可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究

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VEGF纳米粒的制备及药剂学性质研究

ｏｄｒｔｉｒｖｔｓａｉｔｉｉｏａｄｉｃｅｓｔｔｅａｅｔａｅｆｃＭｅｈｄ：Ｔｅｎｎｐｒｃｅｒｒｐｒｄｂｒｅｏｍｐｏｅｉｔｂｌｙｎｖｖｎｎｒａｅｉｈｒｐｕｉｌｆｔｓｉｓｃｅｔｏｓｈａｏａｔｌｓｗｅｅｐｅａｅｙｉ
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Ａｓｒｃ：ＯｂｅｔｅＴｔｄｈｒｐｒｉｅｈｄｏＶＧａｏａｉｅｎｔｐａｍｃｕｃｌｈｒｃｒｔｓｉｂｔａｔｊｃｉ：ｏｓｙｔｐｅａａｏｍｔｏｆＥＦｎｎｐｒｃｓａｄｉｈｒａｅｔａｃａａｔｉｉｎｖｕｅｔｎｔｌｓｉｅｓｃ
ＶＧＥＦ纳米粒进行药、刺学性质研究。方法：以无毒、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯为材料，用乳化聚合法制备采
ＶＧＥＦ纳米粒，其外观形态、径分布、对粒包封率和载药量以及体外释放进行考察。结果：备了纳米粒胶体溶液及制
、１

ＴｅＶｈＥＧＦｎｎｐｒｉｌｓｗｅｅａｏｌｉｏｕｉｎＭｏｅｔａ５ａｏａｔｅｒｃｌｄｓｌｔ．ｃｏｏｒｈｎ８％ｏｆ
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大尺寸胶原微球的制备

大尺寸胶原微球的制备
制备大尺寸胶原微球通常涉及以下步骤：
1. 准备胶原溶液，首先，需要从动物源（如牛、猪等）提取胶原蛋白。

这通常涉及将动物组织（如皮肤或骨骼）经过一系列化学和物理处理步骤，以获得纯化的胶原蛋白。

然后将胶原蛋白溶解在适当的溶剂中，如酸性溶液（例如乙酸），以制备胶原溶液。

2. 微球形成，胶原溶液可以通过不同的方法形成微球，其中包括乳化、凝胶化、喷雾干燥等。

例如，通过乳化方法，胶原溶液可以被乳化成小液滴，然后通过交联或凝固使其形成微球。

在凝胶化方法中，胶原溶液可以与化学交联剂（如戊二醛）或物理交联剂（如热交联）接触，以形成凝胶微球。

此外，喷雾干燥方法涉及将胶原溶液喷雾成小液滴，然后在干燥过程中形成微球。

3. 微球固化，形成的胶原微球需要进行固化处理，以增强其稳定性和机械性能。

这通常涉及交联或凝固过程，可以使用化学交联剂或物理交联方法，如热交联或冷冻干燥等。

4. 纯化和表征，最后，制备的胶原微球需要进行纯化和表征。

纯化过程可以包括洗涤和离心，以去除未反应的物质和杂质。

然后可以利用显微镜、扫描电镜、动态光散射等技术对微球进行表征，以确定其形貌、粒径分布、表面性质等。

总的来说，制备大尺寸胶原微球涉及胶原溶液的制备、微球形成、固化处理以及纯化和表征等多个步骤。

这些步骤需要仔细控制条件和参数，以获得具有理想性能和稳定性的胶原微球产品。

VEGF—P(HBHO)NPs缓释微球的制备性能及生物学活性检测

论
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ著・
中国当代医药２０１４年６月第２１卷第ｌ６期
ＶＥＧＦ — Ｐ（ＨＢＨＯ）ＮＰｓ缓释微球的制备性能及生物学活性检测
任玮张永红
肖威
陆兴
赵良启
３０００１；２．山西大学生物技术研究所，太原１．山西医科大学第二临床医学院骨科，太原０
ｙｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄａｎｄｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｃｏｐｏｌｙｍｅｒｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｔｈｗｆａｃｔｏｒｎａｎｏｍｅｔｅｒｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｐｒｅｐａｒｅｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｓｌｏｗ－ｒｅｌｅａｓｅｍｉｃｒｏ —
【文献标识码】Ａ
［文章编号】１６７４ — ４７２１（２０１４）０６（ａ）一００１２ — ０５
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＶＥＧＦ —Ｐ

基于胶原的微球及其制备方法和用途[发明专利]

专利名称：基于胶原的微球及其制备方法和用途专利类型：发明专利
发明人：陈佩,陈卓铭,苏国辉
申请号：CN200880106169.8
申请日：20080707
公开号：CN101868298A
公开日：
20101020
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明开发了用于药物递送的包含生物活性分子的ECM微粒的制备方法，其使用改进的乳化方法或油包水相分离方法。

将微球光化学交联来控制生物活性分子的释放，以期更好的药物递送而不损害交联结构的生物相容性。

该方法使用温和的生产条件和简单的工艺，没有植入后可能导致细胞毒性和钙化的有毒化学交联试剂，没有可能降低药物利用度和生物活性的有机溶剂，并且没有剧烈搅拌作用，该作用可使材料碎裂致使形状和机械稳定性差，从而使乳液不稳定。

由此产生的微粒或微球有受控的大小、受控的释放、高生物相容性，并可用于药物递送和细胞培养。

申请人：香港大学
地址：中国香港薄扶林道
国籍：CN
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
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细菌纤维素胶原蛋白多孔微球的制备及性能

第37卷第1期陕西科技大学学报 V o l.37N o.1 2019年2月 J o u r n a l o f S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h n o l o g y F e b.2019* 文章编号:2096-398X(2019)01-0018-07细菌纤维素/胶原蛋白多孔微球的制备及性能张雯1,王学川2*,强涛涛2,李曦月1,高畅1(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;2.陕西科技大学轻工科学与工程学院,陕西西安 710021)摘要:利用M a l a p r a d e反应原理,以高碘酸钠为氧化剂,对细菌纤维素(B a c t e r i a l c e l l u l o s e,B C)进行氧化,制备2,3-二醛细菌纤维素(2,3-d i a l d e h y d e b a c t e r i a c e l l u l o s e,D A B C).利用希夫碱反应使D A B C中的-C HO-与胶原蛋白(c o l l a g e n,C O L)中的-N H2反应,制备C D A B C复合材料.采用反相悬浮再生法将C D A B C制备成B C/C O L多孔微球.以B C/C O L多孔微球载药率为指标,采用单因素及正交实验研究C D A B C质量分数㊁十六烷/(C D A B C/I L)比例㊁乳化时间及乳化温度等因素对微球制备影响.利用F T-I R㊁X R D㊁T G及S E M对B C㊁D A B C㊁C D A B C㊁B C/C O L多孔微球的化学基团㊁结晶度㊁热性能及表面形貌进行分析.结果表明:B C/C O L多孔微球制备最优工艺为:乳化温度35℃,乳化时间5h,十六烷∶(CD A B C/I L)=10∶1,C D A B C质量分数4%.在此工艺下制备B C/C O L多孔微球载药率为254m g/g.F T-I R㊁X R D㊁T G及S E M检测结果表明,B C氧化㊁C D A B C复合均能成功进行,且复合作用对材料的形貌㊁结晶度及热性能均有一定改善作用.采用反相悬浮再生法能够成功制备B C/C O L多孔微球,可为后续药物的负载提供条件.关键词:细菌纤维素/胶原蛋白;反相悬浮再生法;多孔微球中图分类号:T B332 文献标志码:AP r e p a r a t i o na n d p r o p e r t i e s o f b a c t e r i a lc e l l u l o s e/c o l l a g e n p o r o u sm i c r o s p h e r e sZ H A N G W e n1,WA N G X u e-c h u a n2*,Q I A N G T a o-t a o2,L IX i-y u e1,G A O C h a n g1(1.S c h o o l o fF o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n g,S h a a n x iU n i v e r s i t y o fS c i e n c e&T e c h n o l o g y,X i'a n710021,C h i n a;2.C o l l e g e o fB i o r e s o u r c e sC h e m i c a l a n dM a t e r i a l sE n g i n e e r i n g,S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h-n o l o g y,X i'a n710021,C h i n a)A b s t r a c t:I n t h i s s t u d y,B a c t e r i a l c e l l u l o s e(B C)w a s o x i d i z e d t o2,3-d i a l d e h y d e b a c t e r i a c e l l u-l o s e(D A B C)t h r o u g hM a l a p r a d e r e a c t i o n.T h e nB C/C O L c o m p o s i t em a t e r i a l s(CD A B C)w a s p r e p a r e db y D A B Ca n d c o l l a g e n(C O L)t h r o u g hs c h i f f'sb a s e r e a c t i o n.A n dB C/C O L p o r o u sm i c r o s p h e r e sw a s p r e p a r e dw i t hC D A B Cb y r e v e r s e d-p h a s e s u s p e n s i o n r e g e n e r a t i o nm e t h o d.*收稿日期:2018-08-27基金项目:陕西省科技厅农业科技攻关计划项目(2016N Y-156);西安市未央区科技计划项目(201606)作者简介:张雯(1982-),女,陕西汉中人,副教授,研究方向:生物制药通讯作者:王学川(1963-),男,山西芮城人,教授,博士生导师,研究方向:绿色化学品的合成理论及其作用机理,158********@ 163.c o mCopyright©博看网 . All Rights Reserved.第1期张雯等:细菌纤维素/胶原蛋白多孔微球的制备及性能D u r i n g w h i c h,w i t hd r u g-l o a d i n g r a t ea sa n i n d e x,C D A B C m a s s f r a c t i o n,h e x a d e c a n e/(C D-A B C/I L)r a t i o,e m u l s i f y i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r ew e r e o p t i m i z e du s i n g s i n g l e f a c t o r a n do r-t h o g o n a le x p e r i m e n t s.T h ec h e m i c a l g r o u p s,c r y s t a l l i n i t y,t h e r m a l p r o p e r t i e sa n ds u r f a c e m o r p h o l o g y o f B C,D A B C,C D A B C,B C/C O L p o r o u sm i c r o s p h e r e sw e r e a n a l y z e db y F T-I R, X R D,T Ga n dS E M r e s p e c t i v e l y.T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h eo p t i m a l p r e p a r i n gp r o c e s so fB C/C O L p o r o u s m i c r o s p h e r e sw a sd e t e r m i n e da s f o l l o w s:CD A B C m a s s f r a c t i o n w a s4%,h e x a d e c a n e/(C D A B C/I L)r a t i ow a s10∶1,e m u l s i f y i n g t i m ew a s5ha n de m u l s i f y i n g t e m-p e r a t u r ew a s35℃.F T-I R,X R D,T Ga n dS E M r e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hB Co x i d a t i o na n dC D A B C p r e p a r a t i o nc a nb es u c c e s s f u l l y c a r r i e do u t,a n dt h e m o r p h o l o g y,c r y s t a l l i n i t y a n dt h e r m a l p r o p e r t i e s o fm a t e r i a l sc a nb e i m p r o v e dt h r o u g hc o m p o s i t i o n.B C/C O L p o r o u sm i-c r o s p h e r e s c a nb e p r e p a r e ds u c c e s s f u l l y b y r e v e r s e d-p h a s e s u s p e n s i o nr e g e n e r a t i o n m e t h o d,w h i c hc a n p r o v i d e c o n d i t i o n s f o r s u b s e q u e n t d r u g l o a d i n g.K e y w o r d s:b a c t e r i a lc e l l u l o s e/c o l l a g e n;r e v e r s e d-p h a s es u s p e n s i o n r e g e n e r a t i o n m e t h o d;p o r o u sm i c r o s p h e r e s0 引言组织工程作为一门研究和开发具有修复和改善损伤组织功能生物替代物的新兴科学,在组织修复㊁器官修复重建方面发挥着举足轻重的作用.该技术目前在骨组织工程㊁人造血管㊁人造皮肤等领域备受关注.其中作为体外细胞培养载体的新型支架材料也成为了研究热点.目前主要的支架形式有水凝胶[1]㊁纤维[2]和多孔结构[3]3种.其中,多孔微球作为一种重要的新型材料,具有密度低㊁比表面积大㊁稳定性好和表面渗透能力强等特点[4].与传统细胞培养方法相比,能更好地模拟复杂的生理环境,便于悬浮培养和提高细胞的表达水平[5],因此是目前公认的最有发展前途的一种组织工程支架,并且已经应用于细胞的大量培养中[6,7].胶原蛋白(C o l l a g e n,C O L)是细胞外基质和连接组织(包括韧带㊁腱㊁软骨㊁骨㊁角膜和皮肤等)的主要成分,一般呈网络状或纤维状,提供物理支撑以维持细胞和组织的结构完整性[8].胶原蛋白基复合材料由于其优良的生物相容性和生物可降解性,在组织工程支架㊁伤口敷料㊁人造血管㊁人造皮肤等生物医学领域有着广泛应用.在实际应用过程中,可通过交联㊁混入其它天然和合成高分子或功能无机物等方法制备复合材料,以增强其力学强度,提高热性能以及生物稳定性,进而实现更多的结构和功能调控[8].细菌纤维素(B a c t e r i a l c e l l u l o s e,B C)是指由生长在液态含糖基质中的细菌产生,并分泌到基质中的纤维素,是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物.B C具有高结晶度㊁高持水性㊁三维网状结构㊁高抗张强度和弹性模量等特性[9],同时还具有良好的生物相容性[10,11]和可降解性[12,13],目前已成为国际上新型组织工程材料的研究热点.基于组织工程技术在医药领域的巨大应用前景,以及C O L-B C基多孔微球作为组织支架所具有的优势,本研究以C O L和B C为基体,进行C O L㊁B C的复合,制备B C/C O L多孔微球,并对其性能进行研究,为其应用于组织工程支架奠定基础.1 实验部分1.1 材料1.1.1 菌种木醋杆菌(A c e t o b a c t e rX y l i n u m),陕西科技大学制药工程实验室提供.1.1.2 培养基(1)种子培养基:蔗糖6%,牛肉膏1.5%, N a2H P O40.44%,柠檬酸0.08%,无水乙醇1.0%.(2)发酵培养基:蔗糖6%,牛肉膏1.5%, N a2H P O40.44%,柠檬酸0.08%,琼脂1.8%,无水乙醇1.0%.其余试剂均采用国产分析纯或生化试剂.1.2 仪器设备S-4800电镜扫描仪,日本日立公司;D/m a x2200P C 全自动X-射线衍射仪,日本R i g a l c u;V E R T E X70傅立叶变换红外光谱仪,德国B r u c h e r公司;S T A449F3-1053-M热重分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;马尔文M S2000激光粒度仪,英国M a s t e r s i z e r;M G250B恒温培㊃91㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.陕西科技大学学报第37卷养箱㊁H Y G-1A恒温振荡器,上海新瑞仪器有限公司.1.3 实验方法1.3.1 B S A含量测定分光光度法.1.3.2 F I I R检测将B C膜㊁C O L膜和B C/C O L复合膜,在V E R T E X70傅立叶变换红外光谱仪上进行测定.波数范围:600~4000c m-1,波数精度:0.01c m-1,分辨率:优于0.09c m-1.1.3.3 X R D测定采用D/m a x2200P C X射线衍射仪分析B C 膜㊁C O L膜和B C/C O L复合膜结晶结构,工作电压40k V,电流20m A,λ=0.154n m,C u靶,N i过滤片,扫描速度8°/m i n,扫描范围5°到60°,步长0.02°.1.3.4 S E M测定将干燥B C膜㊁C O L膜和B C/C O L复合膜进行喷金处理,用S-4800型扫描电子显微镜进行观察并拍照.1.3.5 热稳定性(T G-D S C)分析采用S T A449F3型的热分析仪分析B C膜㊁C O L膜和B C/C O L复合膜热稳定性,测试条件温度范围0~800℃,升降温速率10℃/m i n,称量范围5~10m g(小样品坩埚),氮气气氛.1.4 B C发酵利用A c e t o b a c t e rX y l i n u m发酵制备B C,分别进行斜面培养(30℃恒温培养箱中培养2~3d)㊁种子液制备(30℃恒温培养箱中培养1d,培养液置于30℃,160r/m i n摇床震荡30m i n释放菌体细胞)㊁发酵培养(装液量30m L/250m L三角瓶,接种量20%,30℃恒温培养箱中静置培养).发酵结束后取B C膜用去离子反复冲洗,直到p H为7.0,冷冻干燥[13].1.5 B C/C O L复合膜的制备1.5.1 D A B C的制备称取1g B C悬浮于250m L去离子水中,高速匀浆机匀浆后转移至500m L圆底烧瓶中,加入0.5g高碘酸钠,锡箔纸包裹,50℃下氧化10h.反应结束后抽滤,沉淀中加入50m L0.1m o l/L乙二醇溶液继续反应1h,反应结束后抽滤,去离子水洗涤沉淀物5次,收集沉淀,冷冻干燥得D A B C[1].1.5.2 C D A B C的制备称取1.5g胶原蛋白分散于180m L去离子水中,45℃水浴缓慢搅拌至体系均匀得C O L凝胶液,继续水浴1h.取0.5g D A B C分散于180m L 去离子水中,45℃水浴1h.C O L凝胶液与D A B C 分散液混合,玻璃棒缓慢搅拌20m i n.混合凝胶室温下抽滤,45℃热水反复洗涤沉淀物去除未反应C O L,冷冻干燥得CD A B C复合材料.1.6 B C/C O L多孔微球制备称取一定质量C D A B C,90℃下溶解于5g离子液中,得C D A B C/I L溶液.按一定比例混合I L 相(C D A B C/I L溶液)与有机相(十六烷),加入复合表面活性剂(司盘∶吐温=1∶1),一定温度下搅拌乳化形成乳液.在乳液中加入正丁醇50m L,搅拌3h后静置2h,待沉淀完全,抽滤收集微球沉淀.依次采用50m L正丁醇,50m L丙酮,50m L 蒸馏水洗涤微球,冷冻干燥得B C/C O L多孔微球.在实验过程中,考察C D A B C质量分数分别为3%㊁4%㊁5%㊁6%㊁7%,十六烷∶(C D A B C/I L)分别为4∶1㊁6∶1㊁8∶1㊁10∶1㊁12∶1,乳化时间分别为1h㊁2h㊁3h㊁4h㊁5h,乳化温度分别为25℃㊁35℃㊁45℃㊁55℃㊁65℃等时对B C/C O L多孔微球载药性能的影响.根据单因素实验结果选择合适的因素水平进行正交试验.1.7 B C/C O L多孔微球的性能利用F T I R㊁X R D㊁S E M㊁T G-D S C检测技术分别对B C㊁D A B C㊁C D A B C和B C/C O L多孔微球进行现代分析仪器检测,研究其材料学特性.2 结果与讨论2.1 B C/C O L多孔微球制备工艺2.1.1 B C/C O L多孔微球制备工艺单因素实验结果B C/C O L多孔微球制备工艺单因素实验结果如图1~8所示.图1及图2所示为CD A B C质量分数对B C/C O L多孔微球制备的影响.由图1可以看出,随着C D A B C质量分数的增加,B C/C O L 多孔微球载药率呈先上升后下降的趋势,当C D-A B C的质量分数为4%时,B C/C O L多孔微球载药率最高.由图2粒径分析可知,C D A B C的质量分数为4%时所制备的B C/C O L多孔微球粒径最接近正态分布,说明此条件下所制备多孔微球形态规整,分布均匀.质量分数过低或过高时,易导致所制备多孔微球球体不完整,或内部结构过于致密,影响其载药性能.㊃02㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.第1期张雯等:细菌纤维素/胶原蛋白多孔微球的制备及性能图1 C D A B C 质量分数对B C /C O L多孔微球制备的影响图2 不同C D A B C 质量制备B C /C O L多孔微球粒径分析图3及图4所示为乳化时间及乳化温度对B C/C O L 多孔微球制备的影响.微球制备过程中,C D -A B C /I L 溶液以液滴的形式分散于十六烷相,该稳定W /O 乳液的形成对微球的制备起决定性作用.乳化过程中,乳化时间和乳化温度对乳液稳定性均有影响.由图3及图4可知,乳化时间小于4h ,乳化温度高于35℃均不利于稳定乳液的形成,继而影响微球载药性能.图5及图6所示,微球粒径分布也表明在此较优工艺下所制备的B C /C O L 多孔微球粒径均匀,呈正态分布,与载药效果一致.图3 乳化时间对B C /C O L 多孔微球制备的影响图4 乳化温度对B C /C O L 多孔微球制备的影响图5 不同乳化时间制备B C /C O L多孔微球粒径分析图6 不同乳化温度制备B C /C O L多孔微球粒径分析图7㊁图8所示为十六烷/(C D A B C /I L )比例对B C /C O L 多孔微球制备的影响.实验结果表明,十六烷∶(C D A B C /I L )为10∶1时,B C /C O L 多孔微球载药率较高,微球粒径分布效果较好,说明此工艺下所形成的W /O 乳液稳定性较好,所制备微球性能良好.㊃12㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.陕西科技大学学报第37卷图7 十六烷∶(C D A B C /I L )对B C /C O L多孔微球制备的影响图8 不同十六烷∶(C D A B C /I L )比例制备B C /C O L 多孔微球粒径分析2.1.2 B C /C O L 多孔微球制备工艺正交试验结果根据单因素实验结果设计正交试验,如表1所示.表1 正交试验设计水平乳化温度(A )/℃乳化时间(B )/h 十六烷∶(C D A B C /I L )(C )C D A B C质量分数(D )/%13038∶13235410∶14340512∶15正交试验结果如表2所示.试验结果表明,对B C /C O L 多孔微球制备影响显著性依次为C D -A B C 质量分数>十六烷∶(C D A B C /I L )>乳化温度>乳化时间.最优工艺为A 2B 3C 2D 2,即乳化温度35℃,乳化时间5h ,十六烷∶(C D A B C /I L )=10∶1,C D A B C 质量分数4%.在此工艺下制备B C /C O L 多孔微球,其载药率为254m g /g.表2 正交试验结果及分析实验号因素A /℃B /h CD /%载药率/(m g /g )11111772122221531333764212311252231986231215373132109832136593321176K 1799998117K 2121126168159K 3621359484R593674752.2 B C /C O L 多孔微球的性能2.2.1 红外光谱分析(F T -I R )图9所示为B C ㊁C O L ㊁D A B C ㊁C D A B C 及B C /C O L 多孔微球红外图谱.B C [14]的红外图谱中3354c m -1处为O-H 的伸缩振动吸收峰,说明分子中含有大量的-O H ;2885c m -1附近为C -H伸缩振动吸收峰;1419c m -1㊁1311c m -1附近为C -H 弯曲振动特征峰;1103c m -1㊁1055c m -1以及1031c m -1处为醇中的C -O 的伸缩振动特征峰[13].图谱所示B C 可能存在的有机化合物基团有:-O H ㊁-C H 2㊁C-H ㊁C-O 等,与标准B C 的结构相符合.C O L 的红外图谱中[15],1659c m -1为酰胺I 的吸收峰,1552c m -1为酰胺I I 吸收峰,1240c m -1为酰胺Ⅲ吸收峰,谱带酰胺Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ谱带为胶原蛋白的特征吸收峰,这表明C O L 三股螺旋结构的存在.D A B C 的红外图谱中,2721c m -1是醛基C -H 键的吸收峰,1728c m -1是C=O 键的特征吸收峰,表明B C 中部分-O H 被氧化成了醛基.C D A B C 红外图谱中,3348c m -1处的吸收峰反映了分子间氢键引起的-C HO 基的伸缩振动,1690~1590c m -1之间的吸收峰是由-C =N-的振动引起的,1541c m -1为-N H 的变形振动,1300~1000c m -1之间的吸收峰是由醚的伸缩振动引起的,670c m -1为N-H 面外弯曲振动,证明了C D A B C 的生成.B C /C O L 多孔微球红外图谱与C D A B C 红外图谱相似,表明微球制备过程中仅为材料形态的改变,无化学反应发生.2.2.2 X 射线衍射仪分析(X R D )图10为B C ㊁C O L ㊁D A B C ㊁C D A B C 及B C /C O L 多孔微球的X R D 图谱.由图10可知,B C 图谱分别在14.40°㊁16.68°㊁22.52°处有三个主要的衍㊃22㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.第1期张雯等:细菌纤维素/胶原蛋白多孔微球的制备及性能射峰,这是B C的特征峰,分别对应于(110)㊁(110)㊁(200)晶面,表明B C具有纤维素I型结晶结构[16].C O L的X R D特征衍射峰分别显现在7.84°和20.72°处.D A B C与B C衍射峰基本相同,说明氧化后的B C内部晶体结构基本被保留,但氧化过程降低了其结晶度.C D A B C的X R D图谱与C O L和D A B C曲线叠加并不完全一致,表明D A B C与C O L复合过程不是简单的机械混合,而是存在物理化学作用.B C/C O L多孔微球X R D图谱与C D A B C基本一致,表明微球制备过程并不改变材料的结晶性能.图9 B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/C O L 多孔微球红外图谱图10 B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/C O L多孔微球X R D图谱2.2.3 热稳定性(T G)分析图11㊁图12分别为B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C 及B C/C O L多孔微球的T G曲线及D T G曲线.由图11㊁12可知,B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/ C O L多孔微球均存在三个明显的热分解阶段,第一阶段中,B C热失重率最小为4%,C O L最大为12%;第二阶段为主要热失重阶段,B C热失重率为61%,C O L为70%;第三阶段各组分热失重速率均显著降低.图11 B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/C O L多孔微球T G 曲线图12 B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/C O L多孔微球D T G曲线由表3可知,最大失重值温度依次为B C(351℃)>B C/C O L多孔微球(344℃)>C D A B C(332℃)>D A B C(327℃)>C O L(309℃).上述实验结果表明,B C氧化后发生了热性质的变化,可能是因氧化后B C自身发生降解,小分子链段增加,导致了加热分解过程中所需要的热量减少,故热分解温度降低.B C较C O L具有良好的热稳定性,B C 与C O L的复合能够改善C O L热性能.表3 T G和D T G曲线特征数据分析样品快速降解温度/℃最大失重值温度/℃B C270~370351C O L230~420309D A B C260~350327C D A B C260~350332B C/C O L多孔微球280~3703442.2.4 扫描电子显微镜(S E M)图13所示为B C㊁C O L㊁D A B C㊁C D A B C及B C/C O L多孔微球的S E M图谱.由图13(a)㊁(b)可知,B C由高密度纳米微纤维相互缠绕形成,具有清晰的三维网状结构;图13(c)㊁(d)所示B C氧化形成的D A B C由于部分链段断裂,纤维发生卷曲,纤维排布变得混乱,但仍具有三维立体网状结构;㊃32㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.陕西科技大学学报第37卷图13(e )㊁(f )所示C O L 结构致密,无孔状分布,S E M 显示其具有一定的纤维结构;图13(g )㊁(h )所示C O L 与D A B C 复合后,B C 中的部分孔隙被C O L 所填充,所形成CD A B C 孔隙率较复合前降低,但仍呈现立体网状结构;图13(i )㊁(j )表明,采用反相悬浮再生法能够成功制备B C /C O L 多孔微球.微球形态较为圆整,其中有大量孔道分布,可为后续药物的负载提供空间.(a )5000倍B C (b )20000倍BC(c )5000倍D A B C (d )20000倍D A BC(e )5000倍C O L (f )10000倍C OL(g)5000倍C D A B C (h )10000倍C D A BC (i )1000倍多孔微球 (j )3000倍多孔微球图13 B C ㊁C O L ㊁D A B C ㊁C D A B C 及B C /C O L 多孔微球SE M 图谱3 结论研究利用M a l a pr a d e 反应原理,以高碘酸钠为氧化剂,B C 进行氧化制备D A B C .利用希夫碱反应使D A B C 中的-C HO-与C O L 中的-N H 2反应,制备C D A B C 复合材料.采用反相悬浮再生法将C D A B C 制备成B C /C O L 多孔微球.B C /C O L 多孔微球制备最优工艺为:乳化温度35℃,乳化时间5h ,十六烷∶(C D A B C /I L )=10∶1,C D A B C 质量分数4%.在此工艺下制备B C /C O L 多孔微球载药率为254m g /g .利用F T -I R ㊁X R D ㊁T G 及S E M 对B C ㊁D A B C ㊁C D A B C ㊁B C /C O L 多孔微球的化学基团㊁结晶度㊁热性能㊁及表面形貌进行分析,表明B C 氧化㊁C D -A B C 复合均能成功进行,且复合作用对材料的形貌㊁结晶度及热性能均有一定改善作用.采用反相悬浮再生法能够成功制备B C /C O L 多孔微球,可为后续药物的负载提供条件.参考文献[1]N i l s a n g S ,N e h r uV ,P l i e v aF M ,e t a l .T h r e e -d i me n s i o n a l c u l t u r ef o rm o n o c l o n a l a n t i b o d yp r o d u c t i o nb y h y b r i d o m a c e l l s i mm o b i l i z e di n m a c r o p o r o u sg e l p a r t i c l e s [J ].B i o -t e c h n o l o g y P r o gr e s s ,2008,24(5):1122-1131.[2]徐飞,王大伟,陈双峰,等.电纺P L L A /P V P 纳米纤维膜材料用于血管组织工程的前期研究[J ].东南大学学报(医学版),2011,30(3):391-401.[3]K a u s h a iS ,A m i e iG E ,G u i e s r i a n K J ,e ta l .F u n c t i o n a ls m a l l -d i a m e t e rn e o v e s s e l sc r e a t e du s i n g e n d o t h e l i a l p r o -g e n i t o r c e l l s e x pa n d e d e x v i v o [J ].N a t u r eM e d i c i n e ,2001,7(9):1035-1040.[4]杨晓霞,奕玉霞,蔡晓青,等.多孔微球在医药领域的应用[J ].药物生物技术,2011,18(5):449-452.[5]张启英,张天柱,胡克,等.多孔微球在三维细胞培养中的研究进展[J ].东南大学学报(医学版),2013,32(1):90-94.[6]M a l d aJ ,F r o n d o z aC G.M i c r o -c a r r i e r s i nt h ee n g i n e e r i n g o f c a r t i l a ge a n db o n e [J ].T r e n d sB i o t e c h n o l ,2006,24(7):299-304.[7]刘国诠.生物工程下游技术[M ].北京:化学工业出版社,2003.[8]文建川,姚晋荣,邵正中.非生理活性蛋白质的研究进展及其在材料领域中的应用[J ].高分子学报,2011(1):12-23.[9]D u g a nJ M ,G o u ghJE ,E i c h h o r nSJ .B a c t e r i a l c e l l u l o s e s c a f f o l d s a n d c e l l u l o s e n a n o w h i s k e r s f o r t i s s u e e n g i n e e r i n g [J ].N a n oM e d i c i n e (L o n d ),2013,8(2):287-298.[10]E s g u e r r aM ,F i n kH ,L a s c h k eM W ,e t a l .I n t r a v i t a l f l u o -r e s c e n t m i c r o s c o p i ce v a l u a t i o no fb a c t e r i a lc e l l u l o s ea s s c a f f o l d f o r v a s c u l a r g r a f t s [J ].J o u r n a l o f B i o m e d i c a lM a -t e r i a l sR e s e a r c hP a r tA ,2010,93(1):140-149.[11]李扬,沈建成,徐枫,等.纳米细菌纤维素的细胞生物相容性[J ].中国组织工程研究,2012,16(51):9541-9545.[12]王宗良,贾原媛,石毅,等.纳米细菌纤维素膜的表征与生物相容性研究[J ].高等学校化学学报,2009,30(8):1553-1558.(下转第58页)㊃42㊃Copyright©博看网 . All Rights Reserved.陕西科技大学学报第37卷双重P C R 检测[J ].陕西科技大学学报,2018,36(1):34-38,44.[3]张晓旭,葛武鹏,李宝宝,等.牛羊乳混掺检测鉴别技术研究进展[J ].食品安全质量检测学报,2015,6(9):3594-3601.[4]P o o n i aA ,J h aA ,S h a r m aR ,e t a l .D e t e c t i o n o f a d u l t e r a t i o ni nm i l k :Ar e v i e w [J ].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o fD a i r y T e c h -n o l o g y,2017,70(1):23-42.[5]P e s i cM ,B a r a cM ,V r v i cM ,e t a l .Q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a -t i v e a n a l y s i s o f b o v i n em i l ka d u l t e r a t i o n i nc a p r i n e a n do -v i n em i l k s u s i n g n a t i v e -P A G E [J ].F o o dC h e m i s t r y ,2011,125(4):1443-1449.[6]R e b e c h i SR ,V e l e z M A ,V a i r aS .A d u l t e r a t i o no f a r g e n -t i n e a nm i l k f a t sw i t ha n i m a l f a t s :D e t e c t i o nb y f a t t y a c i d s a n a l y s i s a n d m u l t i v a r i a t er e g r e s s i o nt e c h n i q u e s [J ].F o o d C h e m i s t r y ,2016,192:1025-1032.[7]赵新淮,于国萍,张永忠,等.乳品化学[M ].北京:科学出版社,2007.[8]辛厚文,候中怀.非线性化学[M ].2版.合肥:中国科技大学出版社,2009.[9]冯长根,曾庆轩.化学振荡混沌与化学波[M ].北京:北京理工大学出版社,2003.[10]Z h a n g T M ,Z h a oZ ,F a n g X Q ,e t a l .D e t e r m i n i n g m e t h -o d ,c o n d i t i o n a l f a c t o r s ,t r a i t sa n da p p l i c a t i o n so fn o n l i n -e a rc h e m i s t r y f i n g e r p r i n tb y u s i n g d i s s i p a t i v ec o m p o -n e n t s i n s a m p l e s [J ].S c i ,C h i n aC h e m ,2012,55(2):285-303.[11]R e n J ,Z h a n g XY ,G a o J Z .e t a l .T h e a p p l i c a t i o n o f o s c i l -l a t i n g c h e m i c a l r e a c t i o n s t o a n a l y t i c a l d e t e r m i n a t i o n s [J ].C e n t r a lE u r o p e a nJ o u r n a lo fC h e m i s t r y,2013,11(7):1023-1031.[12]R a o o f JB ,A b o l f a z lK ,R e z aO ,e t a l .D e t e r m i n a t i o no f l -c y s t e i n e b a s ed o n i t s p o te n t i o m e t r i c ef f e c t o n aB e l o u s o v -Z h a b o t i n s k i io s c i l l a t i ng ch e mi c a lr e a c t i o n [J ].I n t e r n a -t i o n a l J o u r n a lo fE l e c t r o c h e m i c a lS c i e n c e ,2011,6(6):1760-1771.[13]M aYJ ,D o n g W B ,B a o H L ,e t a l .S i m u l t a n e o u sd e t e r -m i n a t i o n o f u r e a a n dm e l a m i n e i nm i l k p o w d e r b y n o n l i n -e a r c h e m i c a lf i ng e r p r i n t t e ch ni q u e [J ].F o o dC h e m i s t r y .2017,221:898-906.[14]汤宏敏,罗永明,鄢燕,等.一种基于D A D 二极管阵列检测器技术的中药指纹图谱方法[J ].高等学校化学学报,2009,30(2):279-282.[15]毕云枫,刘舒,李雪等.乌头类生物碱组分在C Y P 450中的代谢指纹图谱及对C Y P 450活性的影响[J ].高等学校化学学报,2013,34(9):2084-2089.[16]王世鹏,董文宾,樊成,等.非线性化学指纹图谱技术在食品掺假检测中的应用[J ].食品研究与开发,2016,37(1):204-207.[17]张娟,钟俊辉,王志沛,等.用非线性电化学指纹图谱技术鉴别啤酒品种[J ].酿酒科技,2014(8):99-104.[18]马永杰,董文宾,樊成,等.乳粉中钙含量的非线性化学指纹图谱法测定[J ].农业机械学报,2016,47(1):202-208.[19]F a n g X Q ,Z h a n g T M ,Z h a oZ ,e t a l .A p p l i c a t i o no f n o n -l i n e a r c h e m i c a l f i n g e r p r i n t i n g t o i d e n t i f i c a t i o n ,e v a l u a t i o n a n d c l i n i c a l u s e o fG l y c y r r h i z a [J ].C h i n e s e S c i e n c eB u l l e -t i n ,2010,55(26):2937-2944.[20]李继睿,丁峰,禹练英.电化学指纹图谱用于中药的质量控制[J ].现代仪器,2011,17(2):77-79.[21]白云慧,张泰铭,张凤清.利用非线性化学指纹图谱鉴别人参真伪和产地[J ].食品工业科技,2015,36(13):302-308.[22]王二丹,鲁利利,张泰铭,等.采用非线性化学指纹图谱技术测定羊奶中掺杂牛奶的含量[J ].食品与发酵工业,2015,41(3):199-203.[23]马永杰,董文宾,樊成,等.基于非线性化学指纹图谱技术测定婴幼儿羊奶粉中掺假牛奶粉含量[J ].分析科学学报,2016,32(1):43-47.【责任编辑:蒋亚儒】(上接第24页)[13]陈艳梅,奚廷斐,郑琪,等.细菌纤维素的体内降解及其组织相容性[J ].科技导报,2009,27(21):61-66.[14]D a s h R ,F o s t o n M ,R a g a u s k a sAJ .I m p r o v i n g t h e m e -c h a n i c a la nd t he r m a l p r o p e r t i e s ofg e l a t i nh y d r o g e l s c r o s s -li n k e db y c e l l u l o s en a n o w h i s k e r s [J ].C a r b o h y d r a t e P o l ym e r s ,2013(91):638-645.[15]D o y l eBB ,B e n d i tEG ,B l o u tER.I n f r a r e d s p e c t r o s c o p yo f c o l l a g e na n dc o l l a g e n -l i k e p o l y p e p t i d e s [J ].B i o p o l y -m e r s ,1975,14(5):937-957.[16]P e iY ,Y a n g J ,L i uP ,e ta l .F a b r i c a t i o n ,p r o pe r t i e sa n d b i o a p p l i c a t i o n s of c e l l u l o s e -c o l l ag e nh y d r o l y s a t e c o m p o s -i t e f i l m s [J ].C a r b o h y d r a t eP o l y m e r s ,2013,92:1752-1760.【责任编辑:蒋亚儒】㊃85㊃Copyright©博看网 . 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大尺寸胶原微球的制备

大尺寸胶原微球的制备
胶原微球是一种生物材料，具有广泛的应用潜力。

近年来，人们对胶原微球的制备方法进行了深入研究，希望能够获得大尺寸的胶原微球，以满足不同领域的需求。

胶原微球的制备方法通常包括两个主要步骤：胶原溶液的制备和胶原微球的成型。

首先，胶原溶液需要通过酸解或酶解方法从动物组织中提取出来。

然后，将提取得到的胶原溶液进行调整，以获得适合成型的浓度和粘度。

在成型过程中，可以使用不同的方法来制备大尺寸的胶原微球。

一种常用的方法是通过离子凝胶化反应来形成胶原微球。

在这种方法中，将胶原溶液滴入含有离子交联剂的溶液中，形成胶原微球的凝胶结构。

通过调整离子交联剂的浓度和pH值，可以控制胶原微球的尺寸和形态。

除了离子凝胶化反应，还可以通过乳化、喷雾干燥、喷雾冷冻等方法来制备大尺寸的胶原微球。

这些方法利用了液滴的形成和固化过程，通过控制液滴的大小和固化条件，可以得到具有不同尺寸和形态的胶原微球。

制备大尺寸胶原微球的关键是控制胶原溶液的浓度和粘度，以及调整成型方法和条件。

此外，为了提高胶原微球的生物相容性和稳定性，还可以将其他生物材料或药物纳入胶原微球中，以实现多功能
性的应用。

制备大尺寸胶原微球是一项复杂而有挑战性的工作。

通过研究不同的制备方法和条件，可以获得具有理想尺寸和形态的胶原微球，为其在生物医学、组织工程和药物传递等领域的应用提供基础。

希望未来能够进一步深入研究，提高制备技术的稳定性和可控性，为胶原微球的应用开辟更广阔的前景。

生长因子缓释微球的制备及其对内皮细胞的影响

生长因子缓释微球的制备及其对内皮细胞的影响目的：制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子（VEGF）可降解缓释微球,考察其生物活性的保存情况及它们对内皮细胞的作用。

方法：采用改良的乳化冷凝法交聯制备复合bFGF、VEGF 的明胶缓释微球,将它们加入内皮细胞的培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)测定细胞增殖情况。

结果：复合bFGF、VEGF的缓释微球平均粒径（11.32±3.64）μm;培养1天后各组细胞计数、吸光度(A)值差异均无显著性;5天后两种生长因子缓释微球组细胞计数、吸光度(A)值明显高于对照组;7天后两种生长因子缓释微球组值仍高于其它组。

结论：复合bFGF、VEGF的缓释微球制备工艺简便,具有良好的缓释活性能较长时间地持续释放活性bFGF、VEGF,可明显促进内皮细胞的增殖。

Abstract:ObjectiveTo prepare the bFGF、VEGF- impregnated microsphere and to investigate its bioactivity and its effect on endothelials.MethodsThe bFGF、VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and was added to the RPMI 1640 medium. The proliferation of cultured endothelials were measured by cell counting and MTT method.ResultsThe average diameter of microsphere was(11.32±3.64)μm; the in vitro cellular study showed no significant difference in the cell number and cell viability of 4 groups 1 day after plate culture. The cell number and cell viability in bFGF、VEGF - impregnated microsphere group were more than those in other groups 5 days after plate culture. 7days after plate culture,the cell number and cell viability in bFGF、VEGF - impregnated microsphere group were still higher.ConclusionThe preparing method is simple and accurate , the bFGF、VEGF- impregnated microsphere can promote the proliferation of endothelials through a long period ofbFGF、VEGF sustained - release.Key words:fibroblast growth factors;vascular endothelial growth factors;microspheres;gelatin;sustained-release system; endothelial cells组织移植是整形外科常用的治疗手段之一, 用于各种组织缺损的修复，也可以作为组织填充的材料，改善患者的外貌和体形。

利用大肠杆菌表达系统制备抗VEGF螺旋-环-螺旋多肽及其纯化的研究

1.3融合标签的切割
同时根据SUMO蛋白酶加入的试验设计，结果显示加入SUMO蛋白酶进行酶切的标签都达到了切
1 结果与分析
M123 4
1.1抗 VEGF基因 M4 9 扩增
以抗 VEGF基因 M4 9 为模版进行 PCR扩增。
31.0 kD
电泳结果显示，扩增的基因片段与预期的大小一致
图 2 纯化融合蛋白的SDS-PAGE分析注：1 ,6 :总蛋白；2 ,7 :上清；3 ,8 :流穿液；4 ,9 :洗脱液；5,10,11: T rx -V E G E 融合蛋白 Figure 2 SDS-PAGE of purified trx-fusion peptides Note: 1,6: Total protein; 2,7: Supernatant; 3,8: Flowthrough; 4,9: Washing; 5,10,11: Trx-VEGE fusion protein
Tnc标签与多肽的分子量估算，获得的融合蛋白其分子量大概在22 kD,并对相关的收集液进行SDA-PAGE 检测，结果显示通过初步纯化后，测量后融合蛋白分子量 22 kD与预期大小一致(图3)。
式，同时在此基础上探索多种最有效的方式获取纯化多肽，为下一步抗VEGF螺旋 -环 -螺旋多肽药物研究获取大量数据。
A b s t r a c t V a s c u l a r endothelial g r o w t h factor (V E G F ) is the m o s t p o w e r f u l a n d highly specific factor for v a s c u lar g r o w t h that c a n i n d u c e the t u m o r a n g i o g e n e s i s . In this e x p e r i m e n t , a n t i - V E G F helix-loop-helix polypeptide g e n e M4 9 w a s amplified b y P C R to get the target g e n e . T h e n the prokaryotic expression p l a s m i d with vector p E T ~32a (+) w a s constructed a n d t r a n s f o r m e d into Escherichia coli T h e expression o f target g e n e w a s i n d u c e d a n d the prod u c t s w e r e purified.T h e results s h o w e d that 186 b p g e n e f r a g m e n t s w e r e o b t a i n e d b y P C R a n d a b o u t 22 k D o f fusion protein w a s obtained after the inducible e x pression. C l e a v a g e d the tag b y S U M O protease, a p p r o x i m a t e l y 3.5 k D o f the target protein w a s o b t a i n e d . T h e administration e x p e r i m e n t in m i c e c o n f i r m e d the function o f the target protein, so as to provide necessary conditions for the further study a n d d e v e l o p m e n t o f the target d r u g that is a n t i - V E G F helix-loop-helix p o l y p e p t i d e . K e y w o r d s A n t i - V E G F peptide;Escherichia coli expression s y s t e m ;Peptide purification

VEGF纳米粒的制备及药剂学性质研究

督
数码照片，清晰度欠佳，但从电镜照片中依然可见所制
帐
霎
备的ＶＥＧＦ纳米粒呈球形或类球形，不粘连。粒径分布
躲
结果显示制备的ＶＥＧＦ纳米粒大小较均匀，粒径分布范
同较窄。包封率、载药量及体外释放测定等各项结果均
Ｏ
显示，以聚氰基丙烯酸酯为材料，采用乳化聚合法制备
的ＶＥＧＦ纳米粒取得成功，具有明显的缓释效果。
ｉｎｉｔｉａｌＶＥＧＦｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｅｎｔｒａｐｐｅｄｉｎｔｏｔｈｅＶＥＧＦｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｙａｎｄｔｈｅｓｉｚｅ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＶＥＧＦｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｍａｌｌｓｐｈｅｒｉｃａｌ０１１ｓｉｍｉｌａｒｔｏｓｐｈｅｒｉｃａｌｖｅｓｉｃｌｅｓ．７ｒｈｅｍｅａｎｄｉａｍｅｔｅｒｏｆＶＥＧＦｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｗａｓ９０ｎｉｎｗｉｔｈｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ５０～ｌ５０ｎｍ．ａｎｄｔｈｅｄｒｕｇｌｏａｄｉｎｇｗａｓ４２％．７ｒｈｅｒｅｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙｏｌ‘
ＷＡＮＧＷｅｔｌ，ＣＨＥＮＹｕ—ｃｈｅｎ９２，ＺＨＡＮＧＤａｎ。，ＬＩＵＨｕｉ—Ｈａ，ＮＩＮ（，Ｅｒ—ｊｔｌａｒｌｌ，ＺＨＡＮＧＨａｔ一
ｆｅｎ９１（１．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨｅｎａｎＫａ咖ｎｇ４７５００４，ＣｈｉｎｎｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
王玮，等：ＶＥＧＦ纳米粒的制备及药剂学性质研究
由测定结果呵见，本试验制备的三批ＶＥＧＦ纳米粒溶液。样品处理后测定ＶＥＧＦ的释放碹Ｑ，得累计释放

可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究

可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究摘要：本次研究中，我们准备了组织工程中的可注射胶原以实现人类重组VEGF（血管肉皮生长因子）的可持续释放。

胶原溶液在油质乳液条件下形成，同时与碳化二亚胺实现交联。

通过控制转速与表面活性剂浓度可形成各种在1-30um直径下的胶原微球。

颗粒直径随转速增加比例下降（在300－1200rmp下，每增加100转降低1.8um）.在置有磷酸盐的培养基中，胶原微球表现8.86－3.15mv的轻微正电荷。

研究结果显示，rh VEGF持续释放过程延续了4周。

释放的VEGF可诱导人脐静脉内皮细胞中毛细管的形成，且释放后维持一段时间的生物活性。

所以，我们得出结论，胶原微球可促进VEGF的持续释放。

1 介绍最近有研究报告显示血管生成术在组织工程中有所应用，尤其是大型组织的形成。

VEGF 是一种有效的血管生成分子，然而，机体内被管理的VEGF可在短时间内分解和清除，从而导致重复循环。

基于上述原因，许多有利于VEGF持续传递的材料已被研究。

胶原基质DDS(药物输送体系)引起了广泛关注，因为它的可注射性与传递多样性。

以胶原、明胶、白蛋白、透明质酸为代表的天然高分子聚合物已经在DDS中有所应用。

相对于合成聚合物而言，它们有极好的生物相容性。

尤其是胶原显示出更优异的生物相容性，因为它是细胞基质的主要组成成分，并且在生物界中扮演了非常重要的角色。

尽管有如此优势，可注射性胶原在DDS的研究却少有突破。

本研究中，我们在水油混合乳液条件下准备了可注射性胶原，以便实现VEGF的可持续性释放。

首先，我们研究了乳化混合中表面活性剂浓度和转速对微粒直径的影响。

其次，做了显微观察和表面电荷的的测算。

另外，我们从胶原微球中评估了人类重组VEGF的持续释放。

最后，我们对人脐静脉血管肉皮细胞中释放后的VEGF的生物活性进行了化验。

这里，我们论证了形成1－30um微粒直径的胶原微球的制法以及描述了胶原微球在DDS 中可作为一种有用材料。

复合bFGF缓释微球的制备与性能测定

复合bFGF缓释微球的制备与性能测定【关键词】，碱性成纤维细胞生长因子Preparation and characteristic test of bFGFimpregnated microsphere【Abstract】 AIM: To prepare the basic fibroblast growth factor (bFGF)impregnated microsphere and to study its characteristics. METHODS: The bFGFimpregnated microsphere was prepared by improved emulsified coldcondensation method. The physical properties， drug content and encapsulation were detected. The drug release in vitro was measured by ELISA. RESULTS: The average diameter of microsphere was (12.4±3.6)μm， the average drug content was 0.24% and encapsulation was 96.82%. In vitro， 28.23% of bFGF was sustainedreleased on the first day，57.19% from the second to the fifth day and 93.94% by the seventh day. CONCLUSION: The preparation method is simple， rapid and accurate and the release of bFGF from the microspheres can be sustained for a longer time.【Keywords】 basic fibroblast growth factor; microsphere; sustainedrelease; encapsulation【摘要】目的：制备复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的可降解缓释微球，考察其各项性能，为进一步应用于组织工程奠定基础. 方法：采用改良的乳化冷凝法交联制备复合bFGF的缓释微球，测定微球形态、粒径、载药率和包裹率等，并采用ELISA法考察其体外bFGF的缓释效能. 结果：缓释微球平均粒径(12.4±3.6) μm；平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%. d 1体外释放28.23%，2~5 d时累积释放率达到57.19%， d 7时释放减慢且累计浓度为93.94%. 结论：复合bFGF的缓释微球制备工艺简便，性能优良；可在较长时间内持续释放活性bFGF，与组织工程支架的结合应用具有可行性.【关键词】碱性成纤维细胞生长因子；微球；缓释；包裹率0引言生长因子的应用一直是组织工程领域的重要课题之一. 它具有多种生物学活性，可提供有利于细胞生长的微环境，促进新生组织血管生成等［1］. 但由于生长因子半衰期短，溶液进入体内后迅速扩散、变性或酶解，难以保持其生物活性［2］. 我们制备复合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的缓释微球载体，并考察微球形态、粒径、载药率、包裹率及释放效果等性能，以期利用此种新型载体在较长时期内持续释放bFGF，为今后与组织工程支架的结合应用奠定基础.1材料和方法1.1材料明胶(等电点50，相对分子量99 000，华美生物工程公司)，人重组bFGF 溶液(25 mg/L，等电点9.6，Sigma公司)，人bFGF定量EIA试剂盒（QuantiKineR， R&Dsystems），250 g/L戊二醛，丙酮，异丙醇，无水乙醚，液体石蜡，氨基乙酸为国产分析纯，Span80(Sigma公司)为进E1分析纯，水为双蒸水，JJ1型精确电子搅拌器仪，TGL16G高速离心机，GENESIS冻干机(Virtis公司)，BX41数码显微镜（Olympus).1.2方法1.2.1复合生长因子微球的制备将含有10 g/L Span80的液体石蜡30 mL 置于三口瓶中预热至55℃，快速搅拌下滴加入同样温度的明胶水溶液4 mL，并调节搅拌速度至450 r/min，继续搅拌10 min；形成油包水乳剂后迅速改冰浴，继续搅拌10 min，使其完成固化；加入250 g/L戊二醛0.1 mL，搅拌下预固化2 h，4℃固化24 h，用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤，挥去乙醚，真空干燥，得淡黄色粉末状微球，将200 μL的bFGF溶液滴加在20 mg的冻干明胶微球上，在室温下保持30 min以使bFGF完全融入微球. 钴60照射灭菌封存. 以丙酮为分散剂将空白微球样本及含有bFGF的微球样本置于光镜下，观察其外形及分散度. 同时测量500个微球的直径计算其平均粒径. 以算术平均径为微球的平均粒径，计算公式为：平均粒径=n1d1+n2d2+…+nndn/n1+n2+n3+…+nn式中n1，n2…nn为粒子数，d1，d2…dn为粒径.1.2.2微球含量及缓释性能测定根据人bFGF定量EIA试剂盒说明书配置标准液，在492 nm处测各孔A值. 以标准品0，8，16，31，62，125，250和500 ng/L之A值作出标准曲线并拟合线形回归方程. 取微球样品20 mg，放入PBS缓冲液中，加热至完全溶解，冷却后再用缓冲液稀释定容. 测出A492 nm值，然后在标准曲线上查处相应bFGF含量，并由此计算出微球的载药率以及标准率. 载药率=（bFGF质量/缓释微球质量）×100%. 包裹率=（bFGF质量/缓释微球中bFGF理论质量）×100%. 取缓释微球(2 mg)，用PBS缓冲液100 mL作为溶出介质. 药物体外溶出仪的温度保持在(37.0±0.5)℃．磁力搅拌转速100 r／min. 分别于各时间点(1，2，3，4，5，6，7 d)取样100 μL. 每次取样后，立即补充同温度的PBS缓冲液100 μL. 按1~7 d顺序，将稀释10倍的样品，分别加入微孔板7个孔中，每孔加样50 μL并同时加入样品稀释液各50 μL. 将反应板充分混匀后置37℃ 120 min. 用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次，向滤纸上印干. 每孔加入第一抗体工作液50 μL，将反应板置37℃ 60 min. 洗板，并在每孔中加入酶标抗体工作液100 μL.将反应板放置于37℃ 60 min. 洗板后加入底物工作液100 μL，置37℃暗处反应10 min. 每孔中加入一滴终止液，混匀. 在A492 nm处测各孔值.根据A值在标准曲线上查出相应bFGF含量.2结果2.1缓释微球的形态和粒径空白缓释微球呈圆球状，形态及粒径大小较均匀（Fig 1A）；复合有bFGF的缓释微球经溶涨体积变大，形态饱满(Fig 1B). 微球粒径7~20 (12.4±3.6) μm，占85.6%.2.2bFGF标准曲线在492 nm处测各孔A值，由此绘制标准曲线（Fig 2）并拟合线性回归方程为： A=0.0042C+0.0154，r=0.9996 （P<0.001），bFGF在0~500 ng/L范围内符合线性关系.2.3缓释微球中bFGF的含量在492 nm处测定得A值，根据回归方程计算出相应bFGF含量. 缓释微球中bFGF质量为4.841 μg，由此得出微球平均载药率为0.24%，平均包裹率为96.82%（n=5）.2.4缓释微球体外溶出度测定由缓释微球体外释放样品各个时间点的A值得出的bFGF浓度，并由此绘制出微球体外累积释放量曲线（Fig 3）.A: Blank; B: bFGFimpregnated.3讨论bFGF是一类具有较高活性的多聚肽，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛的生物学活性，可改变一些细胞的趋化性，诱导或抑制特殊蛋白质的合成或分泌［3］. 但由于这种多功能细胞因子半衰期短，易失去活性，应用效果不甚理想. 我们设计的缓释微球可缓释药物、靶向输送、保证药物的治疗作用的前提下减少给药剂量以及降低药物毒性等［4］. 通过含量测定，缓释微球对bFGF的包裹率可达96.82%. 体外证实，复合bFGF缓释微球在7 d内对上皮细胞仍有促进增殖活性［5］. bFGF的累积释放量呈缓慢上升趋势， d 1累积释放率为28.23%，不存在初始阶段的“突释”现象［6］；2~5 d，累积释放量率57.19%，克服了部分同类产品释放药物时初期浓度过大，短期内又迅速降低现象;到7 d时，累积释放率达到93.94%，虽然释放速率减慢，但体外仍有bFGF生物活性.本实验对缓释载体的研制尚处于实验室阶段，但由于此种缓释微球性能优良，可以根据组织工程化产品应用的不同需要，生产出包裹其他药物的缓释微球，也可同时包裹几种生长因子发挥联合调控的作用. 本设计工艺简便，能较长时间持续释放活性生长因子，在组织工程研究领域具有广阔的应用前景.【参考文献】［1］ Richardson TP，Peters MC．Polymeric system for dual growth factor delivery［J］．Nat Biotechnol， 2001;19(9)：1029-1034.［2］ Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et al. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factorimpregnated gelatin microspheres into artificial dermis ［J］. Biomaterial，2000;21：489-499.［3］ Kinsella L，Chen HL，Smith JA，et al．Interactions of putative heparinbinding domains of basic fibroblast growth factor and its receptor，FGFR1，with heparin using synthetic peptides［J］．Glycoconj J，1998；15：419-422．［4］ Maysinger D， Krieglstein K， Filipovic J，et al．Microencapsulated ciliary neurotrophic factor：Physical properties and biological activities［J］． Exp Neurol， 1996；138：177-l88．［5］黄沙，金岩，吴红. 制备复合生长因子的缓释微球并考察其对细胞的影响［J］. 上海生物医学工程，2004；25（4）：22-25.Huang S， Jin Y， Wu H. Preparation and cell effect test of bFGFimpregnanted microspheres［J］. Shanghai Biomed Eng，2004；25（4）：22-25.［6］ Edelman ER，Mathiowitz E， langer R， et al. Controlled and modulated release of basic fibroblast growth factor［J］．Biomaterial，1991；12:619-626.。

VEGF纳米粒的制备及药剂学性质研究

VEGF纳米粒的制备及药剂学性质研究王玮;陈玉成;张丹;刘慧娜;宁二娟;张海峰【期刊名称】《河南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2007(26)4【摘要】目的:将VEGF制备为纳米粒,以提高VEGF在体内的稳定性,解决VECF半衰期短等问题,并对所制备的VEGF纳米粒进行药剂学性质研究.方法:以无毒、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯为材料,采用乳化聚合法制备VEGF纳米粒,对其外观形态、粒径分布、包封率和载药量以及体外释放进行考察.结果:制备了纳米粒胶体溶液及其冻干品:电子透射显微镜下观察纳米粒形态,外形为粒径比较均匀的球状或近球状的纳米粒,平均粒径为90 nm,粒径范围为50～150 nm;包封率大于85%,载药量约为42%,冻干品的再分散性良好.结论:本研究制备的VEGF纳米粒,包封率和载药量相对较高,质量稳定,重现性好.【总页数】3页(P11-13)【作者】王玮;陈玉成;张丹;刘慧娜;宁二娟;张海峰【作者单位】河南大学,药学院,河南,开封,475004;四川大学,华西医院,四川,成都,610041;河南大学,药学院,河南,开封,475004;河南大学,药学院,河南,开封,475004;河南大学,药学院,河南,开封,475004;河南大学,药学院,河南,开封,475004【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.α-葡萄糖苷酶纳米粒的制备及其性质研究 [J], 陈婵娟;尹小英;沙碧宝;衷友泉2.MnO2纳米粒子的制备及其超电容性质研究 [J], 王元有;陈锁金;金党琴;黄德奇;鲁成旭;尹依雯3.恩诺沙星纳米粒的制备及其药剂学性质研究 [J], 宁二娟;刘慧娜;蔡源源;王玮;吴楠4.VEGF脂质体的制备及其药剂学性质研究 [J], 王玮;金邻豫;刘慧娜;刘俊波;张丹5.表没食子儿茶素没食子酸酯明胶纳米粒的制备及体外透皮性质研究 [J], 宋娟;于绪东;王栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大尺寸胶原微球的制备

大尺寸胶原微球的制备
胶原微球是一种具有广泛应用前景的生物材料，它具有生物相容性好、生物降解性强等特点。

而大尺寸胶原微球则更加适用于一些特殊的医学领域，如组织工程和药物缓释等。

本文将重点介绍大尺寸胶原微球的制备方法及其应用。

一、胶原微球的制备方法
制备大尺寸胶原微球的方法有很多种，其中一种常见的方法是通过乳液模板法。

具体步骤如下：
1. 首先，将胶原溶液和乳化剂混合均匀，形成一个稳定的乳液。

2. 然后，在乳液中加入交联剂，使胶原微球能够稳定地形成。

3. 接着，通过调节温度或加入其他物质，使乳液中的胶原微球逐渐固化和形成。

4. 最后，通过离心、洗涤等步骤，将制得的大尺寸胶原微球进行提取和纯化。

二、大尺寸胶原微球的应用
大尺寸胶原微球具有许多独特的应用价值，以下是其中的几个方面：
1. 组织工程：大尺寸胶原微球可以作为组织工程的载体，用于修复
和再生受损组织。

通过将细胞种植在胶原微球上，使其能够在体内稳定地生长和发育，从而实现组织的修复和再生。

2. 药物缓释：大尺寸胶原微球可以作为药物的缓释载体，用于控制药物的释放速率和时间。

通过将药物包裹在胶原微球内部，可以实现药物的稳定释放，从而提高药物的疗效和降低副作用。

3. 医学诊断：大尺寸胶原微球可以用于医学诊断，如肿瘤标记物检测等。

通过将荧光染料等标记物与胶原微球结合，可以实现对特定生物分子的高灵敏度检测，从而提高诊断的准确性和敏感性。

大尺寸胶原微球的制备和应用具有广泛的前景和潜力。

随着科技的不断发展和创新，相信在未来，大尺寸胶原微球将在医学领域发挥更加重要的作用，为人类的健康事业做出更大的贡献。