详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术

1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯

化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？

一、精氨酸激酶的介绍

无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。

二、工艺路线

三、研究内容与方案

1.对虾精氨酸激酶的提取、分离

取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：

巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、

PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解

＊注意事项

该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定

2.对虾精氨酸激酶的纯化

1）DEAE-纤维素柱层析

装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。平衡使用DEAE cellulose DE-52阴离子交换层析柱平衡液洗脱2-3个柱体积，平衡12h。加样打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一层，然后加入酶液，加样量一般不超过约2-3ml。洗脱采用NaCl浓度梯度洗脱法，将DEAE cellulose DE-52层析柱洗脱液A液和B液分别加到梯度混合仪两容器内，将B液150ml加入左杯，A液150ml加入右杯，打开梯度混合仪两容器内，流速1.5ml/min，通过波长280nm的核酸蛋白检测仪后，由自动收集器收集。

＊选择阴、阳离子交换层析的原则：

蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阴离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pIpH的

蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。

蛋白在pH5~8稳定时，则应选择阴离子交换剂，蛋白在pH=5以下稳定时，可以选择阳离子离子交换剂；阴离子交换剂在pH=8.6以下分离中性或酸性物质，阳离子交换剂，一般pH>4条件下使用。DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH 为7～9，然后提高盐浓度或降低pH使之洗脱。精氨酸激酶的最适pH为6.8，应使用阴离子交换层析。

＊注意事项

该步骤完成后，要对该部分洗脱峰的收集液进行酶活力的测定

3.精氨酸激酶酶活力测定（连续检测法）

AK测酶活时各试剂取用体积见配表2：

表2AK测酶活时各试剂取用体积

序号原液取体积终浓度

157mM精氨酸（10倍）2mL 5.7mM

266mM Mg(Ac)2(10倍)2mL 6.6mM

3百里香酚蓝/甲酚红指示剂（10倍)2mL0.015%，0.0025%

4水14mL

5ATP0.0551克粉末5mM

总体积20mL

按表2按量取上述物质混合，并用1M NaOH调pH至8.0，25℃预热10min后使用。测活：10μL酶+1mL底物，575nm检测连续1min。

4.纯度鉴定（SDS－PAGE法）

SDS－PAGE经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。