碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
生化实验碱性磷酸酶的提取与鉴定
实验中的问题与改进
通过总结实验中的问题 并寻找改进方法，我们 可以提高实验效率和准 确性，从而更好地完成 生化实验任务并为未来 的研究打下坚实基础
生化实验:碱性 磷酸酶的提取与
鉴定
1 实验目的 3 实验步骤 5 实验结论 7 实验思考与拓展 9 实验中的问题与改进
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2 实验原理 4 结果分析 6 实验讨论与改进 8 实验总结
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实验目的
实验目的
本实验旨在学习 掌握碱性磷酸酶 的提取与鉴定方 法，了解其理化 性质及生物学意 义
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实验原理
实验原理
该酶的理化性质及生物学意义，还锻炼了我们的实验操作技巧和处理生化样品的能力
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通过实验，我们认识到碱性磷酸酶作为一种重要的生物酶，在生物体内发挥着参与物质代谢、能量转 化等重要生物学功能。此外，该酶在临床诊断、生物工程和环境监测等领域也具有广泛的应用价值
在实验过程中，我们需要注意实验细节和试剂的正确使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。例如，
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结果分析
结果分析
通过本实验，我们成功地提取并鉴 定了碱性磷酸酶
实验结果显示，该酶具有较高的活 性，且蛋白质浓度符合预期
通过本实验，我们掌握了碱性磷酸 酶的提取与鉴定方法，了解了其理 化性质及生物学意义
同时，实验过程中需要注意操作细 节和试剂的正确使用，以保证实验
结果的准确性和可靠性
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实验结论
实验中的问题与改进
在实验过程中，我们可能会遇到一
01
些问题，例如提取的酶活性不高、
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
碱性磷酸酶提取分离纯化
碱性磷酸酶提取分离纯化碱性磷酸酶、广泛存在于微生物界和动物界，碱性磷酸酶几乎能催化所有磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。
他也可以催化磷酸基团的转移反应。
磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂，AKP具有磷酸基团转移活性能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有氢基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
•KP最适合PH范围为8.6-10，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，从表达菌提取，并进行动力学分析。
分离纯化：1、取1g新鲜的兔肝至于70℃冰箱内进行预先冷冻处理后取出，至于玻璃匀浆器内。
加入0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液3mL,充分研磨至糊状。
2、将匀浆液倒入刻度离心管中，使用4ml、0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液冲洗研磨器具，将冲洗液一并转入离心管内，离心管一定要置于冰块保护下，以后各个步骤也要注意保持低温。
3、加1mL正丁醇与匀浆原液中，使用玻璃棒充分搅匀，放置冰浴中2min。
使用滤纸过滤，过滤置于另一支刻度离心管中，过滤液也需要冰块保护。
4、滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心、2000r/min5min，弃去上清液，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻璃棒充分搅拌使其溶解。
5、向沉淀中加入4.0mL0.5mol/L醋酸镁溶液，充分搅拌使其溶解。
同时记录悬液体积向上清液中加入95%冷乙醇，使乙醇浓度到达60%，混匀后立刻离心5min（2500r/min），弃上清液。
6、向沉淀中加入4.0ml 0.01mol/L醋酸镁一0.01mol/L酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于 合成磷酸酯、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质剪切
碱性磷酸酶可以催化蛋白质剪切，对蛋白质的结构和 功能进行修饰。
生产药物
碱性磷酸酶可以用于制备药物，如抗癌药物、抗生素 等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可 以反映肝细胞的损伤程度。
碱性磷酸酶可以作为营养补充剂，用于补充 人体所需的矿物质和维生素。
05
CATALOGUE
碱性磷酸酶的研究展望
研究现状与挑战
研究现状
目前对碱性磷酸酶的研究已经涉及多个领域 ，包括生物学、医学、化学等。在生物体内 ，碱性磷酸酶的作用是参与磷酸基转移反应 ，具有重要的作用。然而，对于碱性磷酸酶 的精确调控机制，仍需进一步研究。
琼脂糖凝胶电泳
利用琼脂糖凝胶作为支持物，根据蛋 白质分子大小和形状的不同进行分离 。
03
CATALOGUE
碱性磷酸酶的酶学性质
酶的磷酸酶的米氏方程可以表示为V=Vmax\*[S]/（ Km+[S]），其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率， [S]是底物浓度，Km是米氏常数。
挑战
尽管已经对碱性磷酸酶进行了广泛的研究， 但仍存在许多挑战。例如，如何提高碱性磷 酸酶的分离纯化效率，以及如何精确调控碱 性磷酸酶的酶学性质等。此外，对于碱性磷 酸酶在生物体内的具体作用机制，也需要进
一步深入研究。
未来研究方向
研究方向1
进一步探究碱性磷酸酶的调控机制。 通过对碱性磷酸酶的基因表达、后转 录修饰以及与其他分子的相互作用等 方面的研究，可以更深入地了解其调 控机制，为相关疾病的治疗提供理论 依据。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填入表3内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．米氏常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空白对照。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
#### 一、实验背景碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有在碱性条件下水解多种磷酸酯底物的能力。
AKP在生物体内参与多种生理和代谢过程，如钙磷代谢、细胞信号转导等。
本研究旨在通过实验手段对AKP进行分离纯化，并对其性质进行初步探讨。
#### 二、实验材料与仪器1. 材料：- 兔肝匀浆液- 丙酮、乙醇、正丁醇、硫酸铵等有机溶剂- DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200等层析介质- SDS-PAGE电泳试剂- 蛋白质分子量标准品- 碱性磷酸酶底物及检测试剂2. 仪器：- 高速离心机- 紫外可见光分光光度计- 凝胶成像系统- 层析柱- 电泳槽- 移液器#### 三、实验方法1. 碱性磷酸酶的提取：- 将兔肝匀浆液用4℃预冷的丙酮沉淀，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入硫酸铵至饱和，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集沉淀。
- 将沉淀用少量水溶解，加入正丁醇，于4℃条件下静置2小时。
- 12,000 r/min离心30分钟，收集含有碱性磷酸酶的上清液。
2. 碱性磷酸酶的纯化：- 将上清液用DEAE-Sepharose FF层析柱进行阴离子交换层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
- 将活性峰用Sephacryl S-200分子筛层析柱进行分子筛层析。
- 以磷酸盐缓冲液为洗脱液，收集碱性磷酸酶活性峰。
3. 碱性磷酸酶的鉴定：- 将纯化后的碱性磷酸酶进行SDS-PAGE电泳，与蛋白质分子量标准品进行对比，确定其分子量。
- 利用紫外可见光分光光度计测定碱性磷酸酶的吸光度，计算其浓度。
4. 碱性磷酸酶的性质研究：- 通过酶活性测定，探讨碱性磷酸酶的最适pH值、最适温度等性质。
#### 四、实验结果1. 分离纯化结果：- 经过上述实验步骤，从兔肝匀浆液中成功提取并纯化了碱性磷酸酶。
详细介绍碱性磷酸酶分离纯化的过程及采取的技术
1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？一、精氨酸激酶的介绍无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。
它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。
因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。
本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。
对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。
二、工艺路线三、研究内容与方案1.对虾精氨酸激酶的提取、分离取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。
＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解＊注意事项该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定2.对虾精氨酸激酶的纯化1）DEAE-纤维素柱层析装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
VX = 5/6（0.83） VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
有色溶液
设： I IO
T (透光度)
A = lg IO = -lg I = -lg T
I (吸光度)
实验二 碱性磷酸酶的提 取及其比活性测定
材料选择
细胞的破碎
分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
（待测蛋白质含量）
剩余A液
加2ml正丁醇，搅拌 3-5'，室温放置30'， 过滤，入离心管
上述滤液
加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2,
搅拌，记体积VB
B液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验：肝脏
② 生物组织与细胞的破碎
➢ 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ➢ 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎
➢ 反复冻融法 ：
➢ 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而
使细胞破碎
➢ 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1
试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
【精品】碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究新
碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究生物技术1101班其曼古丽·麦麦提2摘要：经过匀浆，正丁醇处理，凝胶过滤等步骤，从猪肝中部分纯化了碱性磷酸酶。
以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为10，最适温度为37℃,Km=1。
6565。
KH2PO4对酶的活性有不同程度的抑制作用。
关键词：猪肝，碱性磷酸酶，分离纯化，性质碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，简称AKP)是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶,广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程【1】。
它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用【1】。
海洋中的甲壳动物锯缘青蟹体内的碱性磷酸酶是其赖以生长、生存的重要酶类之一，它对海水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的形成与分泌都具有重要作用【2】。
提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究【3】。
由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢,该酶还可添加到药用化妆品中【4】。
为了满足生产实践上的需要，仅国内以猪肝为材料来分离纯化碱性磷酸酶并对其性质进行分析的研究工作即已有若干.1。
1材料与方法1.1.1实验材料新鲜的猪肝脏.1。
1。
2试验仪器玻璃匀浆器，离心机,加样抢,恒温水浴锅。
1。
1.3试验试剂0。
5mol/L醋酸镁溶液；2,0.1mol/L醋酸钠;3，0。
01mol醋酸镁—0。
01mol/L 醋酸钠溶液；4，Tris—HClPH8。
8缓冲液；5，正丁醇；6，丙醇;7，95％乙醇；8,0.04mol/L作用物底物；9，0.1mol/L碳酸盐缓冲液（PH10。
0）;10，碱性磷酸酶液;11，0.5mol/LNaOH溶液；12，0。
3%-氨基安替比林；13,0.5mol/L铁氰化钾;14,基质液，15,0.2m甘氨酸;16，0。
2NaOH；1。
1。
4试剂配制0。
5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中,定容至1000ml。
0.1mol 醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。
管号 pNP含量 (mol)
01 2 34567 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
酶活力定义为：在37℃下，以2 mmol/L pNPP为底 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（FolinPhenol reagent）显色法
509.3
4.注意事项
（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加 入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽 量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变 性。
（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水 浴锅中预热及反应。
（3）紫外分光光度测定需用石英杯。 （4）稀释倍数 （5）移液器的使用
(3) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置1 h。
碱性磷酸酶的研究进展
碱性磷酸酶的研究进展【标题】碱性磷酸酶的研究进展【作者】柯清练【关键词】碱性磷酸酶?分离纯化?分子结构?生理功能【指导老师】陈春【专业】生物科学【正文】1?前言?碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶的水解反应和磷酸集团的转移反应，在生物体内具有非常重要的生理功能，它直接参与磷代谢，并与DNA，RNA蛋白质脂质等代谢有关。
能催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能，且它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义。
[1]它是一种在碱性条件下具有较高活性的酶，在机体各组织和血清中有着广泛的分布。
因为锌原子可作为AKP的辅基，所以可以通过测定血清AKP的活性来判断机体对锌元素的吸收利用情况，AKP的活性提高意味着机体对锌的利用率较高，反之亦然。
由于AKP的作用十分广泛，各行业对它的研究一直都没有停止过，虽然AKP对各方面的功能作用很多，但它主要的研究方向是在对人体和生物的生理所起作用的研究，所以历年来学者对它的这两方面功能作用都做过研究，以这两种功能作用来更进一步来研究其作用。
目前我国研究碱性磷酸酶主要在对水体环境、人体功能、动物功能的影响方面有主要涉及：①河流的影响方面；我国首先进行水体及沉积物碱性磷酸酶活性研究的是厦门大学洪华生教授等②人体的影响研究方面；碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎的检查及孕妇、骨折愈合期、骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时等疾病方面③动物方面：碱性磷酸酶市动物机体生长代谢、保持内环境稳定、维持机体健康所必需的酶，它们也同样受营养状况、环境变化及疾病和生长阶段的影响，动物赖以生长、生存的重要酶类之一。
由此对碱性磷酸酶的研究显得尤为重要，研究碱性磷酸酶的理化性质，探讨其活性部位，研究其对动物各种生活的关系影响；研究其对人体系统功能的各种影响，对研究碱性磷酸酶的结构与功能及酶的催化机理具有重要意义。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
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碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；
2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理
有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。
有机溶剂能使许多
溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。
例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而
使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。
同时有机溶剂溶于水，对
大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互
相聚集析出。
沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白
质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用
的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入
有机溶剂的浓度和体积可按下式
计算：
V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；
V0－原溶液的体积；
S1－原溶液中有机溶剂的浓度；
S2－要求达到的有机溶剂浓度；
100－指加入的有机溶剂浓度为100％。
如所加入的有机溶剂的浓度为9 5％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交
叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳
定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复
分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的
丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：
(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。
溶剂应预冷，
加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。
(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离
物质的分离效果。
蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样
品的共沉淀作用。
(3) 溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。
(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提
高分离效果。
中性盐浓度一般 0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。
三、仪器、原料与试剂
仪器
移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料
新鲜兔肝
试剂
1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至100
0 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m
1
3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液：准确吸取20mL 0.5mo
l/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m 1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水
溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrl
s 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后
用1％冰醋酸调pH 为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
四、操作步骤
以下操作均在4~10℃进行。
1.称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入
2.0mL0．01mol
/L 醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆液转移
至离心管中，用4.0mL 上述溶液分两次冲洗匀浆管，并倒入离心管中，混匀，此为A 液。
另取1支试管，编号为A，取0.1mLA 液，加4.9mLTri
s缓冲液掖(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.加2.0mL 正丁醇溶液于上述剩余的匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌2mi
n 左右。
然后在室内放置20 min 后，滤纸过滤，滤液置离心管中。
3.于滤液中加人等体积冷丙酮，立即混匀后离心5min(2000 r/min)，
弃上清波，向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液，用玻璃棒充分
搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为B掖。
吸取0.1m1B 液，置于
编号为B 的试管中，加入4.9m1Tris 缓冲掖(PH 8.8)，供测酶活用。
4.取剩余悬液体积，并计算使乙醇终浓度为30％需要加人的95％冷乙
醇量。
按计算量加入乙醇，混匀，立即离心5min(2000r/min)，量取上
清液体积。
倒人另一离心管中，弃去沉淀。
向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％(计算方法同前)，
混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。
向沉淀中加入4．0m1 0.0 lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。
5.重复操作步骤4，向悬浮液中加入冷乙醇(95％)，使乙醇终浓度达3 0％，混匀后立即离心5min(20 00r/min)，计算上清液体积，倒人另
一离心管中，弃去沉淀，向上清液中加入95％
的冷乙醇，使乙醇终浓度达60％。
混匀后，立即离心 5min(2500 r/mL n)，弃上清夜，沉淀用3mL0.5mol/L 醋酸镁溶液充分溶解，记录体积，此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入3.8m1Tris 缓
冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。
6.向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后
离心5min(2000r/min)，弃去沉淀。
量取上清液体积后转移至另一离心
管中，再缓缓加人冷丙酮，使丙酮终浓度达 50％，混匀后立即离心15 min(4000r/min)，弃上清液，沉淀为部分纯化的碱性磷酸酶。
向此沉
淀中加入4.0m1Tris pH8.8缓冲液，使沉淀溶解，再离心5min(2000r/m in)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。
上清液即为部分纯
化的酚液，此为D 液。
吸取0．2m1D 液置于编号为D 的试管中，加入0．8m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用。