碱性磷酸酶-基因实验

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实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。

酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。

骨型碱性磷酸酶

骨型碱性磷酸酶的检测方法和临床应用文章来源：医学网发表时间：2007-07-04 09:51:00关键字：磷酸酶碱性磷酸酶(ALP，EC3. 1.3.1)是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，包括由不同结构基因编码的小肠、胎盘、生殖细胞和非特异型4种同工酶。

前三者基因定位于染色体重2q34-37的相邻位点，后者基因定位于染色体的1q36-34之间，其中非特异性型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。

对这些同工酶的理化性质、分子生物等特性、作用机制的深入研究以及准确的定量测定将有助于其在临床上的应用。

本文拟就年来国际上常用的骨型碱性磷酸酶(BAP)研究方法及其在临床上的应用研究进展作一综述。

1骨型碱性磷酸酶的特性骨型碱性磷酸酶是成骨细胞的一种细胞外酶，为糖蛋白，分子量约为12000道尔顿。

该酶在细胞内合成时新生的酶蛋白先在内质网糖基化，再通过高尔基体转运到细胞膜表面，通过多糖链与磷酯酰肌醇相连嵌合到细胞膜的外浆膜。

在多糖-肌醇磷酸特异水解酶的作用下，骨型碱性磷酸酶能被释放到血循环中。

骨型碱性磷酸酶在机体的生理功用主要是在成骨过程中水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必须的磷酸；同时，水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于成骨过程。

骨型碱性磷酸酶在体内的其他生化功用有待进一步的阐明。

2骨型碱性磷酸酶的检测人血清中含有的碱性磷酸酶同工酶分别来自骨骼、肝脏、小肠和胎盘组织(在妊娠时)。

胎盘型和小肠型碱性磷酸酶同工酶的活性能相对容易被区分，而区别骨型和肝型这两种同工酶活性就相当困难，因为这两种同工酶来源于同一基因，其动力学性质、电泳迁移率和其他理化性质均十分相似，且相互间有交叉免疫反应，目前鉴别和定量测定骨型碱性磷酸酶的方法可以分为两大类：电泳法和非电泳法。

电泳法主要利不同的同工酶之间物理性状、分子大小及荷电量的不同而进行。

根据所用的支持特和操作的方法可分为：醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和亲和电泳等。

血清碱性磷酸酶ALP测定

血清碱性磷酸酶ALP测定1.实验原理ALP对硝基酚磷酸盐+ H2O —————→磷酸+ 对硝基酚Mg2+在镁离子存在下, 对-硝基酚磷酸盐被ALP分解成磷酸和对-硝基酚,在405nm 的波长下, 对-硝基酚的吸光度增加与ALP的活性成正比。

2. 标本：2.1 病人准备：新鲜血清，采血后应及时分离，避免溶血。

2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。

3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。

4. 标本运输：冰冻条件下保存运输。

5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血等存运输的标本。

6. 实验材料6.1 试剂：中生碱性磷酸酶试剂盒（试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。

试剂有效期为12个月。

试剂必需避光保存。

试剂不可冰冻。

6.1.4 变质指示：当试剂空白吸光率A405nm(1.0cm)>1.0，或有混浊和可见颗粒时，请不要再使用。

6.1.5 注意事项：试剂请勿直接接触皮肤、眼睛，如有接触，请用大量清水清洗。

请勿吞服。

6.2 校准品：使用OLYMPUS提供的多项校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU640生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪项目测定参数.SOP文件。

8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪操作规程.SOP 文件。

9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。

质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。

11. 计算方法：以OLYMPUS校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以U/L报告。

基因工程考试题目整理

1.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。

Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。

（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。

筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。

（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。

（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。

通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。

以X-gal作为指示剂。

若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。

（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。

（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。

碱性磷酸酶km值测定实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。

在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。

底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。

但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。

若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。

将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。

二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

碱性磷酸酶(AKP)的特性分析研究

碱性磷酸酶（AKP）的特性分析研究摘要：碱性磷酸酶（akp）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。

本实验由含pet21a-akp表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。

本实验通过对纯化之后的akp进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对akp活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定akp的最适温度和ph以及akp的变性和复性等实验来研究akp的特性。

关键词：碱性磷酸酶（akp）；反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ ec. 3. 1. 3. 1），是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 kda。

它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。

大肠杆菌碱性磷酸酶被phoa 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。

碱性磷酸酶即akp来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。

akp广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。

akp能催化除去dna、rna、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状dna两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒dna的自身环化；蛋白质的去磷酸化。

大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将akp 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。

akp作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。

本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。

酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适ph、温度25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。

酶促反应动力学碱性磷酸酶Km值测定

米氏常数Km：描述酶与底物亲和力的常数
底物浓度与反应速率的关系：底物浓度越高反应速率越快
酶浓度与反应速率的关系：酶浓度越高反应速率越快
温度与反应速率的关系：温度越高反应速率越快
pH值与反应速率的关系： pH值影响酶的活性从而影响反应速率
Km值的含义与计算方法
Km值：酶促反应中酶的活性与底物浓度的比值表示酶与底物的亲和力计算方法：通过酶促反应速率与底物浓度的关系曲线利用米氏方程计算得出 Km值的意义：反映酶与底物的亲和力是酶学研究中的重要参数 Km值的应用：在药物设计、酶工程等领域具有重要应用价值
• 实验目的：测定碱性磷酸酶的Km值
• 实验原理：通过酶促反应动力学原理测定酶的活性和底物浓度的关系
• 实验步骤： . 准备实验材料：酶、底物、缓冲液等 b. 设定反应条件：温度、pH值、反应时间等 c. 测定酶活性：通过酶促反应速率测定酶活性 d. 测定底物浓度：通过酶促反应速率测定底物浓度 e. 计算Km值：通过酶促反应速率和底物浓度的关系计算Km值
配制反应溶液：按照实验要求配制反应溶液包括酶促反应试剂、碱性
磷酸酶、缓冲液等
加入底物：在反应容器中加入底物并记录底物
浓度
加入酶促反应试剂：在反应容器中加入酶促反应试剂并记录酶促反应
试剂浓度
反应开始：在反应容器中加入碱性磷酸酶并记
录碱性磷酸酶浓度
反应结束：反应进行一段时间后记录反应时间、
06
实验结论与展望
实验结论总结
实验结果表明碱性磷酸酶Km值与酶促反应动力学密切相关
实验数据表明碱性磷酸酶Km值在不同条件下的变化规律
实验结果对于理解酶促反应动力学具有重要意义

碱性磷酸酶

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。

这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。

但它不是单一的酶，而是一组同功酶。

目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。

其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。

生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。

生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。

每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。

AKP被phoA 基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。

碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。

而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。

碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。

碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。

ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。

基因工程常用的工具酶

基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。

本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。

这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。

限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。

根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。

例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。

限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。

Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。

它能识别外源DNA并将其降解。

单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。

血清碱性磷酸酶活性测定

骨肿瘤的诊断与鉴别诊断骨代谢性疾病的监测与疗效评估肝胆疾病的辅助诊断与疗效观察甲状腺疾病的相关指标检测
检测方法的准确性评估
参考方法：国际标准或国家标准的血清碱性磷酸酶活性测定方法
准确性评估指标：回收率、精密度、线性范围、干扰因素等
准确性评估方法：与参考方法进行比对，或与其他实验室进行比对
操作规程标准化：制定标准化的操作规程，确保检测过程的规范性和一致性。
室内质量控制：通过定期进行室内质量控制，监控检测过程的稳定性和准确性，及时发现并纠正误差。
实验室间质量控制
定期进行实验室间比对实验，确保不同实验室间的检测结果具有可比性。
对实验室内部质量控制数据进行分析，及时发现和解决潜在问题。
检测方法的标准化
检测方法的标准化是确保血清碱性磷酸酶活性测定准确性和可靠性的关键步骤。
标准化包括使用统一的仪器设备、试剂和操作程序，以及定期对标准品进行校准等。
标准化可标准化对于血清碱性磷酸酶活性测定的临床应用和科学研究具有重要意义。
检测方法的临床应用范围
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参与权威机构组织的质控活动，获取质控样品并按照要求进行检测。
关注国内外质量控制动态，更新质量控制方法和标准。
质量控制的监测指标
精密度：测定结果的重复性和稳定性
灵敏度：检测低浓度样本的能力
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准确度：测定结果与真实值的接近程度
抗干扰能力：抵抗非特异性物质干扰的能力
药物使用：某些药物可能影响血清碱性磷酸酶活性。
药物因素
药物种类：不同药物对血清碱性磷酸酶活性的影响不同

小鼠alp的pcr序列

小鼠alp的pcr序列PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术，在分子生物学研究中有广泛应用。

在这个任务中，我将介绍小鼠碱性磷酸酶（ALP）的PCR序列。

小鼠ALP是一种重要的酶，在细胞内起着关键的生物学功能。

为了研究ALP基因的表达或变异，我们可以使用PCR技术扩增与ALP基因相关的DNA片段。

首先，确定我们感兴趣的PCR目标片段是小鼠ALP的一部分。

我们需要根据ALP的基因序列设计一对引物，这对引物应该能特异性地结合于ALP的目标区域，并产生一个合适长度的PCR产物。

对于小鼠ALP，我们可以选择以下引物序列：引物1：5'-AGTCAGCTGAAGTCTGGGAG-3'引物2：5'-CTGCTTCCGAGACAGAGAGG-3'这对引物的序列是根据小鼠ALP基因的编码序列设计的，并且在目标区域上具有高度特异性。

接下来，我们可以使用PCR反应体系来扩增小鼠ALP的DNA片段。

一个典型的PCR反应体系包含以下组分：1. 模板DNA：从小鼠细胞提取的基因组DNA作为PCR的模板。

2. 引物：ALP特异性的引物1和引物2。

3. dNTPs：包含各种四个核苷酸的混合物。

4. 缓冲液：提供理想的pH条件和离子强度。

5. 酶：通常使用热稳定DNA聚合酶（如Taq聚合酶）。

6. 去离子水：作为反应体系的溶剂。

根据PCR仪器的建议和优化实验条件，我们可以进行PCR反应。

典型的PCR温度梯度如下：1. 反应前的预热：95°C，5分钟。

2. PCR循环：a. 95°C，30秒（变性，使模板DNA解链）。

b. 引物结合温度，例如60°C，30秒（引物与模板DNA结合）。

c. 延伸温度：72°C，30秒-1分钟（酶的最佳活性温度）。

3. 延伸结束后，进行最终延伸：72°C，5分钟（确保所有PCR产物完全延伸）。

4. 最后，将反应体系储存于4°C，或进行后续实验。

大肠杆菌碱性磷酸酶分子改造高效表达研究及应用

一、碱性磷酸酶的特性
3、底物特异性：碱性磷酸酶具有多种底物特异性，可根据底物的不同分为不同的亚型。例如，肠型碱性磷酸酶（intestinal alkaline phosphatase，IAP）主要催化小分子磷酸酯的水解，而骨型碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BAP）则主要催化磷酸基团从骨胶原等大分子中释放。
背景
背景
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种丝氨酸磷酸酶，能够催化磷酸基团的裂解，具有广泛的底物特异性。然而，天然的大肠杆菌碱性磷酸酶在某些应用场景下可能存在一定的局限性，例如催化效率不高、稳定性欠佳等。因此，针对大肠杆菌碱性磷酸酶的分子改造和高效表达研究具有重要的实际意义。
目的
目的
本次演示的研究目的是通过对大肠杆菌碱性磷酸酶进行分子改造，提高其催化效率和稳定性，并探究高效表达的策略。具体研究问题包括：1）如何对大肠杆菌碱性磷酸酶进行分子改造？2）这些改造对酶的催化效率和稳定性有何影响？ 3）如何实现大肠杆菌碱性磷酸酶的高效表达？
二、碱性磷酸酶的应用
二、碱性磷酸酶的应用
1、生物分析：由于碱性磷酸酶具有优良的底物特异性，因此在生物分析领域有着广泛的应用。例如，可以利用AP的底物特异性来检测特定分子或信号通路的活性，从而为研究生物过程提供有用的信息。
二、碱性磷酸酶的应用
2、生物工程：在生物工程领域，碱性磷酸酶被广泛应用于基因工程和蛋白质工程中。例如，可以利用AP的活性位点来设计新型的催化剂和药物分子。此外， AP还可以作为基因治疗和疫苗佐剂中的关键成分，用于调节免疫反应。
内容摘要
对于昆虫碱性磷酸酶的研究，主要集中在不同种类昆虫中碱性磷酸酶的分类、基因结构、表达调控等方面。根据目前的研究成果，昆虫碱性磷酸酶可以分为多个亚家族，每个亚家族具有不同的基因结构和表达调控特征。例如，在蝗虫中发现了两种碱性磷酸酶，分别命名为APL1和APL2，它们在基因结构上存在明显的差异，同时在表达调控上也表现出不同的特征。

分子生物实验报告

碱性磷酸酶AKP的克隆与筛选摘要：利用PCR技术扩增碱性磷酸酶基因；在含有Carb和Tet的LB液体培养基上接种含pETBlue-2质粒的Novablue宿主菌，过夜培养；采用质粒试剂盒提取两管pETblue-2质粒；按照质粒2ul每样品孔、PCR产物50ul每样品孔打样于琼脂糖凝胶，利用琼脂糖凝胶电泳，检测质粒质量，将PCR产物切胶回收。

配制酶切体系，进行目的基因与载体的双酶切。

电泳检测酶切产物，并切胶回收。

制备感受态细胞（所选择的细胞为DH5α），配制连接反应体系，连接目的基因和载体的酶切产物。

转化感受态细胞，过夜培养，筛选出重组菌，提取转化重组菌质粒，酶切质粒，对酶切情况进行电泳鉴定。

引言：聚合酶链反应，即PCR技术是美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种快速扩增特定DNA序列的方法。

通过使双链DNA 分子热变性，两条引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，以单链DNA为模板引物延伸。

进行碱性磷酸酶的克隆与筛选，首先要扩增AKP基因；选取合适的载体，本实验选取质粒pETblue-2作为载体。

选取DH5α作为受体菌，DH5α是带Lacz ΔM15基因型的受体细菌，lacZ的M15是表达β－半乳糖苷酶α片端的一段基因，当M15缺失（△M15）时lacZ基因只能表达ω片端，β－半乳糖苷酶没有活性。

当载体上的LacZ基因完整时，由α-互补而产生的半乳糖苷酶在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，反之若因目的基因插入使得载体上的LacZ基因不完整时，产生没有活性的半乳糖苷酶，菌落呈白色。

1.材料与方法1.1大肠杆菌K12碱性磷酸酶的克隆1.1.1实验原理PCR技术是通过分离目的片段，再进行DNA扩增与定量，可用于医学用途和传染病诊治。

PCR技术需要的原料有模板dNTP、Taq酶、10xbuffer、Mg2+：0.5-5mM 和引物，经历高温变性、中温退火、低温延伸三个过程。

常见的报告基因

常见的报告基因基因是生命的基本单位，它负责传递遗传信息并决定我们的遗传特征。

在基因研究中，科学家经常使用报告基因来研究基因在细胞中的表达和调控。

报告基因是一种易于检测和测量的基因，它可以通过特定的实验技术来标记和定量分析。

本文将介绍一些常见的报告基因及其在生物研究中的应用。

1. 绿色荧光蛋白（GFP）GFP是最著名和最常用的报告基因之一。

它是从水母中发现的一种蛋白质，具有绿色荧光特性。

通过将GFP基因与感兴趣的基因融合，科学家可以实时观察这些基因在细胞或生物体中的表达情况。

GFP的应用十分广泛。

在细胞生物学研究中，科学家可以利用GFP来标记和跟踪细胞的位置、形态变化和运动方式。

在生物医学研究中，GFP可用于追踪病菌在宿主中的定位和扩散情况。

此外，GFP还可以用于标记和追踪蛋白质在细胞中的定位和交互方式。

因其广泛应用和可靠性，GFP已成为许多研究领域的重要工具。

2. 荧光素酶（Luciferase）荧光素酶是一类产生荧光的酶，可以与荧光素底物反应产生可见光。

Luciferase基因被广泛用作报告基因，因其检测灵敏度高、快速和可定量的特点。

Luciferase的应用广泛用于研究基因转录、蛋白质互作和细胞信号传导等生物学过程。

通过将Luciferase基因与感兴趣的基因进行融合，科学家可以测量目标基因在细胞中的表达水平和动态变化。

此外，Luciferase还可以用于检测细胞凋亡、药物筛选和生物传感器等方面的研究。

3. β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-半乳糖苷酶是一种常见的酶，它能够催化底物X-Gal的降解产生蓝色产物。

β-Gal基因常被用作报告基因来研究基因的表达和调控。

β-Gal的应用广泛用于研究基因在细胞和生物体中的表达模式。

通过将β-Gal基因与目标基因进行融合，科学家可以观察其在细胞中的表达情况。

此外，β-Gal也可用于检测基因转导效率、病毒感染和细胞分化等方面的研究。

4. 碱性磷酸酶（AP）碱性磷酸酶是一种在生物体中广泛存在的酶，它可以催化底物产生阳性的紫色沉淀物。

低碱性磷酸酶血症一家系临床与基因分析

低碱性磷酸酶血症一家系临床与基因分析卢维城;石聪聪;蔡东;郑旭;郝虎;肖昕【期刊名称】《临床儿科杂志》【年(卷),期】2017(035)009【摘要】Objective To investigate the role of TNSALP gene detection in prenatal diagnosis of HPP. Method The clinical data and the results of complete exon sequencing of TNSALP gene in one neonate with low alkaline phosphatase (HPP) were analyzed retrospectively. Peripheral bloods from his family members were collected. The amniotic fluid cell in fetuses at 17 weeks was tested for candidate gene mutations by Sanger sequencing. Results Mainly manifestations in 6-day-old baby were multiple fractures, limb shortening and bending and dyspnea. He died of respiratory failure 9 days after birth. The serum alkaline phosphatase was decreased and serum calcium was decreased slightly; serum phosphorus, serum 25 hydroxyvitamin-D and parathyroid hormone were normal. X-ray showed that the whole body bone was very poorly mineralized, and the long diaphysis was enlarged with shape of a cup at the end and multiple fractures existed. Gene sequencing revealed a complex heterozygous missense mutation in the TNSALP gene, including the heterozygous missense mutation c.542C>T in exon sixth causing 181st amino acids changed from serine to leucine (p.S181L), and tenth exon heterozygous missense mutation in c.1016G>A causing 339th amino acid changed fromglycine to glutamic acid (p.G339E). The parental phenotypes were normal. The c.542C>T mutation is inherited from his father and the c.1016G>A mutation is inherited from his mother. These two mutations were not detected in the fetus. Conclusion TNSALP gene analysis can be applied to the diagnosis and prenatal diagnosis of HPP.%目的探讨组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)基因检测在低碱性磷酸酶血症(HPP)产前诊断中的作用.方法回顾分析1例新生儿HPP患儿的临床资料,以及全外显子组测序检测TNSALP基因结果;采集家系成员外周血,及患儿母亲第2胎孕17周胎儿的羊水细胞,进行候选基因突变的Sanger测序验证.结果患儿,男性、6日龄,主要表现为多发性骨折,肢体缩短弯曲,呼吸困难,生后9天死于呼吸衰竭;血清碱性磷酸酶下降,血钙轻度下降,血磷正常,血清25羟维生素-D和甲状旁腺激素均正常;X线显示全身骨骼严重矿化不良,长骨干骺端增大呈杯口状,多发性骨折;基因测序结果显示患儿TNSALP基因存在一复合杂合性错义突变,分别为位于第6外显子内的杂合性错义突变c.542C>T导致第181位氨基酸由丝氨酸突变为亮氨酸(p.S181L),第10外显子内杂合性错义突变c.1016G>A导致第339位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸(p.G339E);患儿父母表型均正常,c.542C>T突变遗传自父亲,c.1016G>A突变遗传自母亲.胎儿未检出这两种突变.结论 TNSALP基因分析可应用于HPP的诊断以及产前诊断.【总页数】5页(P682-686)【作者】卢维城;石聪聪;蔡东;郑旭;郝虎;肖昕【作者单位】海南省人民医院新生儿科海南海口 570311;中山大学附属第六医院儿科广东广州510655;海南省人民医院新生儿科海南海口 570311;海南省人民医院新生儿科海南海口 570311;中山大学附属第六医院儿科广东广州510655;中山大学附属第六医院儿科广东广州510655【正文语种】中文【相关文献】1.低磷酸酶血症一家系组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)基因突变分析 [J], 刘海娟;孟迅吾;周学瀛;李梅;邢小平;夏维波;余卫;聂敏;王鸥;姜艳;胡莹莹2.维生素B12依赖型甲基丙二酸血症一家系临床表型和基因突变分析及疗效评价[J], 利婧;孙毅明;欧俐羽;朱瑜龄;王倞;李欢;张成3.两个γTrp208Leu杂合突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症家系表型和基因型分析 [J], 杨丽红;郝秀萍;丁红香;金艳慧;江明华;王明山4.FGA基因c.104G>A杂合突变导致的先天性低纤维蛋白原血症家系的基因分析[J], 苏正仙; 毕晓洁; 金先富; 张慧斐; 姜俊宇; 沈波5.针对《GLDC基因复合杂合突变致非经典型非酮性高甘氨酸血症家系的临床和遗传学分析》一文读者提出问题的反馈 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系

中国水产科学 2011年1月, 18(1): 208–213 Journal of Fishery Sciences of China研究简报收稿日期: 2010−01−28; 修订日期: 2010−03−15.基金项目: 国家自然科学基金项目(30271017); 国家教育部博士项目基金(20040264001). 作者简介: 田娟(1984–), 硕士, 研究方向为鱼类发育生物学. E-mail: tian_hjuan@ 通讯作者: 施志仪(1954–), 教授. Tel: 021-********; E-mail: zyshi@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.00208碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系田娟, 施志仪上海海洋大学生物技术研究中心,上海 201306摘要: 为了探讨碱性磷酸酶(ALP)基因在大菱鲆(Scophthatmus maximus )体内的表达情况及在细胞水平上三碘甲状腺原氨酸(T3)对碱性磷酸酶(ALP)基因表达量的影响, 利用荧光定量PCR 法检测了大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织中ALP mRNA 的表达情况, 并且用0 nmol/L 、50 nmol/L 、75 nmol/L 、100 nmol/L 、200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC), 采用实时荧光定量PCR 法测定T3处理后细胞中ALP mRNA 的表达情况。

结果表明, ALP mRNA 在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同, 具有组织特异性。

心脏组织中ALP mRNA 的表达量最高, 其次是肝脏组织中和鳃组织中, 肌肉组织中ALP mRNA 的表达量最少。

不同浓度T3处理后大菱鲆肾细胞后, 细胞中碱性磷酸酶基因的表达量存在明显的差异, ALP mRNA 的表达量随着T3浓度的增加有递增趋势。

结论认为, ALP 基因在大菱鲆成鱼8个不同组织中均有表达, 但其表达量却有明显的差异, 具有组织特异性。