详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术
碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶活性的鉴定
磷酸苯二钠
AKP
磷酸盐 + 酚 红色醌类衍生物
酚 + 4-氨基安替比林 铁氰化钾
AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为 激活剂。
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Hale Waihona Puke 2管号酶液体空白
标准
A
B
C
D
0.1
0.1
0.1
0.1
酚标准液
0.1
Tris-Mg(AC)2 0.1
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实验目的
1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、 分光等方法，从组织中分离纯化 及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技 术及鉴定的方法
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实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。
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碱性磷酸酶的纯化
其余悬液中 缓慢 加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数 达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清液丢弃沉淀。 上清液中 缓慢 加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到 50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 沉淀中加入 Tris-醋酸镁缓冲液 5ml，即为纯化酶液。 作为D液用于比活性测定。
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碱性磷酸酶的提取
在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅 拌 2min ，室温放置 30min ，纱布过滤，置于离心 管。
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碱性磷酸酶的纯化
滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后 3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2 溶解。记录体积b 。取0.1ml作为B 液于EP 管，待测比活性用。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
参比溶液的选择
• 溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长 都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比 溶液。
• 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收 峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时， 可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这 种方式最为常用。
基本组件及常见分光光度计
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
分光光度法 （Spectrophotometry）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
（一）基本原理
1、光的基本知识 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
• 对比法进行定量分析
A样 = K ·L ·C样 A标 = K ·L ·C标
A样
K ·L ·C样
C样
A标
K ·L ·C标
C标
C样 = A样·C标 / A标
Lambert—Beer定律的适用范围：
碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定
2. 操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取25 g牡蛎（蒸水洗净），加入50 mL
预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 捣碎机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h左右进行抽 提。
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134 171 210 250 339 431
实验 碱性磷酸酶的分离提取
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术
1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。
上清液
（留3 mL上清液，待测酶的比活力。）
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h左右。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集离心上清液，并量体积。 （留
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有 的酶活力单位数。唯有比活力提高较大，提纯步骤 才有效。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
碱性磷酸酶的分离纯化
碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定与定⼒学分析⼀、实验原理(⼀)碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP3.⽐活性的定义＊单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。
＊通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。
＊⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之⼀。
4.测定样品的⽐活性必须测定：＊每毫升样品中的酶活性单位数。
＊每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。
5.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性测定AKP 4-氨基安替⽐林＊磷酸苯⼆钠→→酚→→→→醌衍⽣物（红⾊）铁氰化钾↓根据红⾊的深浅⽤⽐⾊法测定酚的含量。
＊37℃保温15分钟产⽣1mg酚者为1个酶活性单位。
(⼆)底物浓度对AKP活性的影响K m 即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度。
因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。
双倒数作图法（三）PH对AKP活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在⼀定pH范围内才具有活性，酶活性最⾼时的pH，称为酶的最适pH，⾼于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。
不同酶的最适pH不同。
酶的最适pH不是⼀个特征性的物理常数，对于⼀个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同⽽有差异。
（四）温度对AKP活性的影响酶的催化作⽤受温度的影响很⼤，⼀⽅⾯与⼀般化学反应⼀样，提⾼温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升⾼10℃，反应速度加快⼀倍左右，最后反应速度达到最⼤值。
Ⅲ—02碱性磷酸酶的分离纯化及鉴定
酶工程实验内容实验一碱性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶简称AKP。
先用低浓度醋酸钠低渗破模作用制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性释出膜中酶过滤后以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性质用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器管、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料新鲜兔肝试剂 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中定容至1000 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中定容至1000 m1 3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液混匀后定容至1000 m1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000mL即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrls 溶液加蒸馏水约780mL再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1混匀后用1冰醋酸调pH 为8.8用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95乙醇均为分析纯试剂。
四、实验操作分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下以下操作均在0-4℃进行将分离提取的碱性磷酸分装成2ml瓶冰冻干燥保存或液体保存也可但均置于-60℃低温冰箱保存。
应用时稀释5—7倍测其Km值。
实验二碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下酶促反应的初速度随作用物浓度S增大而增大但增大到一定限度时作用物浓度再增加则反应速度不再增加。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填入表3内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．米氏常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空白对照。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。
AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。
本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。
#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。
2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。
- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。
4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。
#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。
实验三 碱性磷酸酶的分离纯化和Km
AKP
磷酸苯二钠 PH 10
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林 碱性 红色醌类衍生物
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活 性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。
三、实验仪器及试剂
仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂： 1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠 （C6H5PO4Na2· 2H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解， 并稀释 至 1,000ml， 4ml 氯仿防腐， 加 贮于棕色瓶内， 置冰箱内保存， 可用一周。
• 将分离提取的硷性磷酸分装成 2ml 瓶，冰 冻干燥保存或液体保存也可，但 均置于60℃低温冰箱保存。应用时稀释 5—7 倍测 其 Km 值。
第二部分 碱性磷酸酶Km测定
一、实验目的
掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km 鉴定
二、实验原理
• 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度 随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作 用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为 最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与
• 试剂：
1 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000
m1。 2 3 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000 m1。 0.0lmol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液： 准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸 镁溶液及 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至 1000 m1。 4 Tris-HCl pH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g，用蒸馏水溶解 后 定容至 1000mL，即为 0.1mol/LTrls 溶液。取 100m1 0.1mol/LTrls 溶 液，加蒸 馏水约 780mL，再加 0.1mol/L 醋酸镁溶液 100m1，混匀后 用 1％冰醋酸调 pH 为 8.8，用蒸馏水定容至 l000m1。 5 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
酶的纯化实验报告
实验名称：碱性磷酸酶的分离纯化实验实验日期：2023年11月15日实验地点：生化实验室实验目的：1. 掌握碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化技术。
2. 了解不同纯化方法对AKP纯度的影响。
3. 学习AKP的比活性测定与动力学分析。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种在碱性条件下能水解多种磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适范围为pH 9.5-10.5，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP的分离纯化方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 正丁醇3. 丙酮4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液6. 酶活性测定试剂盒7. 其他实验试剂及仪器实验步骤：1. 样品制备：将兔肝匀浆液用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度。
2. 有机溶剂沉淀：向稀释后的匀浆液中加入正丁醇，充分混匀，静置一段时间，过滤除去杂蛋白，收集滤液。
3. 丙酮沉淀：向滤液中加入丙酮，充分混匀，静置一段时间，过滤收集沉淀。
4. 复溶于磷酸盐缓冲液：将沉淀用磷酸盐缓冲液复溶于一定体积。
5. AKP活性测定：按酶活性测定试剂盒说明书进行AKP活性测定。
6. 比活性测定：计算AKP的比活性。
7. 动力学分析：进行AKP的动力学分析，确定米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。
实验结果：1. 有机溶剂沉淀法：通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取了AKP。
2. 比活性测定：AKP的比活性为0.6 U/mg。
3. 动力学分析：AKP的米氏常数为0.5 mM，最大反应速率为1.2 U/min。
讨论：本实验采用有机溶剂沉淀法成功从兔肝匀浆液中提取了AKP，并通过比活性测定和动力学分析，对AKP的纯度和特性进行了研究。
详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术
1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？一、精氨酸激酶的介绍无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。
它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。
因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。
本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。
对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。
二、工艺路线三、研究内容与方案1.对虾精氨酸激酶的提取、分离取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。
＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解＊注意事项该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定2.对虾精氨酸激酶的纯化1）DEAE-纤维素柱层析装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。
生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 测定的方法
1.原理 1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase) 简称为ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释5 10倍）。 白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。
3.3 结果处理 计算：
酶活力(U/mL) = B t ⋅ V1 C ⋅A V2
蛋白浓度(mg/mL) =
上清液
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 ），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。 0.35饱和硫酸铵上清液 0.35饱和硫酸铵上清液 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 min，收集沉淀物。
碱性磷酸酶分离纯化方案(优质版)
纯化倍数与回收率两者不能兼顾，从表中可看出：
纯度提高1200倍； 酶活力从原来的5000u减至1500u，产率为30%。
1000ml的粗体液，总酶活5000u，经5次纯化，最终获得4ml的纯酶，酶比活从原来的0.416u/mg至500u/mg蛋白，
分离纯化方案设计
基本技术路线
体积 蛋白浓肝的结缔组织、脂肪组织；
二．细胞破碎 匀浆法破碎：将肝细胞经匀浆机破碎；
三．抽提 破碎肝细胞与0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液（pH7.5）按1:5混合，8000r匀浆1min
后于4℃抽提数时，得匀浆液。
使酶充分溶解， 抽提液的用量通 常为原料的1-5倍
往匀浆中缓慢加入4℃预冷的正丁醇（体积比为1/5），于4℃8000r/min离心20min，
取上清。
注意：
四．盐析 （硫酸铵分级沉淀）
次日，8000r离心15min（4℃）。
1. 溶液的 pH 值：硫酸铵略呈酸性，大 量加入会改变溶液的 pH 值，可用稀氨 水矫校正；
2.硫酸铵边搅拌边缓慢加入，避免溶液
选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂？ 主要决定因素：酶的稳定性 目标酶在低于其pI的pH值条件下更稳定，应选用阳离子交换剂； 酶在高于其pI的pH值条件下更稳定，宜采用阴离子交换剂。
酶活力测定
方法：……………..
蛋白浓度的测定
SDS-PAGE
方法：……..
预测结果： 条带清晰且为单一条 带判断为纯蛋白
五．脱盐和浓缩（透析法）
将沉淀溶于0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液，用蒸馏水透析至取该溶液加入
检验溶液 中是否还 存在SO42-
BaCl2无白色沉淀生成；再用0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液透析2遍。 将透析液离心（4℃8000r20min)，保留上清液并适当浓缩。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
【精品】碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究新
碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究生物技术1101班其曼古丽·麦麦提2摘要：经过匀浆，正丁醇处理，凝胶过滤等步骤，从猪肝中部分纯化了碱性磷酸酶。
以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为10，最适温度为37℃,Km=1。
6565。
KH2PO4对酶的活性有不同程度的抑制作用。
关键词：猪肝，碱性磷酸酶，分离纯化，性质碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，简称AKP)是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶,广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程【1】。
它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用【1】。
海洋中的甲壳动物锯缘青蟹体内的碱性磷酸酶是其赖以生长、生存的重要酶类之一，它对海水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的形成与分泌都具有重要作用【2】。
提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究【3】。
由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢,该酶还可添加到药用化妆品中【4】。
为了满足生产实践上的需要，仅国内以猪肝为材料来分离纯化碱性磷酸酶并对其性质进行分析的研究工作即已有若干.1。
1材料与方法1.1.1实验材料新鲜的猪肝脏.1。
1。
2试验仪器玻璃匀浆器，离心机,加样抢,恒温水浴锅。
1。
1.3试验试剂0。
5mol/L醋酸镁溶液；2,0.1mol/L醋酸钠;3，0。
01mol醋酸镁—0。
01mol/L 醋酸钠溶液；4，Tris—HClPH8。
8缓冲液；5，正丁醇；6，丙醇;7，95％乙醇；8,0.04mol/L作用物底物；9，0.1mol/L碳酸盐缓冲液（PH10。
0）;10，碱性磷酸酶液;11，0.5mol/LNaOH溶液；12，0。
3%-氨基安替比林；13,0.5mol/L铁氰化钾;14,基质液，15,0.2m甘氨酸;16，0。
2NaOH；1。
1。
4试剂配制0。
5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中,定容至1000ml。
0.1mol 醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定(优选参考)
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
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1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯
化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？
一、精氨酸激酶的介绍
无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。
它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。
因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。
本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。
对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。
二、工艺路线
三、研究内容与方案
1.对虾精氨酸激酶的提取、分离
取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。
＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：
巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、
PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解
＊注意事项
该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定
2.对虾精氨酸激酶的纯化
1）DEAE-纤维素柱层析
装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。
平衡使用DEAE cellulose DE-52阴离子交换层析柱平衡液洗脱2-3个柱体积，平衡12h。
加样打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一层，然后加入酶液，加样量一般不超过约2-3ml。
洗脱采用NaCl浓度梯度洗脱法，将DEAE cellulose DE-52层析柱洗脱液A液和B液分别加到梯度混合仪两容器内，将B液150ml加入左杯，A液150ml加入右杯，打开梯度混合仪两容器内，流速1.5ml/min，通过波长280nm的核酸蛋白检测仪后，由自动收集器收集。
＊选择阴、阳离子交换层析的原则：
蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。
以用阴离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pI<pH的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pI>pH的
蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。
但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。
蛋白在pH5~8稳定时，则应选择阴离子交换剂，蛋白在pH=5以下稳定时，可以选择阳离子离子交换剂；阴离子交换剂在pH=8.6以下分离中性或酸性物质，阳离子交换剂，一般pH>4条件下使用。
DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH 为7～9，然后提高盐浓度或降低pH使之洗脱。
精氨酸激酶的最适pH为6.8，应使用阴离子交换层析。
＊注意事项
该步骤完成后，要对该部分洗脱峰的收集液进行酶活力的测定
3.精氨酸激酶酶活力测定（连续检测法）
AK测酶活时各试剂取用体积见配表2：
表2AK测酶活时各试剂取用体积
序号原液取体积终浓度
157mM精氨酸（10倍）2mL 5.7mM
266mM Mg(Ac)2(10倍)2mL 6.6mM
3百里香酚蓝/甲酚红指示剂（10倍)2mL0.015%，0.0025%
4水14mL
5ATP0.0551克粉末5mM
总体积20mL
按表2按量取上述物质混合，并用1M NaOH调pH至8.0，25℃预热10min后使用。
测活：10μL酶+1mL底物，575nm检测连续1min。
4.纯度鉴定（SDS－PAGE法）
SDS－PAGE经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。