE２的基因拼接成三联体B P O,在５ᶄ端添加G S T 标签,由上海旭冠生物合成;限制性内切酶(E c o R I/ X h o I)等主要工具酶及标记物购自于大连宝生物;表达载体p G E XＧ４TＧ１㊁D H５α和B L２１由科室自存;小量胶回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒㊁G S T柱和N iＧN A T 树脂柱购自于上海生工;抗M２Ｇ３E抗体检测试剂盒(E L I S A)购自德国E u r o i mm u n公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗人I g G购自S i g m a公司;化学试剂均为分析纯,购自深圳化试科技有限公司.１．３㊀仪器与设备㊀T１００P C R仪㊁I m a r k酶标仪㊁蛋白电泳仪和凝胶成像系统均购自美国B I OＧR A D公司;D Y YＧ８C核酸电泳仪由北京六一公司生产;A v a n t i JＧE高速冷冻离心机由美国B e c k m a n公司生产;Z HＧWYＧ２１１B全温型多振幅轨道摇床由上海智诚公司生产;V C５０５Ｇ７５０超声波细胞破碎仪由S O N I C S公司生产.
１．４㊀方法
１．４．１㊀引物的设计与合成㊀根据上海旭冠提供的含有目的基因的p U C１９质粒,用P r i m e r６．０软件设计用于大量扩增目的基因的引物.上游引物P１:５ᶄＧC C G G A A T T CG G TC A G G T T G T T C A G T T TＧ３ᶄ;下游引物P２:５ᶄＧC C GC T CG A GT C A A T GA T GA T G A T G A T G A T G T G C T G C A C C G G T T T T A C GＧ３ᶄ;上述引物由上海生工合成.１．４．２㊀目的基因的扩增与纯化㊀以含有目的基因的p U C１９质粒为模板,扩增目的基因;P C R扩增体系为５０μL,含有上㊁下游引物终浓度各０．２μm o l/L, d N T P s终浓度２００μm o l/L,１０ˑB u f f e r F o r E xT a q５μL,模板２μL,E xT a q酶１．２５U,灭菌去离子水补足５０μL;按照９４ħ变性５０s,６３ħ退火３０s,７２ħ延伸１m i n的程序扩增３０个循环;用１．５％的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,凝胶成像系统观测并记录结果;在紫外灯下切下目的条带,用胶回收试剂盒提纯目的D N A.
１．４．３㊀重组质粒的构建和转化㊀对纯化回收的P C R 产物进行双酶切并与同样双酶切的载体p G E XＧ４TＧ１进行连接,３７ħ双酶切４h,酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收;将回收的目的基因与载体以摩尔比５ʒ１的比例混合,１６ħ连接过夜,构建含有目的基因的重组质粒p G E XＧ４TＧ１ＧB P O;将重组质粒再转化大肠杆菌D H５α感受态细胞;阳性克隆裂解后经P C R电泳鉴定,同时提取阳性
克隆的质粒,进行双酶切验证.１．４．４㊀蛋白表达及纯化㊀阳性重组菌大量培养后,加异丙基硫代半乳糖苷(I P T G)诱导表达,I P T G终浓度为１mm o l/L,３７ħ通气培养４h,４ħ５０００r/m i n离心１５m i n收集细菌,将细菌悬浮于２０m L蛋白质结合缓冲液;反复冻融数次,超声破碎菌体,４ħ１４０００r/m i n超速离心２０m i n收集上清液,以获得表达菌液;带G S T和H I S标签的表达蛋白溶液先后经G S T 柱和N iＧN A T树脂柱进行亲和层析纯化.１．４．５㊀间接E L I S A方法建立及临床血清检测㊀纯化的重组蛋白用０．５m o l/L的碳酸盐缓冲液(p H９．６)稀释后包被酶标板,终浓度为１０μg/m L;４ħ过夜, P B S T洗涤３次后,加２％牛血清清蛋白(B S A)室温封闭１６h,洗涤后加入１ʒ１００待检血清室温孵育６０m i n,洗涤后加１ʒ１００００辣根过氧化物酶标记的羊抗人I g G,室温孵育３０m i n,然后洗涤３次,TM B避光室温显色１０m i n,终止后于４５０n m读取光密度(O D)值;临界值为阴性对照O D平均值＋３倍标准差.
１．５㊀统计学处理㊀使用S P S S１７．０分析软件;计数资料用例数和百分率表示,检出率差异比较采用χ２检验;采用R O C曲线计算三联体AMAＧM２诊断P B C 的最佳C u tＧo f f值,并确定曲线下面积(A U C)㊁诊断特异度和敏感度.以P＜０．０５为差异有统计学意义.２㊀结㊀㊀果
２．１㊀目的基因的扩增㊀对含有目的基因的p U C１９质粒进行P C R扩增.扩增产物在１．５％琼脂糖凝胶电泳结果显示,扩增出的D N A片段在约１５００b p处形成１条明亮的条带,与预期目的片段大小相符(图１)
.
㊀㊀注:１为B P O三联体P C R产物;M为D N A相对分子质量标志物图１㊀㊀P C R产物琼脂糖凝胶电泳图２．２㊀重组表达质粒构建鉴定㊀构建好的重组质粒经E c o RⅠ/X h oⅠ双酶切,得到与外源目的片段和p G E XＧ４TＧ１酶切片段大小相同的２条特异性条带(图２).
７７１１
国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０１８,V o l．３９,N o．１０
㊀㊀注:１为双酶切鉴定结果;M 为D N A 相对分子质量标志物
图２㊀㊀重组表达载体双酶切鉴定图
２．３㊀蛋白表达及纯化㊀S D S ＧP A G E 结果表明,
在蛋白质相对分子质量约为８０ˑ１０
３
处可见１条诱导表达的条带,与预期的相对分子质量一致(图３);表达的目的蛋白占全菌蛋白的１０％左右,亲和层析纯化后的蛋白质上清液在电泳凝胶上只显示融合蛋白的单一条带(图４);经薄层扫描分析,纯化后的蛋白质纯度达
９５％以上
.
㊀㊀注:M 为蛋白相对分子质量标准;１为经I P T G 诱导重组质粒转化菌;２为未经诱导重组质粒转化菌
图３㊀㊀表达产物的S D S ＧP A G E 分析
２．４㊀临床样本检测㊀E L I S A 方法检测３２６例临床血
清AMA ＧM ２,最佳C u t Ｇo f f 的O D 值为０．５２,
样本的O D 值与C u t Ｇo f f 的O D 值比值大于１为阳性,
比值小于１为阴性.其中４３例P B C 患者血清中,４１例呈阳性;２８３例非P B C 患者中,５例呈阳性;P B C 组与非P B C 组的AMA ＧM ２检出率差异有统计学意义(P ＜
０．０５).R O C 曲线下面积０．９３,见图５,９５％C I 为(０．８６１,０．９９９)
.㊀㊀注:M 为蛋白相对分子质量标准;１为纯化的B P O 蛋白
图４㊀㊀重组B P O
蛋白的纯化
图５㊀㊀三联体AMA ＧM ２诊断P B C 的R O C 曲线
３㊀讨㊀㊀论
㊀㊀原发性胆汁性肝硬化是一种免疫介导的慢性炎症性胆汁性肝病,是最常见的自身免疫性肝病,患病率是自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎患病率
总和的两倍以上[４]
,并且逐年递增,２０１０年我国广州
学者的研究显示,中国南部地区人群P B C 患病率为
４９２/１０００００,多为女性,目前研究认为每１０００位４０
岁以上女性中就有１位是P B C 患者[５
].
AMA 是P B C 的血清标志物,９５％的P B C 患者可检测出AMA ,１０％~２０％的自身免疫性肝炎患者
呈AMA 阳性,只有０．５％的健康人群有AMA [６]
.有研究表明[７
],M ２型AMA 是检测P B C 灵敏度最高的
抗体,诊断灵敏度达９４％,诊断特异度达９５％以上.
本实验结果显示,AMA ＧM ２对P B C 的诊断灵敏度和特异度略高于上述研究,分别为９５．３％㊁９８．２％,
这主要与样本的选取有关.
美国加利福尼亚大学G E R S HW I N 等[８]
于１９８７
年鉴定出M ２型抗体的靶抗原主要包括B C O A D C Ｇ
８７１１ 国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第１０期㊀I n t J L a bM e d ,M a y ２
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E２㊁P D CＧE２和O G D CＧE２;本实验基于化学拼接法原理获得三联体基因,将多拷贝的基因片段一次性合成,形成一个完整的多拷贝基因片段,然后再以此为扩增模板,构建表达载体.J I A N G等[２]使用的随机定向串联法,利用合成P C R引物,通过P C R获得１个拷贝的基因片段,通过限制性内切酶的黏性末端,将单拷贝基因经酶切后进行自身随机串联,该法只有将自身串联物克隆于载体后,经筛选来确定串联体中单体数目,而且除形成期望的串联体外,单体或串联体也可利用黏性末端自身环化,导致后续克隆失败,最终得不到串联体;两法相比较,本实验方法虽然基因合成的成本较高,但既简化了操作步骤,又可以避免三联体表达载体构建出错,因此更有优势.
部分商业化的E L I S A试剂盒只是基于P D CＧE２这个靶抗原设计的[９Ｇ１０],因此会导致P B C患者的漏检或者误诊.本实验应用三联体作为靶抗原,成功建立E L I S A检测方法,对P B C均有较高的灵敏度和特异度,在保证特异度的同时也能有效地降低漏检率;据文献报道[１１Ｇ１２],AMA对P B C的特异度并非１００％, A I H㊁特发性血小板减少性紫癜和系统性硬化症等患者偶见AMA阳性,所以临床除了参考AMAＧM２的结果外,还须结合生化指标进一步明确诊断.
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(收稿日期:２０１７Ｇ１１Ｇ２８㊀修回日期:２０１８Ｇ０１Ｇ０８)
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国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第１０期㊀I n t J L a bM e d,M a y２０１８,V o l．３９,N o．１０。