最新6碱性磷酸酶的分离提取
碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶活性的鉴定
磷酸苯二钠
AKP
磷酸盐 + 酚 红色醌类衍生物
酚 + 4-氨基安替比林 铁氰化钾
AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为 激活剂。
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Hale Waihona Puke 2管号酶液体空白
标准
A
B
C
D
0.1
0.1
0.1
0.1
酚标准液
0.1
Tris-Mg(AC)2 0.1
3
实验目的
1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、 分光等方法，从组织中分离纯化 及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技 术及鉴定的方法
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实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。
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碱性磷酸酶的纯化
其余悬液中 缓慢 加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数 达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清液丢弃沉淀。 上清液中 缓慢 加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到 50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 沉淀中加入 Tris-醋酸镁缓冲液 5ml，即为纯化酶液。 作为D液用于比活性测定。
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碱性磷酸酶的提取
在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅 拌 2min ，室温放置 30min ，纱布过滤，置于离心 管。
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碱性磷酸酶的纯化
滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后 3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2 溶解。记录体积b 。取0.1ml作为B 液于EP 管，待测比活性用。
生化实验碱性磷酸酶的提取与鉴定
实验中的问题与改进
通过总结实验中的问题 并寻找改进方法，我们 可以提高实验效率和准 确性，从而更好地完成 生化实验任务并为未来 的研究打下坚实基础
生化实验:碱性 磷酸酶的提取与
鉴定
1 实验目的 3 实验步骤 5 实验结论 7 实验思考与拓展 9 实验中的问题与改进
-
2 实验原理 4 结果分析 6 实验讨论与改进 8 实验总结
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实验目的
实验目的
本实验旨在学习 掌握碱性磷酸酶 的提取与鉴定方 法，了解其理化 性质及生物学意 义
2
实验原理
实验原理
该酶的理化性质及生物学意义，还锻炼了我们的实验操作技巧和处理生化样品的能力
2
通过实验，我们认识到碱性磷酸酶作为一种重要的生物酶，在生物体内发挥着参与物质代谢、能量转 化等重要生物学功能。此外，该酶在临床诊断、生物工程和环境监测等领域也具有广泛的应用价值
在实验过程中，我们需要注意实验细节和试剂的正确使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。例如，
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结果分析
结果分析
通过本实验，我们成功地提取并鉴 定了碱性磷酸酶
实验结果显示，该酶具有较高的活 性，且蛋白质浓度符合预期
通过本实验，我们掌握了碱性磷酸 酶的提取与鉴定方法，了解了其理 化性质及生物学意义
同时，实验过程中需要注意操作细 节和试剂的正确使用，以保证实验
结果的准确性和可靠性
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实验结论
实验中的问题与改进
在实验过程中，我们可能会遇到一
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些问题，例如提取的酶活性不高、
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
碱性磷酸酶分离纯化方案(优质版)
3.酶原料的选择
选择目的酶丰富的原料，同时考虑原料的来源、取材方便、经济因素。
4.注意分离方法的使用顺序 （1）先用低分辨率的方法 离心、沉淀、过滤等 （2）后用高分辨率方法 离子层析、膜分离、结晶 （3）昂贵、分离规模小的放最后 凝胶层析、亲和层析、HPLC等
一、总活力的回收率 总活力的回收率，反映提纯过程酶活
二、比活力提高的倍数 比活力的提高倍数则反映了纯化方法
力的损失情况；
的效率。
酶活性回收率= 样品酶活力 / 第一次总活力×100%；
纯化倍数= 样品酶比活力 /第一次比活力×100%。
纯化后比活力提高越多，总活力损失越少，则纯化效果越好
分离纯化时，测酶活力
选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂？ 主要决定因素：酶的稳定性 目标酶在低于其pI的pH值条件下更稳定，应选用阳离子交换剂； 酶在高于其pI的pH值条件下更稳定，宜采用阴离子交换剂。
酶活力测定
方法：……………..
蛋白浓度的测定
SDS-PAGE
方法：……..
预测结果： 条带清晰且为单一条 带判断为纯蛋白
谢谢
① 防止酶变性失活。一旦酶回收率明显下降，就要考虑换一种纯 化方法； ② 计算纯化效率。通过纯度倍数（酶比活力提高比），评估纯化 效率，寻找最佳方法。
纯化倍数与回收率两者不能兼顾，从表中可看出：
纯度提高1200倍； 酶活力从原来的5000u减至1500u，产率为30%。
1000ml的粗体液，总酶活5000u，经5次纯化，最终获得4ml的纯酶，酶比活从原来的0.416u/mg至500u/mg蛋白，
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。
AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。
本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。
#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。
2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。
- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。
4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。
#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
基本组件及常见分光光度计
分光光度计的使 用
一．打开电源预热15分钟 二．选择波长（ λmax ） 三．光标指向Trans 四．打开光门，调节0％；关上光门调节
100％ 五．重复4一次 六．将光标指向ABS 七．读数
碱性
红色醌式化合物
AKP活性测定基 本原理－－磷酸 苯二钠法
01
磷酸苯二钠 苯酚 + 4-氨基 安替吡啉 + 铁
A标
蛋白标准液浓度
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
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碱性磷酸酶的分离纯 化
有机溶剂分步沉淀法
汇报人姓名
分离纯化的一般程序
选择材料
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破碎细胞
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提取
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分离纯化
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分析及鉴定
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AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不
氰化钾
02
碱性磷酸酶 苯酚 + 磷酸盐
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10
5
1
单位（ml） 空白管 标准管 A
BCD
各阶段稀释液 / /
0.1 0.1
酚标准液
0.1 0.1
（0.1mg/ml） / 0.1
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
碱性磷酸酶的底物特异性与其结 构有关，通过对其结构的研究可 以了解其与底物识别的机制。
04 碱性磷酸酶的应用
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于合成磷酸酯 、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质水解
碱性磷酸酶可以催化蛋白质水解为氨基酸，为蛋白质工程提供原 料。
生产药物
某些物质可以抑制碱性磷酸酶的活性，这种抑制作用可以是非竞争性抑制或竞争性抑制，非竞争性抑制的抑制剂与底物不竞争结合酶的活性位点，而竞争性 抑制的抑制剂则与底物竞争结合酶的活性位点。
酶的稳定性与活性
温度稳定性
碱性磷酸酶在一定温度范围内是稳定的，但 在高温下会失去活性。
pH稳定性
碱性磷酸酶在一定的pH范围内是稳定的， 但在酸性或碱性条件下会失去活性。
金属离子稳定性
某些金属离子可以增强碱性磷酸酶的稳定性 ，如钙离子和镁离子。
活性测定
通过测定碱性磷酸酶催化底物水解的速率可 以确定其活性。
酶的底物特异性
01
底物种类
碱性磷酸酶可以水解多种磷酸酯 ，但其对底物的特异性有所不同 。
02
03
底物特异性
结构与功能关系
不同来源的碱性磷酸酶对底物的 特异性有所不同，有些酶对某些 底物具有更高的催化活性。
碱性磷酸酶可以用于生产药物，如抗肿瘤药物、抗生素等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可以反映 肝细胞的损伤程度。
骨骼疾病诊断
碱性磷酸酶升高可能与骨骼疾病有关，如骨肉瘤、骨 折等。
肿瘤转移监测
肿瘤细胞转移时，碱性磷酸酶水平会升高，因此可以 用于肿瘤转移的监测。
碱性磷酸酶的分离纯化
碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定与定⼒学分析⼀、实验原理(⼀)碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP3.⽐活性的定义＊单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。
＊通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。
＊⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之⼀。
4.测定样品的⽐活性必须测定：＊每毫升样品中的酶活性单位数。
＊每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。
5.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性测定AKP 4-氨基安替⽐林＊磷酸苯⼆钠→→酚→→→→醌衍⽣物（红⾊）铁氰化钾↓根据红⾊的深浅⽤⽐⾊法测定酚的含量。
＊37℃保温15分钟产⽣1mg酚者为1个酶活性单位。
(⼆)底物浓度对AKP活性的影响K m 即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度。
因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。
双倒数作图法（三）PH对AKP活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在⼀定pH范围内才具有活性，酶活性最⾼时的pH，称为酶的最适pH，⾼于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。
不同酶的最适pH不同。
酶的最适pH不是⼀个特征性的物理常数，对于⼀个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同⽽有差异。
（四）温度对AKP活性的影响酶的催化作⽤受温度的影响很⼤，⼀⽅⾯与⼀般化学反应⼀样，提⾼温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升⾼10℃，反应速度加快⼀倍左右，最后反应速度达到最⼤值。
实验 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定【参考仅供】
I (吸光度)
IO
代表：有色物质对光的吸收能力
医学参考A
33
Lambert定律： A∝ L
Beer定律：
入射光
IO
A∝ C
合并Lambert-Beer定律：
A ∝ C •L
即：A ＝ K • C • L
摩尔吸光系数
医学参考A
透过光
CI
L
34
在同一实验条件下，分别测定待测物溶液吸 光度（A测）和标准物溶液吸光度（A标），两者 均符合Lambert-Beer定律。
27
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
溶液A中总的酶活性单位
×100%
医学参考A
28
3、纯化倍数
每一制剂AKP比活性（U/mg）
纯化倍数 =
溶液A制剂AKP比活性（U/mg）
医学参考A
29
AKP分离纯化小结表：
总体积（ml） 蛋白含量（mg/ml） 总蛋白量（mg） AKP活性单位（u/ml） 总AKP活性单位（u） 比活性（u/mg） 纯化倍数 得率
计算蛋白质含量：
各制剂总蛋白含量（mg） = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积
注： A2、B2、C2液分别稀释 50、50、5 倍
医学参考A
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③ 各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算
1、AKP比活性：
每ml制剂中AKP活性单位数（U）
AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中蛋白质含量（mg）
医学参考A
酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
医学参考A
10
③ 选择合适分离提取方法
把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分 子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉
碱性磷酸酶的提取
b）利用分光光度计测吸光度
c）设计标准曲线计算蛋白质含量
使用BCA法测定蛋白含量的原因
a) 对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系中灵敏度 高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。
b）与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试 剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中.
提取操作流程 a）
取动物组织于 研钵中剪碎
加0.01M醋酸镁0.01M醋酸钠
滤液
(V)
弃渣
室温静置20分钟 用滤纸过滤
研磨2-3分钟
转移入刻度 离心管
于离心管中加 入正丁醇，用 玻棒充分搅拌
2分钟左右
提取操作流程 b）
滤液
(V)
加入等体积冷丙酮，立即 混匀后离心（200上清液
加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分 搅拌,记录体积(V1)
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%
b) 原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠， 苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生 成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大 小。
② AKP的蛋白含量测定—BCA法
原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合 一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质 将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色 复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
6碱性磷酸酶的分离提取
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产 物的mol数，算出酶活力。
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
0.5m 1m 加酶时 间 （min） 加NaOH 10.5 时间 11
1.5m 2m
2.5 m
3m
(1)
(2)
(3)
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点： 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才 有效。
பைடு நூலகம்
(5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸 铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入， 不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 (6)室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 (7) 得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测 出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。 (8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 min）。 (9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入 棕色瓶于4℃冰箱保存。
产碱性磷酸酶菌株的分离
实验设计原理：
• 目前应用较广的是牛小肠碱性磷酸酶和 E.coli碱性磷酸酶[4]。但因产率低、热稳定 性差，价格昂贵等问题，使其的大量使用 受到了限制。本实验通过微孔板法初筛， 磷酸苯二纳法测酶活复筛的方法来阐述对 产碱性磷酸酶菌株的分离。
材料：
试剂：
• (l)0.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠0.649、 碳酸氢钠、3.49、 • 4一氨基安替比林0.159,定溶于100ml蒸馏水中。 • (2)0.02mol/L磷酸苯二钠溶液称取二水磷酸苯二纳0.519, 使其定容于100ml • 沸水中,冷却后加入0.sml的氯仿。置冰箱保存。 • (3)铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.259、硼酸1.79,各溶于 40ml水中,二液 • 体混合后定容至10枷1。置冰箱保存。 • 以上试剂置冰箱保存一般不超过一周,每次都尽量现配现 用。
从湖边、花坛和竹林中3处取土样适量，加入10mL 无菌水，25℃摇床振荡30min，取上清液作系列稀 释，分别取0.2mL涂布LB培养基上，置于30℃培养 24h，将长出的菌落分别命名。磷酸苯二钠比色法 初测碱性磷酸酶活性。将0.lmol/L碳酸盐缓冲液(含 4-氨基安替比林,pH10.0)50ul点样于40孔微孔板中 (对照孔加量为55ul), 取各菌种等量菌苔与缓冲液充 分混匀,于37℃水浴5min。再加入磷酸苯二钠溶液 (0.02mol/L)50ul,37℃反应15min。加入铁氰化钾溶 液150ul,显色并终止反应。重复二次。以红色深浅 初筛磷酸酶产生菌。
产酶菌株碱性磷酸酶活力测定
采用AP活性检测试剂盒。具体操作为将1mL反应液R1加到 比色皿中，37℃孵育3min后加入20μL待测样品，搅匀并保 温30s，再加入250μL反应液R2到比色皿中，搅匀并 保温30s，然后用分光光度计测定波长405nm处2min内的吸 光度值变化。酶活性计算：碱性磷酸酶 AP（U/L）： △A/min×Vt×1000/ （e×Vs×d）=△A/min×F式中： △A/min：每分钟吸光度值变化率；Vt：反应液总体积，mL ；1000：变化系数；e：6.22（摩尔吸光系数）；Vs：标本 体积，mL；d：比色皿直径，cm。 酶活定义：37℃条件下每分钟产生1μmol游离酚的酶量为一 个酶活单位（U）。
详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术
1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？一、精氨酸激酶的介绍无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。
它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。
因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。
本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。
对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。
二、工艺路线三、研究内容与方案1.对虾精氨酸激酶的提取、分离取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。
＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解＊注意事项该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定2.对虾精氨酸激酶的纯化1）DEAE-纤维素柱层析装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
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（3）紫外分光光度测定需用石英杯。 （4）稀释倍数 （5）移液器的使用 （6）离心机的使用
结束语
谢谢大家聆听！！！
16
（min）
2.2.3蛋白浓度的测定
本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。
2.3 结果处理
计算：
酶活力 (U/mL=) B tV1
蛋白浓(度 mg/mL=)C A V2
各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。 ＝8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1
2.2.2 酶活力的测定
管号
空白
1
2
3
5 mM pNPP(mL)
各0.2mL
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
管号
1
1' 2
2' 3 3' 4
4' 5
5'
加酶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 0.5m 1m 间
（min）
加NaOH 10.5 11 时间
1.5m 2m 11.5 12
2.5 3m m
12.5 13
3.5m 4m 4.5m 5m 13.5 14 14.5 15
反应时 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 间
式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNP
mol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白
mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定
酶活力所用的酶量(mL数) 酶的比活力（U/mg）＝
酶活力（U/mL）
蛋白浓度（mg/mL）
纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力*100/第一步总活力
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL)
各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL)
DEAE-32酶液
9.6 3.82
Sephadex G75酶液 13.2 0.49
35.3 314.7
1002. 2
451.5
Sephadex G200酶液 6.8 0.21
509.3
3. 注意事项
（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加 入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽 量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变 性。
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL
各0.50mL 混匀，37℃，5分钟
酶液（mL）
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
0.1 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
酶液（mL）
0.1mL
OD 405 nm
以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产 物的mol数，算出酶活力。
6碱性磷酸酶的分离提取
目的要求：
1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活
测定的方法
2.2 比活力测定 2.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）： 取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。
管号 pNP含量 (mol)
01 2 34567 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）
步骤 匀浆过滤液
总体 蛋白 总蛋 酶活 总活 比活 纯 得
积 mg/m 白 力 力 力 化 率
mL L mg U/m U U/mg 倍 %
400 7.24
20L.3
数
正丁醇处理上清液 470
33.8
0.35饱和(NH4)2SO4上清 440 液
0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 40.3 溶解透析上清液