三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用

三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用作者：钟灿灿沈雁刘建伟陈志棠唐毅
【关键词】肝癌细胞
摘要:目的研究三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞株HepG2，BEL7402的抑制作用。

方法用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测用As2O3对肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长及抑制率的影响；凋亡电泳检测电泳条带，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期和凋亡率变化。

结果在0.1~50.0 μmol/L的浓度范围内As2O3对BEL7402、HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用，且有时间和浓度的依赖性；凋亡电泳显示5 μmol/L As2O3对肝癌细胞株HepG2，BEL7402凋亡率分别是46.7%和53.1%；流式细胞仪DNA组方图上可见细胞G1前期出现亚二倍峰。

结论 As2O3可抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402的生长，且在一定的范围内，抑制率具有一定的浓度和时间依赖性；As2O3对BEL7402细胞株的生长抑制作用大于HepG2；As2O3抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长的作用与细胞凋亡有关。

关键词:肝癌细胞；凋亡；三氧化二砷
三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)是中药砒霜的主要成分，在治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)取得了显著的临床效果［1］，As2O3在实体瘤方面的治疗也逐渐增多［2］。

As2O3治疗APL的有效浓度是10 μmol/L，而在体外抑制人肝癌细胞株HepG2的有效浓度有可能<5 μmol/L［3］，本研究旨在观察As2O3对人肝癌细胞株HepG2和BEL7402生长的影响，以探讨As2O3对原发性肝癌的作用及其机制，
为寻找有效的肝癌化疗药物提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
肝细胞株HepG2、BEL7402由中山大学细胞库提供，As2O3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司，RPMI 1640培养基购自Gibco 公司，小牛血清购自杭州四季清公司，二甲基亚砜（DMSO，进口分装）。

二氧化碳培养箱(SHELLAB，美国)，酶标仪(Reder，日本)。

1.2 分组
本实验分为HepG2和BEL7402组：分别加入As2O3，终浓度为0(对照组)、0.1、0.5、1、5、10和50 μmol/L，以RPMI1640培养液稀释，观察不同浓度对肝癌细胞株的影响。

1.3 方法
1.3.1 细胞培养
在37 ℃、5%CO2培养箱，用含10%小牛血清及青霉素、链霉素各1×105 U的RPMI1640培养基培养，每2天换一次液，收集对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2 MTT法观察As2O3对肝癌细胞株生长的影响。

取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞为6×104/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL细胞悬液，培养24 h待细胞贴壁后按实验分组加入不同浓度药物，每孔100 μL药物，对照组加入100 μL培养液，每组浓度4个重复孔，放入37 ℃、5%CO2培养箱培养72 h后，每孔加入MTT （5 mg/mL）20 μL，再培养4 h，
弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL振荡溶解10 min，待甲瓒完全溶解后进行比色，在酶标仪以570 nm主波长/690 nm参比波长检测吸光度A值，并计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝［(1-实验组平均A值）/对照组平均A值］×100%。

1.3.3 DNA抽提及电泳
经药物处理96 h的细胞分别加裂解液和蛋白酶K，55 ℃水浴20 min、加RNA酶10 μL作用2 min，酚、氯仿异戊醇各抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，取已抽提好的DNA5 μL，在1.5%琼脂糖凝胶，5 V/cm条件下，电泳3 h，以λDAN Marker Ⅶ为分子标志，302 nm 紫外光透照，观察电泳条带。

1.3.4 流式细胞仪分析
5.0 μmol/L As2O3作用于肝癌细胞株HepG2和BEL7402处理4 d后，离心收集细胞，应用PBS液洗涤2次，加入70%乙醇固定，离心去除上清液，加入200 μL RNA酶在37 ℃处理1 h，然后加800 μL PI染色液放置4 ℃冰箱内30 min以上，应用流式细胞仪检测细胞周期分析。

1.3.5 统计学方法
用SPSS11.0进行方差齐性检验及单因素方差分析。

以P<0.05为有显著性。

2 结果
2.1 不同浓度As2O3对BEL7402、HepG2细胞生长的抑制作用
As2O3在浓度 1.0~50 μmol/L As2O3，抑制肝癌细胞株。