一株渤海丝状海洋真菌的分子生物学复核鉴定

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医学真菌学研究进展

医学真菌学研究进展

真菌 病 包 括 浅 部 真 菌 病 和 深 部 真 菌 病 。浅 部 真 菌
病 是 由浅 部 真 菌 感 染 浅 表 皮 肤 所 引 起 的疾 病 , 头 癣 、 如 体 癣 、 癣 、 癣 、 癣 、 真 菌 病 及 花 斑 糠 疹 等 。 在 中 股 手 足 甲
代 价来 延 长 患 者 的 生 存 方 面 。如 2 0世 纪 4 O年 代 出现 的类 固醇 疗 法使 隐球 菌 感 染 的危 险性 上 升 。 同样 地 , 在
根 霉 引 起 的 坏 疽 性 脓 皮 病 ( 1 见 彩 插 一 ) 格 特 隐 球 菌 图 , ; I SC 型 (8 1 ) 起 脑 膜 炎 并 成 功 救 治 ( 2 见 彩 插 T S02 引 图 ,

使 菌 体 侵入 宿 主如 磷 脂酶 等 ; 使 菌 体 逃 避 宿 主 防御 系 ②
素的威胁。免疫 缺 陷患 者是 深部 真菌 病 的高危 人 群 , AI 、 液 病 、 DS 血 恶性 肿 瘤 、 官 移 植 、 伤 患 者 免 疫 缺 陷 器 烧
尤 为 严重 , 部 真 菌 感 染 也 常 发 生 于 这 类 人 群 。 因 此 , 深 在 一定 意 义 上 可 以这 么 说 , 成 深 部 真 菌 感 染 上 升 最 重 促 要 的 因 素 是 医 学 的 发 展 , 出 表 现 在 有 关 以 免 疫 削 弱 为 突
患者 中发 病 率 显 著 增 高 。为 寻 找 全 新 的 治 疗 靶 点 , 年 近 来针 对 烟 曲霉 的毒 性 因子 做 了很 多 研 究[ 。烟 曲霉 是 ’
真 菌 中研 究 较 为 清 楚 能 产 生 毒 性 物 质 的 真 菌 。 烟 曲 霉 可
而 言 , 性 因子 使 菌 体 逃 避 宿 主 防御 系 统 的 清 除 , 可 毒 并

温度、盐度和硅酸钠浓度对中肋骨条藻生长的影响

温度、盐度和硅酸钠浓度对中肋骨条藻生长的影响

物的养殖中.生产中发现,中肋骨条藻是生物絮团的 主要构成藻类之一,在絮团的发育形成中扮演着重 要的角色,因此,研究中肋骨条藻在生物絮团培养过 程中的生长变化,充分发挥其饵料价值与净水功能, 对生物絮团的培养及功能发挥具有重要意义.
关于中肋骨条藻的研究,基于赤潮防除的需要, 目前在温度、盐度、光照[6-7]、氮磷营养盐 对 [8-9] 其 生长的影响、脂肪酸组成[10]、自然生态分布 等 [11] 方 面已有所报道.但对于生物絮团培养条件下,中肋骨 条藻的生长及其影响因素的研究,还较为鲜见.本文 在分离纯化渤海莱州湾海域的一株中肋骨条藻,并 对其成功扩大培养的基础上,模拟生物絮团的培养 条件,研究了温度、盐度、硅酸钠浓度对其生长速率, 培养水体叶绿素 a含量的影响,旨在为中肋骨条藻
收稿日期:20170915 基金项目:山东省现代农业产业技术体系资助项目(SDAIT-12-03). 作者简介:王志宝(1991 ),男,山东烟台人,硕士研究生. 通信作者:刘立明(liuliming1971@hotmail.com),讲师,博士,研究方向:水产养殖学、海洋生物学.
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试验容器为 18L无色透明聚乙烯塑料桶,培养 水体为 15L,温度设置 10、15、20、25、30、35℃共 6 个组,每组设 3个平行,使用 100W 电加热棒和大 连汇新钛 HXSWT智能温度控制仪控制各组温度. 将扩大培养至指数生长期的同一批藻种按照 5× 103个 mL的细胞密度分别添加到各试验桶中,培养 液配方参考 f/2培养基,未添加微量元素,为满足絮 团培养需要另外添加 2mg/L的 NH4CI.用 100W 电 磁泵进行 持 续 微 充 气,充 气 量 为 (011±01)L/ min.试验桶上方架设 4支 25W 日光灯管,水面光 照强度为 3000~3500lx,日光暗比 12L∶12D,盐 度 28,连续培养 10d. 13 不同盐度培养试验

1株海洋乳酸菌的鉴定及生物学特性的初步研究

1株海洋乳酸菌的鉴定及生物学特性的初步研究

1株海洋乳酸菌的鉴定及生物学特性的初步研究赵鸭美;刘林;安静莹;钟敏;胡雪琼;刘颖【摘要】对从南海海域沙虫(Sipunculus nudus)肠道分离到的1株海洋乳酸菌ZH-101,通过形态学及生理生化特性实验,并结合16S rRNA序列同源性分析,将其鉴定为棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp,torquens).采用双层牛津杯琼脂扩散法测定其发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、黑曲霉6种指示菌的抗菌活性并对该菌做了部分生长特性研究.结果表明,其发酵液对食品中常见的腐败菌、致病菌有良好的抑制作用,该菌株最适生长温度为30℃,最适pH为6.0,培养6h后进入对数期,18h后生长进入稳定期.【期刊名称】《北京联合大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2013(027)002【总页数】5页(P59-63)【关键词】乳杆菌;分离鉴定;抑菌活性;生物学特性【作者】赵鸭美;刘林;安静莹;钟敏;胡雪琼;刘颖【作者单位】广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东普通高等学校水产品深加工重点实验室,广东湛江524088【正文语种】中文【中图分类】Q93-3310 引言乳酸菌作为一种益生菌广泛应用于食品行业中,它能抑制或杀死一些食品腐败菌和致病菌,改善食品风味,调节人体肠道菌群的生态平衡,有利于身体健康[1]。

近几年不断报道,一些乳酸菌在代谢过程中产生一种或多种具有抑菌活性的多肽或前体多肽即细菌素,具有抗菌性强、抑菌谱广、安全无毒等特点,是开发天然食品防腐剂的重点研究方向[2]。

我国南海海域广阔,海洋生物资源丰富、种类繁多,特殊的海洋生存环境使海洋生物具有与陆生生物不同的生理性状,并产生许多结构新颖、作用特殊的生物活性物质,是寻找乳酸菌新种和具有特殊功能的生理活性物质的重大来源[3-5]。

本研究对从南海海滩沙泥中挖出的沙虫(Sipunculus nudus)肠道中分离得到的一株细菌进行多相鉴定,对其发酵液进行了抑菌活性实验,并对它的生物学特性进行了初步研究。

海洋微生物

海洋微生物

第三十七页,共61页
• Aharon Oren 是以色列耶路撒冷大学教授, 是国际著名的海洋生物和嗜盐微生物研究专 家 。是FEMS Microbiology Letters 的主编 和ISJEM的编委。
第三十八页,共61页
2. 泉生古菌门Crenarchaeota
最初发现于陆地温泉,海底热液喷口,但最近发现,海洋中到处都有 泉古菌成员存在,包括南极海水、海冰、深海水体,化能自养或化能异 养。
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2、种类: 具有形态多样性和遗传多样性。
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3、分布: 在海洋中的分布规律为: (1)水平分布为近岸密度高,远岸密度底;
垂直分布为随海水深度增加逐渐减少,在接 近海底的水层中密度又增大。 (2)海洋病毒在海水中的含量呈动态变化 (3)海洋病毒在海水中的密度高达106~109 个/ml海水。 (4)海洋病毒是海洋中丰度最高的生物群体, 总量是海洋细菌的5-25倍。
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海洋中所有的细菌门
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2. 新陈代谢类型
自养细菌:光能自养,化能自养 根据所需营养物质的性质
异养细菌:海洋细菌的最大类群
好氧细菌 根据对氧气的需要 兼性厌氧细菌
厌氧细菌
大多数海洋细菌是兼性厌氧细菌,专性好氧细菌和专性厌 氧细菌都比较少见。
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3 特性
(1)嗜盐性
(2)适冷性
(3)适压性 (4)低营养性
(5)趋化性与附着生长: 大多数海洋细菌具有运动能力
运动方式 :swimming, swarming (6)发光性:少数海洋细菌具有发光特性
发光杆菌属(Photobacterium) 射光杆菌属(Lucibacterium)

【国家自然科学基金】_rdna-its序列分析_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803

【国家自然科学基金】_rdna-its序列分析_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
科研热词 推荐指数 黄山被毛孢 1 马铃薯腐烂茎线虫 1 限制性片段长度多态性 1 鉴定 1 虫生真菌 1 草决明荚枯病 1 禾谷孢囊线虫 1 症状 1 病原鉴定 1 特异性引物 1 核糖体基因 1 拂子茅属植物 1 形态学现察 1 形态学特征 1 塔宾曲霉 1 双重pcr 1 rdna-its序列 1 rdna-its区 1 rdna its区 1 neotyphodium属内生真菌 1 botryosphaeria dothidea 1
推荐指数 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
2014年 科研热词 推荐指数 系统发育 2 rdna-its序列分析 2 rdna-its 2 额尔古纳国家级自然保护区 1 青霉菌属 1 鉴定 1 采后病害 1 进化分析 1 转录间隔区 1 茶树 1 致病性 1 立枯丝核菌 1 真菌区系 1 病原分离 1 生物学特性 1 生物信息学 1 生态功能 1 生姜 1 烤烟 1 炭疽菌 1 水稻 1 柑橘 1 枯萎病 1 序列测定 1 序列分析 1 宁夏枸杞 1 孢子悬液浓度 1 土壤真菌 1ichum fructicola 1
推荐指数 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

真菌学实验报告

真菌学实验报告

真菌学实验报告一.实验目的:1.1了解真菌形态的基本特征。

1.2掌握丝状真菌制片方法。

1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。

二.前言:真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林,从海洋、高空到赤道、两极,到处都有真菌。

真菌虽然不在空气中生长繁殖,但它的孢子却成群的漂浮在天空,只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。

当今世界,生物技术已迈入世界经济的支柱产业,真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。

真菌是原始的真核生物,具有广泛的多样性,真菌生长我繁殖迅速,在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代,能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。

因此,真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具,真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展,为生物技术产业提供了一个广阔的天地。

植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性,植物物种的年代越久远,其生物内生真菌的多样性越丰富:抗病原性能越强的植物,其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大;其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程,本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎,根,花,种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力,并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。

研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。

三.材料与方法:3.1.1材料:在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。

3.1.2.药品与试剂:葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O,马铃薯、琼脂。

孟加拉红,青霉素,链霉素,甲基蓝,蛋白胨,酵母膏,蔗糖,磷酸盐,葡萄糖,琼脂条,无菌水等。

消毒剂:75%的乙醇,0.1%升汞(HgCl2),次氯酸钠溶液(含活性氯10%),30%双氧水。

双蒸水、琼脂糖,Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol),石英砂,Tris饱和酚,氯仿,异戊醇,无水乙醇,硼酸,冰醋酸,氯化钠,盐酸,氢氧化钠,EDTA,CTAB。

海洋微生物的分离与鉴定研究

海洋微生物的分离与鉴定研究

海洋微生物的分离与鉴定研究第一章:引言海洋微生物是海洋生态系统中最丰富多样的生命形态之一。

它们在海洋生态系统中扮演着重要的角色,例如维持海洋生态平衡和参与有机物分解循环等。

近年来,随着现代分子生物学和生物技术的发展,对海洋微生物的分离和鉴定研究也取得了显著进展。

本文将对海洋微生物的分离和鉴定研究进行介绍和讨论。

第二章:海洋微生物的分离方法海洋微生物的分离方法主要包括传统分离和现代分离两种方式。

传统分离方法是基于微生物生理学和生态学的研究原理,利用不同菌株的生长条件、生长速率和生理代谢差异等特征进行筛选和分离。

常见的传统分离方法包括表层沉淀、筛选培养基和微生物计数等。

现代分离方法则利用现代分子生物学技术和高通量筛选平台,对微生物进行高通量分离、筛选和鉴定。

常见的现代分离方法包括共培养方法、PCR扩增和转录组技术等。

第三章:海洋微生物的鉴定方法海洋微生物的鉴定主要基于其形态、生理代谢和分子生物学特征。

传统鉴定方法主要基于微生物生理学和生物化学的研究原理,包括形态学鉴定、生化鉴定和药敏试验等。

现代鉴定方法则利用分子生物学技术对微生物进行鉴定,包括16S rRNA序列分析、rpoB基因序列分析和比较基因组学分析等。

第四章:海洋微生物的应用研究海洋微生物的应用研究包括医药、食品、能源、环境等多个领域。

以医药领域为例,海洋微生物是重要的天然药物来源,如海洋真菌产生的头孢菌素和海洋细菌生产的抗生素等。

在食品领域,海洋微生物也具有重要的应用前景,例如海洋藻类可以提取富含蛋白质和营养物质的食品材料。

此外,海洋微生物还可以被用作生产能源、处理废水等环境保护领域。

第五章:海洋微生物的前景与展望随着现代分子生物学和生物技术的不断发展,海洋微生物的分离和鉴定技术也将得到不断提高和完善。

未来,海洋微生物在多个领域的应用前景将继续扩大,为人类的生活健康和环境保护等方面作出更大的贡献。

同时,我们也需要更深入地了解海洋微生物在海洋生态系统中的作用和意义,保护海洋生态系统,维护自然生态平衡。

广州市黄埔区事业单位笔试真题

广州市黄埔区事业单位笔试真题

广州市黄埔区事业单位笔试真题第一部分常识判断1.完全竞争企业在长期均衡下,成本不变行业中,产量的增加量是()A.完全来自新企业B.完全来自原有企业C.要么完全来自新企业,要么完全来自原有企业D.部分来自新企业,部分来自原有企业【答案】:A2.“民亦劳止,汔可小康”。

“小康”表达了劳动人民的美好愿望。

“小康”一词最早出现在我国的()。

A.《汉乐府》B.《孟子》C.《论语》D.《诗经》【答案】:D3.行政文化同其他文化形态一样具有特定的()。

A.边缘性、倾向性、实践性、风俗性B.政治性、实践性、群体的凝聚性和综合的引导性C.传统性、区域性、现代性、历史继承性D.社会性、民族性、时代性、历史继承性【答案】:D4.恩格尔系数是指()占消费者总支出的比例。

A.教育支出B.房租与燃料费C.卫生与休闲支出D.食物消费【答案】:D5.人感染H7N9禽流感疫情发生以来,我国建立起多部门联防联控工作机制,全力做好患者救1/ 12治工作,加强疫情监测和形势研判,采取关闭城市活禽市场、规范活禽调运等综合性传染源控制措施,并同世界卫生组织保持密切沟通与合作。

目前,疫情扩散态势已得到遏制。

这表明政府履行()职能。

A.市场监管B.公共服务C.经济调节D.社会管理【答案】:D6.公告、通告、通知、通报的共同点是()。

A.指导性B.告知性C.公开性D.权威性【答案】:B7.在中共十一届三中全会前夕召开的中央工作会议上,邓小平作了()的讲话,这实际上成为党的十一届三中全会的主题报告。

A.《解放思想,实事求是,团结一致向前看》B.《坚持党的路线,改进工作方法》C.《反对教条主义,坚持和发展马克思主义D.《高举毛泽东思想旗帜,坚持实事求是的原则》【答案】:A8.当出租车租金上涨后,对公共汽车服务的()。

A.需求量减少B.需求减少C.需求量增加D.需求增加【答案】:D9.下列关于信息产业的说法,错误的是()。

A.信息产业包括电子信息产业和信息服务产业两大类B.信息产业是新经济形成和发展的先导和支柱产业,对人类社会的发展有着决定性意义2/ 12C.美国拥有全世界最强的信息服务业D.随着信息产业的迅猛发展,信息传递和电器制造成为最热门的行业【答案】:D10.某地为简化流程及环节,启用了行政审批局行政审批专用章,替代原来的26枚行政审批专用章,做到了“进一个门、盖一个章、办所有事”,实现了企业办事一趟清,这彰显了政府:A.加快转变自身职能,建设服务型政府B.坚持审慎用权,提高政府工作透明度C.坚持从群众中来到群众中去的工作方法D.坚决反对“四风”,极力节约成本【答案】:A11.作为定案根据的证据应当具有的基本特征是()。

菌种保藏中心(知识学习)

菌种保藏中心(知识学习)

美国典型微生物菌种保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC)网址:ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。

该中心保藏有藻类111株,细菌和抗生素16865株,细胞和杂合细胞4300株,丝状真菌和酵母46000株,植物组织79株,种子600株,原生动物1800株,动物病毒、衣原体和病原体2189株,植物病毒1563种。

另外,该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。

该中心保藏的菌种可出售。

中国农业微生物菌种保藏管理中心Agricultural Culture Collection of China(ACCC)网址:ACCC是中国国家级农业微生物菌种保藏管理专门机构,负责全国农业微生物菌种的收集、鉴定、评价、保藏、供应及国际交流任务. 库藏菌种2490株,其中细菌1004株,放线菌69株,丝状真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.法国国家历史自然博物馆——Algotheque du实验室菌种保藏中心 Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National d'Histoire Naturelle(ALCP)网址: www.wdcm.nig.ac.jp/CCINFO/CCINFO.xml?792ALCP隶属于法国国家历史自然博物馆,主要从事于工业微生物学,应用微生物学,微生物系统分类学,培养和保藏方法等方面的研究,以及藻类等微生物的分离,鉴定,保藏工作。

保藏有藻类600种、细菌200种。

该中心保藏的菌种可出售。

台湾生物资源保存及研究中心(食品工业发展研究所) Bioresources Collection and ResearchCenter(BCRC) 网址:.tw/BCRC主要从事农业、应用微生物、细胞生物技术、基因工程、菌种保藏方法、工业微生物、食品科学、发酵、分子生物学等方面的研究。

临床真菌学检验基本技术

临床真菌学检验基本技术

二、真菌分类及存在形式
1、Ainsworth(1973)分类系统 特点:成立菌物界,分2门,真菌门下分成5个亚门;取 消藻状菌纲,依据鞭毛的有无划分成鞭毛菌亚门、接合 菌亚门。
2、Alexopoulos & Mims (1979) 分类系统
特点:成立菌物界,菌物界Myceteae、Fungi分3个门; 真菌类依鞭毛的有无分2门。 3、菌物分别归属藻界、真菌界、和原生生物界的分类系统
三、真菌的一般检查
(1)、一般镜检
B、胶带粘贴法
用透明胶带直接贴于取材部位,数分钟后揭 下,充分展平后,直接置贴于加有一滴浮液的载 玻片上此液可以是10%~20%的KOH,也可以采 用乳酸酚棉蓝染液(易于观察)。该法常用于花 斑癣患处的直接检查。
三、真菌的一般检查
(2)、常规染色
▪ 乳酸酚棉蓝染色
特点:将藻界、真菌界、和原生生物界分开成三个 独立的界属
➢与医学有关的真菌有四个亚门
接合亚门:毛霉、根霉等 子囊霉亚门:酵母菌属、小孢子霉属等 担子霉亚门:新生隐球菌、灵芝、食用菌等 半知霉亚门:假丝酵母菌属、球孢子菌属等
➢最新的真菌分类
接合菌门 子囊菌门 担子菌门 壶菌门
➢根据菌落形态分类:
酵母菌 酵母样菌 霉菌 双相真菌
3、现 代 形 态学技术, 如自动成像分析、电 子颗粒体积、分数几 何学分析形态学的特 点。
二、分子生物学鉴 定
1、表型 分 类 受限, 生理生化技术在丝状 真菌鉴定方面,或是 费时费事或是结果不 准。
2、PCR技术,可以分 析少量真菌细胞,甚 至单个真菌抱子。
3、选择通用寡核昔酸 对真菌种特异性引物, 测定其核昔酸序列。
菌 丝 和 孢 子
三、真菌的一般检查

海洋微生物次级代谢产物生物合成的研究进展

海洋微生物次级代谢产物生物合成的研究进展
如2 S 白酶 体抑制 剂sl 0p rmieA( P 一0 2 , 0蛋 ai so a d N I 5 ) n 0 sbioi(Z 0 7,ts oi( X 6  ̄by s t o l t T T 1 2 ) ai t I 一5 ) ]rot i 1 d n d nL 1 an
收 稿 日期 :2 1.1O 0 20 .3
基金项 目:国家 自然科学基金(1 70 5 ,中国科学院重要方 向项 I( C . W- 0 , C .W- 1, 8 L 10 2 30 0 4 )  ̄ KZ X2Y J 2 KS X2E G一2 0S l 10 ) I C2 作者简 介:肖吉 ,女 ,生于1 8 年 ,在读硕士研究生 ,主要研究方向为海 洋微 生物天然 产物 生物合成 。E ma : gi2 0 4 ia o 97 — i age0 5 @s . m l nt 通讯作者,Emalchn 2 0 @g it m - i z ag 0 6 ma . : lo
生 微 生物 的新 的 次级 代 谢产 物 【。据 统 计 ,在 1 9 — 2 ] 9 7
2 0 年 间 ,从 海洋 细菌 中共 获 得6 9 新化 合物 ,大 08 5个 部分 由蓝细菌 和 放线 菌产 生l。海洋 微 生物次 级代 谢 3 J 产 物 在 药 物 筛选 方 面 己取得 一 些 令 人 兴 奋 的进 展 :
weemanyd r e o fu pc l isnh t ytms ic dn oy eiesnh ss P s, o -b sma r il ei df m r y ia bo y te cs s v r o t i e ,n l igp lk t y tae (KS )n nr oo l u d i p piesnh t e N S) h b dP / R S ec I i rve rsne ercn rgesi lcd t g e t y tea s(RP s, y r KSN P , t.nt s e i wepee tdt et o rs e iai d s i h w h e p n u n

【国家自然科学基金】_18srdna_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730

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2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2014年 科研热词 18srdna 鉴定 金属离子 酯酶 遗传距离 膨大弯茎霉 细虫草 粘孢子虫 泥火山 油脂积累 横梗霉 新疆 抑菌 小头菱形藻 大曲 培养基 分类 分离 ph dgge 推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2011年 科研热词 18srdna 霉菌 群落结构 混合分解 毒力测定 森林凋落物 多样性 土壤微生物 dgge 16srdna 推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
科研热词 环孢子虫 犬 18srdna 纤维降解酶 瘤胃 球形棕囊藻 猴 特异pcr 牦牛 形态特征 序列分析 巢氏pcr 巢式pcr 尼氏单极虫 厌氧真菌 分类学 亨盖特滚管技术 二级结构 中国近海 rdna its区 rdna its-1基因 18srdna基因 18s
推荐指数 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
科研热词 线粒体 18s rdna 瘤胃微生物 无斑斜纹蟹 提取方法 序列 字纹弓蟹 基因组dna 叶绿体16s rdna 人参 pcr 18s 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2022年浙江海洋大学生物科学专业《微生物学》期末试卷A(有答案)

2022年浙江海洋大学生物科学专业《微生物学》期末试卷A(有答案)

2022年浙江海洋大学生物科学专业《微生物学》期末试卷A(有答案)一、填空题1、黏细菌产生黏液,将______包裹,形成颜色鲜艳、形态各异的______。

可产生多种胞外酶,能溶解______生物和______生物。

2、毒力是特定的病毒______,它是______的特征。

3、自生固氮菌的种类很多,其中属于好氧性的有______和______等,属于兼性厌氧的______等,属于厌氧的有______等。

4、微生物的营养类型可分为______、______、______和______。

5、蕈菌典型肉质子实体的构造包括______、______、______、______ 和______五个主要部分。

6、微生物学的发展简史可分为______、______、______,现处于______。

7、生物效价可用______、______测定,其中以______中的______最为常用。

8、土壤放线菌的数量可占土壤微生物总量的______,且在______丰富和______土壤中这个比例较高。

9、原核生物大肠杆菌的克隆载体中,能够容纳最大的外源DNA片段的载体是______,可容纳DNA片段大小为______;酵母质粒载体都是利用______质粒与细菌质粒pBR322构建而成的,主要有______、______和______3种。

目前能容纳最大外源DNA片段的载体是______。

10、病原菌侵入宿主后,按其间力量对比或影响大小决定了传染的3种可能结局,即______、______和______。

二、判断题11、革兰氏阳性细菌的细胞壁上是不含蛋白质的。

()12、氮素营养物质不仅用来合成细胞中的蛋白质,还可以为部分微生物提供能源。

()13、利用运动发酵单胞菌进行细菌酒精发酵要比酵母菌酒精发酵时供应更多的氧。

()14、病毒一般对抗生素敏感,对干扰素不敏感。

()15、酵母菌无性繁殖方式通常为裂殖,少数为芽殖。

()16、支原体是没有细胞壁的革兰氏阴性细菌,故在《系统手册》中归属于缺壁型门中。

啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究

啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究

第54卷 第5期 2024年5月中国海洋大学学报P E R I O D I C A L O F O C E A N U N I V E R S I T Y O F C H I N A54(5):125~134M a y,2024啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究❋杨淑洁1,田伟君1,2❋❋,陈海宁1,高慧子1,赵 婧1(1.中国海洋大学环境科学与工程学院,山东青岛266100;2.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东青岛266100)摘 要: 为解决废硅藻土资源浪费问题,并规避热再生及化学再生的缺陷,本文筛选出一株细菌及一株真菌对废硅藻土进行再生处理,并初步探究了两株菌及其混合培养对废硅藻土中蛋白质的去除效果及结构的改善情况㊂两株菌在培养基中显示了良好的蛋白质去除能力,分别可以降解培养基中83%和88%的蛋白质,使得培养基中N H +4-N 的浓度显著增加㊂在生物处理实验中也表现出优异的再生效果,废硅藻土中的蛋白质降低了54.3%㊂废硅藻土中被堵塞的孔隙被释放出来,比表面积和孔容都得到了很大的提升,分别由16.50m 2/g 和0.077c m 3/g 提升到26.21m 2/g 和0.139c m 3/g㊂在回用实验中,再生硅藻土能去除啤酒中67%的蛋白质,且能将为过滤啤酒的浊度由0.73E B C 降低至0.22E B C ,过滤蛋白质的效果和浊度降低效果都接近新硅藻土的过滤效果,远好于废硅藻土的过滤效果㊂过滤后,啤酒的非生物稳定性得到了提升㊂与用储存15d 后的废硅藻土过滤啤酒的浊度显著增加相反,用储存15d 后的再生硅藻土过滤啤酒后,其浊度并没有太多的改变㊂综合分析,本研究中的复合菌可以通过自身的代谢作用降解废硅藻土中的大分子蛋白质,释放其轮盘上的孔隙,从而使废硅藻土有效再生,再生后的硅藻土也具有重新回用于啤酒过滤工艺的可能性㊂关键词: 啤酒;废硅藻土;生物再生;蛋白质;非生物稳定性中图法分类号: X 703 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2024)05-125-10D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220197引用格式: 杨淑洁,田伟君,陈海宁,等.啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2024,54(5):125-134.Y a n g S h u j i e ,T i a n W e i j u n ,C h e n H a i n i n g ,e t a l .F e a s i b i l i t y s t u d y o n b i o l o g i c a l r e g e n e r a t i o n a n d r e u s e o f s pe n t d i a t o m i t e i nf i l t r a t i o n s e c t i o n o f b r e w e r y [J ].P e r i o d i c a l o f O c e a n U n i v e r s i t y of C h i n a ,2024,54(5):125-134. ❋ 基金项目:山东省重点研究发展计划项目(2019G S F 109099)资助S u p p o r t e d b y t h e K e y R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t P l a n P r o j e c t i n S h a n d o n g Pr o v i n c e (2019G S F 109099)收稿日期:2022-04-06;修订日期:2022-05-06作者简介:杨淑洁(1995 ),男,硕士生,研究方向为废弃物微生物处理法㊂E -m a i l :178********@163.c o m❋❋ 通信作者:田伟君(1976 ),女,博士,教授㊂E -m a i l :w e i ju n a s @o u c .e d u .c n 硅藻土是一种不可再生的矿产资源,其结构单元呈轮盘状,其上分布有较多的孔隙[1-3]㊂这些孔隙决定了其具有较强的吸附性能,故被广泛应用于果汁饮料生产过程中,尤其是用于啤酒的过滤工艺中[4-6]㊂硅藻土矿在中国有广泛的分布,但可供开采的优质硅藻土却十分稀少,且中国作为啤酒生产及消费的大国,每年消费的硅藻土量巨大[7]㊂在经过啤酒过滤工艺后,硅藻土的表面及孔隙中会吸附大量的杂质,这些杂质的存在降低了硅藻土的吸附性,且难以进行再生而被弃用[8]㊂在啤酒过滤工艺中,硅藻土主要起到过滤酵母细胞及蛋白质凝胶物质的作用,故过滤后,硅藻土孔隙中的杂质多为大分子的蛋白质及酵母菌[9]㊂且因原料及酿造方式的不同,硅藻土过滤后内部杂质的含量也有所不同[10]㊂被弃用的硅藻土大多采用直接填埋的方法进行处理,该方法简单直接,但会对环境造成二次污染[11]㊂硅藻土中大量的蛋白质被生物降解后会产生C O 2释放到空气中,从而降低空气质量㊂硅藻土中的其他杂质也会释放到土壤中,污染土壤及地下水,给环境造成不小的损害[12]㊂目前已有研究者对废硅藻土进行再生处理,以达到废物利用及改善环境的双重目的[13]㊂目前方法主要为热再生和添加化学试剂(酸,碱,盐,酶等对废硅藻土进行洗脱)再生法[14-17]㊂但热再生法周期长且能耗和成本较高,硅藻土经过高温灼烧后,粒径㊁密度㊁孔隙度等物理特性也会发生很大的变化,故吸附性能会受到影响[17-18]㊂添加化学试剂再生法成本低且操作简便,但使用的酸碱试剂会对环境造成二次污染[19]㊂因此,需要寻求一种经济且对环境友好的方式对废硅藻土进行再生处理㊂废硅藻土中含有大量的有机物,同时也有大量的微生物存在其中[20]㊂因此,可以利用其中的中国海洋大学学报2024年微生物,对废硅藻土进行生物处理,依靠微生物自身的降解作用去除其中的有机杂质,释放硅藻土的孔隙,恢复其吸附性能㊂1材料和方法1.1实验材料本研究使用的废硅藻土为青岛啤酒厂啤酒过滤工艺后的废弃硅藻土,采样时间距其从压滤机上拆卸下来的时间不超过24h㊂本研究中使用的所有试剂均为分析级或以上,所用的培养基为:(1)富集培养基:蛋白胨5g,磷酸氢二钾0.5g,七水硫酸镁0.5g,无菌超纯水定容至1L,调节p H至7.0㊂(2)分离培养基:在富集培养基中加入琼脂20g㊂(3)真菌营养琼脂(P D A)培养基:土豆100g,蛋白胨5g,葡萄糖20g,琼脂15~20g,水1L,p H值范围为7~8㊂为避免抗生素在灭菌时变质,灭菌后再加入土霉素0.2g㊂(4)细菌酪蛋白培养基:酪蛋白粉4g,七水硫酸镁0.5g,磷酸二氢钾0.36g,十水磷酸氢二钠1.07g,氯化钠0.16g,氯化钙0.002g,六水硫酸亚铁0.002g,氯化锌0.014g,琼脂20g,无菌去离子水定容至1L, p H范围为6.5~7.0㊂(5)蛋白质降解培养基:酪蛋白粉4g,七水硫酸镁0.5g磷酸二氢钾0.36g,十水磷酸氢二钠1.07g,氯化钠0.16g,氯化钙0.002g,六水硫酸亚铁0.002g,氯化锌0.014g,无菌去离子水定容至1L,p H范围为6.5~7.0㊂上述培养基均采用湿法(121ħ,0.1M P a, 30m i n)进行灭菌处理[21]㊂1.2菌株的分离纯化称取10g废硅藻土10份,分别加入10个装有90m L富集培养基的锥形瓶中㊂将上述锥形瓶放入恒温震荡培养箱中震荡(160r/m i n,30ħ,下同)培养5d,每日测定上清液中产铵根的情况㊂然后选取产铵根效果好的菌液加入到新的富集培养基中,重复上述的培养操作,连续重复4次[22]㊂吸取最后一次富集的菌液,按照梯度稀释㊁均匀涂布及连续划线的方法得到单菌落,之后编号保存,以用于后续的实验㊂上清液中铵根的测定方法采用纳氏试剂显色法[23]㊂1.3菌株的鉴定通过观察并记录菌株的大小㊁颜色及形状等特征,与文献中相似的菌株进行对比,菌株进行初步的鉴定㊂利用16S r R N A基因测序的方法对所筛选得到的细菌菌株进行分子生物学鉴定,P C R反应体系如表1[24]所示㊂表1P C R反应体系[24]T a b l e1P C R r e a c t i o n s y s t e m[24]组分C o m p o n e n t体积V o l u m e/μL终浓度F i n a lc o n c e n t r a t i o n 灭菌水S t e r i l e w a t e r20K O D O n e T M P C R M a s t e r M i x(1ˑ)25模板T e m p l a t e24n g/μL 1ˑ引物1ˑp r i m e1.50.3μm o l/L测序完成后会得到该细菌的16S r R N A基因序列,将拼接好的序列在N C B I数据库(h t t p s://w w w.b l a s t.nc b i.n l m.n i h.g o v)中进行比对,获得相似菌株或同源菌株16S r R N A基因㊂利用B i o Ed i t软件拼接并进行多序列比对,然后采用Me g a5.1软件绘制所筛得细菌16S r R N A基因的系统发育树㊂将筛选出的具有最优降解能力的真菌采用内转录间隔区(I T S)测序对其进行系统鉴定[25]㊂测序后,用G e n B a n k(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/g e n-b a n k/)中的B L A S T程序搜索序列,以获得相似菌株的I T S㊂利用B i o E d i t和M e g a5.1软件分析序列,并绘制真菌的I T S序列系统发育树㊂1.4菌株生长能力分析将筛选得到的两株菌株的菌悬液稀释至5%后,分别加投到新的富集培养基中进行震荡培养㊂每隔2h 测定不同菌株在600n m下的吸光度值,直至吸光度值开始降低㊂根据测定的吸光度值绘制O D600曲线,即为生长曲线[26]㊂1.5菌株的产蛋白酶能力分析将筛选得到的两株菌株的菌悬液稀释至5%后,分别接种到富集培养基中培养24h,而后取培养液离心后所得的上清液,上清液中的蛋白酶活性可看作菌株的蛋白酶活性㊂实验方法参照了‘G B/T23527 2009超硬磨料制品金刚石或立方氧化硼砂轮和磨头极限偏差和圆跳动公差“㊂将不同的菌株按照5%的接种量分别接种到蛋白质降解培养基中进行培养,并设置空白对照㊂测定培养基中0~36h时间范围内的蛋白质浓度,每隔2h一组㊂同时,为探讨菌株降解蛋白质的能力和氨化能力,还需每隔4h测定一组氨氮浓度㊂为比较与菌株B S D1降解蛋白质的能力,同样将前人所得B S D1接种到培养基中,培养条件保持一致㊂以上每组实验设置3个平行㊂利用氨气敏电极法(A S E M)测定培养液中N H+4-H的浓度[27]㊂1.6实验室条件下啤酒厂废硅藻土中蛋白质的生物降解将得到菌株按照不同的配比组成复合菌株,然后对废硅藻土进行脱蛋白的生物再生处理,通过微生物6215期杨淑洁,等:啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究降解的方法去除废硅藻土中的蛋白质㊂向100g经风干㊁研磨和冷冻干燥的废硅藻土中加入该菌悬液5m L (含游离的菌株1ˑ1010c e l l s左右,分为混合菌株和单菌株)㊂每日测定废硅藻土中蛋白的含量(考马斯亮蓝法),废硅藻土中的蛋白质采用氢氧化钠浸提法提取[28]㊂生物法处理完成后,将处理后的硅藻土样品取出并进行研磨和风干,然后置于干燥器中保存㊁备用㊂为探究再生处理后的效果,对新硅藻土(R D)㊁废硅藻土(S D)及再生硅藻土(F B D)的各项性能指标进行表征㊂通过扫描电子显微镜(S E M)观察三者在微观条件下的形态(硅藻土轮盘结构),了解吸附在表面的污染物的去除情况及孔隙的释放情况㊂同时,采用比表面积分析仪(A S A P2020)评估R D㊁S D及F B D三者的比表面积和孔结构的变化情况㊂1.7再生硅藻土回用于啤酒过滤工艺将新硅藻土㊁废硅藻土及生物再生硅藻土(各1g)分别均匀涂抹在滤纸上,预涂层厚度约1.5m m,采用真空抽滤机抽滤1L啤酒,为减少滤纸吸附对啤酒过滤产生的影响,本实验采用了大孔径的快速滤纸㊂测定过滤后不同酒液中的蛋白质㊁浊度及色度㊂蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法,采用E B C浊度仪法测定啤酒的浊度,采用分光光度法测定啤酒的色度㊂同时,为探究不同硅藻土对啤酒非生物稳定性的改善效果,测定了不同硅藻土过滤啤酒15d后的浊度[29]㊂2结果与讨论2.1蛋白质降解菌的筛选与鉴定近年来,微生物降解废物成为治理环境污染的主要途径[30]㊂本研究以啤酒厂废硅藻土为菌源,筛选出一株细菌(X G-1)和一株真菌(Z G-1),两株菌在培养基中生长情况良好,均能降解培养基中的蛋白质,并在平板培养基中形成较大的水解圈㊂菌株X G-1在固体培养基上会形成白色的菌落,形状不规则㊂Z G-1在半固体培养基中不能向四周扩散,故该菌无运动性㊂扫描电镜结果显示,X G-1为杆状,无鞭毛㊂所筛选得到的Z G-1也在介质中迅速成长,颜色逐渐由白色变为灰褐色㊂光镜下观察,Z G-1菌丝高度分枝并分离㊂它产生形状和大小各异的无色孢子,在孢子萌发过程中,可以观察到许多分枝的丝状结构,菌丝中有大小不一的单个圆形孢子囊(暗黄色,无包囊,直径40~110μm),孢子囊含有出气孔㊂真菌菌丝的主要成分是真菌分泌的胞外酶[28]㊂将经测序得到的X G-1的16S r R N A基因序列同不动杆菌属(A c i n e t o b a c t e r)的多个菌株对比,结果显示其相似性达到98%以上,其中同皮特不动杆菌(A c i n e-t o b a c t e r p i t t i i D S M21653A T C C19004)相似度最高,去除首㊁尾多余序列后,相似度达100.00%㊂结合上述生理鉴定及系统鉴定结果,初步鉴定X G-1为皮特不动杆菌㊂该菌是一种好氧反硝化菌,具有较强的脱氮能力,在污染水体中常被用来进行水体脱氮处理,也可降解污水中的石油等有机物[31]㊂尽管该菌并不具有致病性,但在已有的报道中,并没有将其用于食品行业的先例[32]㊂在后续的研究中,该菌也显示出高效的蛋白质降解能力,故在本实验中可将其应用于啤酒厂废硅藻土的生物再生㊂将测序得到的真菌Z G-1的序列信息进行比对可知,Z G-1与链格孢菌属(A l t e r n a r i a)的相似性最高,为100.00%㊂结合上述生理鉴定及系统鉴定结果,初步鉴定Z G-1为小麦中链格孢菌(A l t e r n a r i a a l t e r n a t a)㊂该菌是一种内生真菌,这种真菌是一种潜在的工业蛋白酶来源,在医药㊁农业和工业中都有应用[33]㊂其蛋白酶已被发现在广泛的p H值范围内具有良好的功能,此外,它是非常有效的蛋白酶生产菌[34]㊂在乳品工业中,该菌也被用于牛奶中蛋白质的发酵,其在P D A培养基上的蛋白水解活性为8000U左右[35]㊂然而,本研究首次探索了菌株皮特不动杆菌(X G-1)与链格孢菌(Z G-1)对蛋白质的降解效果以及利用生物法再生硅藻土的能力㊂采用16S r R N A基因构建基因系统发育树,以对细菌X G-1进行分子生物学鉴定如图1所示;采用I T S基因构建基因系统发育树测,以对真菌Z G-1进行分子生物学鉴定如图2所示㊂2.2X G-1与Z G-1的生长能力及蛋白质降解能力分析X G-1与Z G-1的O D600曲线如图3所示㊂X G-1的生长情况符合S型,该菌在培养2~10h时迅速繁殖㊂这个时期的X G-1正处于指数期,该阶段的细菌繁殖速度最快,降解能力最强,适合应用于后续的降解实验[36]㊂菌株Z G-1在富集培养基中到达对数期的速度相比X G-1的要缓慢,其延滞期为0~10h;10h后该菌株进入指数生长期,培养基内菌体数量呈几何倍数增加,波长600n m以下的吸光度值(O D600)从0.1增加到1.6,这表明该菌在该时期的生长代谢能力达到最强,后续的降解实验中也应取这一阶段的真菌㊂菌株X G-1与Z G-1在酪蛋白培养基中分别培养24和36h后,利用福林法测定带上清液的粗酶活力,其结果分别为19.29和20.22U/m L㊂以往研究中:杨连等[37]筛选的羽毛蛋白质降解菌的蛋白酶活力可达到20U/m L;梁春梅等[38]从牛乳中筛选出65株产蛋白酶的菌,其中最高的蛋白酶活力可达到18.88U/m L㊂综合分析,本研究所获得的蛋白质降解菌的蛋白酶活力相较于其他蛋白酶生产菌并不逊色,故这些菌可用于后续的蛋白质降解实验㊂X G-1与Z G-1在培养基中培养期间,依靠自身的降解能力使得培养基中蛋白质的浓721中 国 海 洋 大 学 学 报2024年图1 基于16S r D N A 序列构建的菌株细菌X G -1的系统发育树F i g .1 P h y l o g e n e t i c t r e e o f b a c t e r i a l s t r a i n XG -1c o n s t r u c t e d b a s e d o n 16S r D N A s e qu e n ce 图2 基于I T S 序列构建的菌株Z G -1的系统发育树F i g .2 P h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n ZG -1c o n s t r u c t e d b a s e d o n I T S s e qu e n c e 8215期杨淑洁,等:啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究((a )X G -1生长曲线X G -1g r o w t h c u r v e ;(b )Z G -1生长曲线Z G -1g r o w t h c u r v e .)图3 菌株的生长曲线F i g .3 gr o w t h c u r v e o f t h e s t r a i n 度分别由初始的158.1和158.9m g/L 降低至25.3和21m g/L ,降解率分别达到83%和88%(见图4)㊂高效的蛋白质降解菌常被用于降解废弃物,以达到改善环境的目的㊂季金殿等[39]从土壤中筛选出一株可以高效降解羽毛废物的蛋白质降解菌(S t e n o t r o p h o m o n a s s p .),在培养基中可降解培养基中85%的蛋白质,且在实际应用中表现出高效的降解羽毛中角蛋白的能力㊂袁小懿等[40]利用蛋白质降解菌处理养殖场产生的鸡粪废物,其筛选得到的菌株在培养基中的蛋白质降解率为65%,且投加到鸡粪中可以高效地活化养分,提高堆肥效果㊂图4 X G -1与Z G -1的蛋白质降解曲线F i g .4 P r o t e i n d e gr a d a t i o n c u r v e s o f X G -1a n d Z G -1在降解培养基中的蛋白质的过程中,N H +4-N 的浓度显著增加,而此时空白组的蛋白质浓度及N H +4-N 的浓度同开始时并未有太大的变化㊂蛋白质降解实验表明,X G -1和Z G -1有较高的蛋白质降解能力,能有效地将培养基中的蛋白质降解为氨氮的形式㊂本研究中的X G -1和Z G -1对培养基中蛋白质的去除能力显著,且菌株由废硅藻土中筛选得来,在废硅藻土生物再生处理实验中有较强的应用潜力㊂2.3混合培养再生废硅藻土的性能分析废硅藻土中的孔隙被大量的大分子蛋白质堵塞,故要想释放硅藻土的孔隙,恢复其助滤性,首先要做的便是去除其中的蛋白质[41]㊂在本研究中,为比较不同比例菌株的菌悬液的优劣,将不同比例复合菌分为H 1(Z G -1ʒX G -1=4ʒ1)㊁H 2(Z G -1ʒX G -1=3ʒ2)㊁H 3(Z G -1ʒX G -1=2ʒ3)㊁H 4(Z G -1ʒX G -1=1ʒ4)和H 5(Z G -1ʒX G -1=1ʒ1)五组㊂不同组的菌株处理S D 中蛋白质的情况如图5所示,在细菌与真菌比例为4ʒ1时,复合菌的处理效果最佳㊂硅藻土中初始蛋白质的浓度约为14m g /g ,复合菌接种到硅藻土后,在前5d 快速降解S D 样品中的蛋白质,并利用其中的蛋白质迅速繁殖,第5天时,蛋白质浓度便可降低至8.9m g /g,降解率达到36%㊂第5天后,其降解速度逐渐变慢,主要是由于所加菌的代谢活性降低所致㊂到第16天后,蛋白质浓度降至最低,此时硅藻土中蛋白质的含量约为6.41m g /g,降解率约为54.3%㊂龚晓溪等[42]从废硅藻土中筛选出一株氨化细菌B S D 1,对废硅藻土进行再生处理,蛋白质降解率为50%,本研究所获得的复合菌株的蛋白质降解效果要优于B S D 1的降解效果㊂韩珍琼等[43]采用高温加热及化学试剂(酸液)冲洗的方式对啤酒厂废硅藻土进行再生处理,在去除其中酵母菌的同时,还去除了废硅藻土中41%的蛋白质,虽在实验过程中所需要的人力及成本费用较高,但有效地恢复了其助滤性㊂复合菌生物处理废硅藻土实验表明,复合菌可以高效地去除废硅藻土中的蛋白质,且Z G -1ʒX G -1=4ʒ1为最佳比例㊂921中 国 海 洋 大 学 学 报2024年图5 不同比例复合菌处理硅藻土中蛋白质的效果F i g .5 E f f e c t o f d i f f e r e n t p r o p o r t i o n s o f c o m po u n d b a c t e r i a o n t h e t r e a t m e n t o f pr o t e i n i n d i a t o m i t e 图6展示了新硅藻土(R D )㊁废硅藻土(S D )与复合菌处理再生硅藻土(F B D )在扫描电镜下的形态特征,从图6中可以看出,F B D 表面较S D 表面有较大差别㊂R D 的表面洁净,吸附的杂质较少,孔隙多而密,能明显暴露在视野中㊂而S D 的表面粗糙,许多孔隙被啤酒过滤过程中滤出的杂质和有机残留物占据,导致硅藻土丧失吸附能力㊂硅藻土的孔隙是其吸附能力的外化指标,孔隙的数量决定了硅藻土吸附能力的强弱[44]㊂经复合菌生物处理后,F B D 表面的杂质基本消失,裸露出其外围的硅藻土轮盘孔隙,这是由于复合菌通过自身的代谢作用将大分子蛋白质降解为小分子物质,进而从孔隙中去除㊂而S D 的轮盘被大量的杂质覆盖,完全看不出孔隙的存在㊂硅藻土的吸附性能主要来自于其轮盘结构中的孔隙,这些孔隙多为小微孔隙,对溶液中杂质进行吸附及截留的能力较强[45]㊂当S D 轮盘结构上的孔隙被释放出来后,其吸附性能一定也得到了很大程度的恢复㊂一些研究利用水热处理来改善硅藻土的孔结构,使无机杂质从内部孔的表面分离出来,并在高压水蒸气(热膨胀和水膨胀)的作用下从硅藻土孔中去除,然而这种方法只去除了一小部分有机物[46-47]㊂此外,在水热作用下,硅藻土单元(D U )会发生崩解[48]㊂相比较来说,生物再生方法可以在更大程度上保持D U 的完整性㊂另外,从表2可以看出,S D 的比表面积及孔体积经复合菌处理后,分别由16.50m 2/g 和0.077c m 3/g提升到26.21m 2/g 和0.139c m 3/g㊂研究表明,有较大比表面积的吸附剂吸附溶液中杂质的能力更强[49]㊂在本研究中,比表面积提高了60%左右,改善效果显著,这得益于复合菌对孔隙中蛋白质的降解㊂与其他研究中通过传统热再生法及化学再生法得到的再生硅藻土相比,生物再生硅藻土具有更优越的孔结构[37]㊂天然硅藻土的比表面积约为20m 2/g,史树丽等[50]利用擦拭㊁高温加热及酸洗扩孔综合处理的方法提高了硅藻土的比表面积,最多可提升50%㊂本研究所获得的F B D 的比表面积也大于龚小溪等[42]的研究中得到的生物再生硅藻土的比表面积(26.89m 2/g)㊂再生硅藻土的表征分析表明,硅藻土吸附的杂质得到了有效去除,孔隙得到了很大程度的释放,比表面积也得到提升㊂这些特性的改善有利于恢复硅藻土的吸附性,为后续回用于啤酒过滤工艺提供了可能㊂((a )R D ;(b )S D ;(c )F B D .)图6 不同硅藻土的扫描电镜图F i g .6 S E M i m a ge s of d i f f e r e n t d i a t o m i t e 表2 不同硅藻土的结构参数T a b l e 2 S t r u c t u r a l pa r a m e t e r s o f d i f f e r e n t d i a t o m i t e 类型T y pe B E T 比表面积B E T s p e c i f i c a r e a /(m 2/g)总孔体积T o t a l p o r e v o l u m e /(c m 3/g)平均孔径A v e r a ge p o r e s i z e /n m 废硅藻土①16.500.07719.84复合菌处理再生硅藻土②26.210.13919.01注:①S p e n t d i a t o m i t e ;②B i o l o g i c a l r e ge n e r a t i o n of d i a t o m a c e o u s e a r t h .0315期杨淑洁,等:啤酒厂过滤工段废硅藻土的生物再生及回用的可行性研究2.4再生硅藻土回用于啤酒过滤工艺可能性分析经R D ㊁S D 与F B D 过滤后的啤酒中蛋白质含量及浊度情况如图7所示㊂在实验过程中,S D 表现出的过滤效果极差,对啤酒中的蛋白质及浊度的改善效果都不尽人意,甚至有实验组出现浊度高于未过滤时的情况,这可能是由于S D 中吸附的小分子有机质释放到啤酒溶液中导致的㊂而经R D 过滤后,啤酒中蛋白质含量出现大幅下降,由1.62g /L 降低到0.91g /L ,去除率达到69%㊂经F B D 过滤后,啤酒中蛋白质的含量由1.62g /L 降低到0.97g /L ,去除率达到67%,其蛋白质过滤效果接近R D 过滤啤酒,说明其吸附性恢复程度已经接近R D ㊂在经啤酒厂大型硅藻土压滤机过滤后,啤酒中蛋白质的去除率可达到75%以上[51],本研究所获得的结果与其相差较大,这是由于在实验室条件下难以模拟压滤机过滤过程所致㊂在以往的研究中,有人利用纤维素过滤啤酒,其对啤酒中的蛋白质去除率仅能达到56%[52],因此本实验中再生硅藻土的过滤效果也是优于纤维素助滤剂的㊂R D 与F B D 对啤酒浊度的改善也十分明显,经R D 过滤后啤酒的E B C 值(0.2)与经F B D 过滤后啤酒的E B C 值(0.22)都在0.4以下,低于现行的啤酒浊度指标(0.2~0.4)[53]㊂在啤酒的过滤工艺中,硅藻土能有效地改善啤酒的非生物稳定性,防止啤酒在储存过程中发生反应而产生沉淀[54-55]㊂在啤酒的储存过程中,其浊度的变化是其非生物稳定性的重要指标之一㊂经测定,R D ㊁F B D与S D 对啤酒非生物稳定性的改善效果不尽相同,三种硅藻土过滤的啤酒经密封储存15d 后的结果如表3所示㊂R D 与F B D 过滤后啤酒的浊度并未出现明显上升,这是由于啤酒中的胶体颗粒(主要为蛋白质)的含量较少,产生的絮凝效果也不明显[56]㊂而啤酒经S D 过滤并储存15d 后,浊度(E B C 值)由0.71上升至1.43,上升足有一倍多㊂复合菌再生后的硅藻土能有效改善啤酒的蛋白质含量及浊度情况,并能提高其非生物稳定性,且其效果接近新硅藻土的改善效果,因此其具有回用于啤酒过滤工艺的可能性㊂因本研究中所用条件均局限于实验室内,效果可能与实际应用存在差异,故后续可通过将其应用于实际工艺中,以探索更适宜的过滤条件,获得更优秀的过滤效果㊂((a )蛋白质含量P r o t e i n c o n t e n t ;(b )啤酒浊度T h e t u r b i d i t y of b e e r .)图7 不同硅藻土过滤后啤酒的性质F i g .7 P r o pe r t i e s of b e e r f i l t e r e d w i t h d i f f e r e n t d i a t o m i t e 表3 不同硅藻土过滤后15d 后的浊度(E B C 值)T a b l e 3 T u r b i d i t y o f d i f f e r e n t d i a t o m i t e f i l t e r e d f o r 15d a ys (E B C v a l u e )参数①R D 过滤后啤酒②F B D 过滤后啤酒③S D 过滤后啤酒④过滤后啤酒的初始E B C 值⑤0.20.220.71过滤后15d 啤酒的E B C 值⑥0.330.361.43注:①P a r a m e t e r ;②F i l t e r e d b e e r b y R D ;③F i l t e r e d b e e r b y F B D ;④F i l t e r e d b e e r b y SD ;⑤T h eE D C v a l u e o f t h e i n i t i a l f i l t e r e d b e e r a f t e r f i l t r a t i o n ;⑥E D C v a l u e o f b e e r 15d a ys a f t e r f i l t r a t i o n .3 结语本研究在前人的基础上,新筛选出一株细菌X G -1与一株真菌Z G -1,经鉴定,两株菌分别为皮特不动杆菌(A c i n e t o b a c t e r p i t t i i )和链格孢菌(A l t e r n a r i a a l t e r n a -t a )㊂X G -1与Z G -1具有较高的蛋白质降解能力,蛋白酶活性分别达到19.29和20.22U /m L ,对培养基中的蛋白质降解率可分别达到83%和88%㊂初步研究表131中国海洋大学学报2024年明,将Z G-1与X G-1按4ʒ1的比例组成复合菌后投加到废硅藻土中,可有效去除其中的蛋白质,培养过程中的最高去除率达到54.3%㊂经生物再生后,废硅藻土表面的孔隙得到了释放㊂再生硅藻土的比表面积及孔体积也远高于废硅藻土,有利于改善废硅藻土的吸附性能㊂再生后的硅藻土回用于啤酒过滤工艺时,可以去除啤酒中67%的蛋白质㊂同时,再生硅藻土可以将啤酒的浊度(E B C值)由0.73降低至0.22㊂且再生硅藻土能提高啤酒的非生物稳定性,经其过滤后的啤酒浊度仅上升0.14㊂考虑到复合菌对废硅藻土有良好的再生效果,生物法再生硅藻土在啤酒过滤工艺中的再利用无疑拥有巨大的潜力㊂这不仅有助于啤酒厂节约成本,而且对于改善中国废弃物处理环境也具有重要的价值㊂参考文献:[1]郑水林,孙志明,胡志波,等.中国硅藻土资源及加工利用现状与发展趋势[J].地学前缘,2014,21(5):274-280.Z h e n g S L,S u n Z M,H u Z B,e t a l.S t a t u s a n d d e v e l o p m e n t t r e n d o f d i a t o m i t e r e s o u r c e s,p r o c e s s i n g a n d u t i l i z a t i o n i n C h i n a[J].E a r t h S c i e n c eF r o n t i e r s,2014,21(5):274-280.[2]贾凤梅,陈俊涛,黄鹏.硅藻土的加工与应用现状[C]//中国非金属矿工业协会.2006中国非金属矿工业大会暨第九届全国非金属矿加工应用技术交流会论文专辑.北京:‘中国非金属矿工业导刊“编辑部,2006:69-72.J i a F M,C h e n J T H u a n g P.P r o c e s s i n g a n d a p p l i c a t i o n s t a t u s o fd i a t o m i t e[C]//C h i n a N o n-Me t a l l i c M i n e r a l s I n d u s t r y A s s o c i a t i o n2006C h i n a N o n-m e t a l l i c M i n e r a l I n d u s t r y C o n f e r e n c e a n d t h e N i n t h N a t i o n a l N o n-m e t a l l i c M i n e r a l P r o c e s s i n g A p p l i c a t i o n T e c h-n o l o g y E x c h a n g e A l b u m.B e i j i n g:E d i t o r i a l D e p a r t m e n t o f C h i n a N o n-M e t a l l i c M i n i n g I n d u s t r y,2006:69-72.[3]孟建平,范瑾初.硅藻土过滤(D E F)技术的研究[J].中国给水排水,1994,10(2):8-11.M e n g J P,F a n J C.S t u d y o n d i a t o m i t e f i l t r a t i o n(D E F)t e c h n o l o-g y[J].C h i n a W a t e r S u p p l y a n d D r a i n a g e,1994,10(2):8-11.[4]C h r i s t o f e r s o n G O.T h e i m p a c t o f d i a t o m i t e f i l t e r a i d o n b e e r f l a v o r[J].T e c h n i c a l Q u a r t e r l y-M a s t e r B r e w e r s A s s o c i a t i o n o f t h e A-m e r i c a s,2003,40(4):290-292.[5] M a r t i n o v i c S,V l a h o v i c M,B o l j a n a c T,e t a l.P r e p a r a t i o n o f f i l t e ra i d sb a s e d o n d i a t o m i t e s[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f M i n e r a l P r o-c e s s i n g,2006,79(2-4):255-260.[6]茆亮凯,张林生.饮用水硅藻土过滤技术研究进展[J].环境工程,2010,28(S1):39-42.M a o L K,Z h a n g L S.R e s e a r c h p r o g r e s s i n d i a t o m a c e o u s e a r t h f i l-t r a t i o n t e c h n o l o g y f o r d r i n k i n g w a t e r[J].E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r-i n g,2010,28(S1):39-42.[7] H e r a c l e o u s L.W h e n l o c a l b e a t g l o b a l:T h e c h i n e s e b e e r i n d u s t r y[J].L o n d o n B u s i n e s s S c h o o l R e v i e w,2010,12(3):37-45. 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海洋生物技术DOC

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第一章绪论1.1 课程介绍海洋生物技术是20世纪80年代发展起来的高技术群,是现代生物技术与海洋生物学相交叉的产物。

海洋资源丰富,通过海洋生物技术手段可以从海洋中开发利用海洋资源。

我国是海洋大国,海洋生物技术专利在我国海洋科技和海洋经济发展中占有重要地位。

是生物技术专业的必修课。

教学重点:海洋生物技术主要包括海洋微生物生物技术、海洋动物生物技术、海洋大型藻类生物技术、海洋生物资源遗传多样性检测技术、海洋生物资源种质保存技术、海洋环境检测与保护生物技术、病害的检测与防治等生物技术。

不同的生物技术侧重点各有不同,重点要清楚原理和技术方法及相关应用。

教学难点:生物技术是一个综合学科,海洋生物技术是海洋生物学和生物技术的交叉学科。

涉及的知识点较多,需要的背景知识较多,并且生物技术发展较快,因此教学难点是一些较新技术方法及原理的讲解,技术及原理较繁琐,难以理解。

1.2 课程安排2 课程基础2.1 海洋生物2.2 生物技术2.3 海洋生物技术2.4 海洋生物技术的发展2.5 海洋生物技术主要研究内容2.1 海洋生物2.1.1 海洋动物海洋动物现知有16~20万种,它们形态多样,包括微观的单细胞原生动物,和长达30余米、重 190吨的高等哺乳动物──蓝鲸等;分布广泛,从赤道到两极海域,从海面到海底深处,从海岸到超深渊的海沟底,都有其代表;按生活方式划分,海洋动物主要有海洋浮游动物zooplankton 、海洋游泳动物Nekton和海洋底栖动物Benthos三个生态类型;按分类系统划分,动物界共有33个门,海洋中特有15个门。

海洋生态系和非海洋生态系中的动物界门类比较浮游动物(zooplankton)浮游生物:是指在水流运动的作用下,被动地漂浮在水层中的生物群。

原生动物(protists)浮游甲壳动物(crustacean plankton)——桡足类、磷虾类、端足类、樱虾类、枝角类、介形类、糠虾类、涟虫类、等足类等水母类和栉水母类毛颚类:又称箭虫被囊动物有尾类也称幼形类原生动物(protists):游泳动物 Nekton包括海洋鱼类、哺乳类(鲸、海豚、海豹、海牛)、爬行类(海蛇、海龟)、海鸟以及某些软体动物(乌贼)和一些虾类等。

海洋生物技术1教材

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海洋⽣物技术1教材海洋⽣物技术重点1.海洋占地表的71%,⽣物圈的85%,⽔圈的97.5%,共3.6亿Km2,深度>500m占66%最深的是11521m。

2.近海太阳能有光合作⽤,深海,⿊暗地热3.海洋是“蓝⾊聚宝盆”:海洋油⽓,海洋⾦属矿藏,海洋能源,海⽔,海洋⽣物课程主要内容:1、海洋⽣物学/资源与技术概论2、海洋⽔产养殖与技术篇章3、海洋⾷品开发与技术篇章4、海洋药物开发与技术篇章5、海洋微⽣物资源与开发技术篇6、海洋环境保护与⽣物技术篇《海洋⽣物资源的综合利⽤》、《海洋⽣物技术》、《海洋⽣物技术研究进展》绪论1.⽣命起源宇宙⼤爆炸,地球产⽣,原始⼤⽓⽆机⼩分⼦(⼩分⼦有机物,有机⾼分⼦,多分⼦体系,原始⽣命)现代⽣物界2、⽣物种类(100多万)海洋微⽣物:病毒,细菌,真菌海洋动物:浮游⽣物,底栖⽣物,游泳⽣物海洋植物:海藻(微型,⼤型),种⼦植物红树林富含单宁酸,氧化后为红⾊,故称“红树”,⽣长于陆地与海洋的交界滩涂浅滩。

作⽤:防风消浪,促淤保滩3、海洋微⽣物占海洋⽣物总量的90%,0.1-2亿种,包括病毒、古菌、细菌、粘细菌、微藻、真菌等;研究内容:新物种,新活性次级代谢产物发现,⽣物遗传-代谢调控,地化循环4、海洋是⼗分独特的⽣态环境:⾼盐、⾼压、低温、低光照、寡营养、⽆光、局部⾼温分解者:促进物质循环,微⽣物多是分解者5、海洋⽣物资源特点:多样性:数量种类远超陆地⽣物再⽣有限性:通过⾃⾝调节,不断更新再⽣波动性:数量会随海洋环境变化共享性:财富公共性游动性:少数固着⽣活外,都游动隐蔽性:数量与变化难以直接观察6、海洋⽣物分类:⽣物七级分类单元(分类阶元或分类群)界Kingdom(拉:Regnum) 门Phylum或Division(拉Divisio)纲Class(Classis) ⽬Order(Ordo) 科Family(Familia) 属Genus 种Species在这七级中,在必要时每⼀级都可有若⼲辅助单元,故共可有⼗余级。

微生物菌种资源库

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微生物菌种资源库微生物菌种资源库建设方案通过建立微生物菌种资源库,进一步整合我公司的菌种库,以及南开大学和天津市各大医院的菌种资源。

业务包括:菌种收集、保存、复核、鉴定、销售与评估;专利微生物的寄存;产业用优良菌种之开发及应用;各项与微生物有关之委托试验和合作开发。

基地除了保存各类微生物,如细菌、酵母菌、丝状真菌,也保存质体和宿主、病毒和细胞株,从而整合具有一定科学意义、有实际或潜在研究应用价值的细菌、真菌、病毒及相关的信息资源,重点开展农、林、医、药、食品、兽医、海洋基础研究及教学实验用微生物菌种资源的共享体系建设;建立国家微生物菌种资源库和服务管理信息系统。

将进一步建设和完善应用于微生物菌种分离鉴定的生化实验室和分子生物学实验室,配置PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像仪、微生物生化鉴定仪等先进设备,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等系列序列分析软件。

开辟100m2的微生物菌种库库房,配置-80℃低温冷冻保藏冰箱20台、液氮超低温冰箱2台及自动监控系统2套。

任务包括:●菌种的收集:微生物菌种收集途径主要包括:自行分离、交换、购买、接受捐赠、接受委托保藏。

●菌种的分离与鉴定:利用先进的生物科学仪器和从事分类鉴定的专业化人员队伍,为国内科研机构、大专院校和生产企业等提供微生物菌种的鉴定服务,可鉴定细菌、病毒、酵母和丝状真菌等多种微生物。

菌种鉴定手段包括常规鉴定、Biolog碳源自动分析鉴定和分子生物学鉴定等。

●菌种的保藏:针对不同的微生物的特点,采用合适的保存方法,包括:定期移植法,液体石蜡保藏法,沙土管保藏法,冷冻干燥,-80℃低温冷冻保藏,液氮超低温保藏等。

建设合理性最近,在自然科技资源平台建设方面,国家启动了“微生物菌种资源描述标准和规范研究制定及共享试点建设”和“微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程”项目。

项目立足于中国微生物菌种资源的保藏现状,紧密跟踪科学发展前沿,以微生物菌种资源整理、整合、安全保藏、保障生物安全、共享和利用为主要目标,规定了微生物菌种资源基本信息和性状描述的要求,规定了微生物安全操作技术规范和微生物菌种资源收集、整理、复核和保藏的程序与方法,为促进资源的高效共享和持续利用提供了条件。

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文章编号:1671-1114(2009)01-0059-04一株渤海丝状海洋真菌的分子生物学复核鉴定收稿日期:2008-10-10基金项目:国家自然科学基金项目(30270877);天津市科委科技攻关重点项目(05YFGZGX04400);天津师范大学青年基金(52LJ69)第一作者:张丽琳(1982)),女,硕士研究生.通讯作者:孟庆恒(1961)),男,副教授,主要从事应用微生物学研究.E -mail:hsxym qh @张丽琳,冯 欣,孟庆恒,孙建华(天津师范大学化学与生命科学学院,天津300387)摘 要:采用真菌形态观察的标准培养条件,结合18S rDN A -IT S 片段克隆测序和序列特征G eneBank 比较分析,对本实验室分离保藏的海洋真菌Penicilli um sp.BH 06进行了培养特征和显微形态的复核鉴定研究,依据分子生物学和形态结构特征,认定该菌株应修订为桔青霉(Penicillium citrinum ).研究结果提示,基于传统形态学观察并结合IT S 序列分析,可为丝状真菌的分类鉴定提供可靠的分子生物学依据.关键词:渤海;丝状海洋真菌;复核鉴定;18S rDN A 中图分类号:Q 939.5 文献标识码:AMorphological and molecular identification ofa marine filamentous fungus from Boha-i SeaZH AN G L ilin,FEN G X in,ME N G Qingheng ,S UN J ianhua(College of Chemistry and Life Science,Tianjin Normal University,T ianjin 300387,China)A bstract:T he filamentous fungal str ain of Penicillium sp.BH06,which w as obtained from Boha-i Sea,was r echecked viaits morphological properties binding a further assay of 18S rDNA Internal Transcribed Spacer (IT S)r egion under the stand -ard culture condition.T he sequence of the 18S rDNA -IT S reg ion w as revealed thr ough Blast from GeneBank after it w as cloned and sequenced.T he results sug gested that the strain o f Penicillium sp.BH06should be r edefined as to Penicillium citr inum .M oreover,assay ing of fungal 18S rDNA -IT S sequence could be a significant supplementary method integrated with its mo rphological identification to the classification of filamentous fungi.Key words:Boha-i Sea;ma rine filamento us fung i;recheck identification;18S rD NA海洋真菌生活在高盐、高压、低氧、低温等特殊生境中,相对于陆生微生物而言,特殊的生活环境造就了海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上的多样性.近年来,海洋真菌代谢产物的研究和开发应用已取得较大进展,主要集中在新型活性物质提取和药物研发领域[1-9].尽管如此,考虑到大量微生物的/不可培养性0以及海洋生境的特殊性,开发海洋真菌种质资源仍然任重道远[10-13].到2000年,被描述过的海洋真菌仅有444种,不足陆生真菌(约5万种)的1%[6].此外,不同的海域生境也分布着不同的生物种群,渤海水域由于其特殊的地理位置和生境,其真菌类群及分布的调查显得更具海洋生态和资源开发的特殊意义.传统的真菌分类鉴定以形态特征和生理生化指标为基础,在有性阶段缺如时,该方法则受到一定的局限.随着分子生物学的发展,分子生物学技术在真菌分类领域的作用已得到广泛认可.以IT S 序列作为分子标记的生物学技术现已广泛应用于真菌的分类鉴定.ITS 作为分子分类指标具有以下优点:快速的协同进化适合种及种以下水平的分类研究;其变异以点突变为主,突变位点相互独立;通过上、下游rDNA 保守序列的通用引物,可以对广泛的种类进行PCR 扩增和测序,并作为分类的通用标记;基于ITS 序列具有片段较小、多拷贝、需样量少等优第29卷 第1期2009年1月 天津师范大学学报(自然科学版)Jour nal of T ianjin N orma l U niver sity (N atural Science Edit ion)V ol.29N o.1Jan.2009势,通过PCR扩增便可实现真菌物种的分子鉴定,该法适用于种间、种内和差异较明显的菌群之间的系统发育分析[14-16].据此,本研究通过18S rDNA-ITS区段序列测定,结合核酸序列数据库GeneBank同源性检索比对,对本实验室从渤海海域分离的、与鉴定资料存在细微差别[17]并具有一定生物活性功能的Penicillium sp.BH06菌株进行了复核鉴定,旨在确定其确切分类地位,为该菌株的进一步开发和应用奠定系统分类学基础.1实验材料及方法1.1材料实验菌株Penicillium sp.BH06由本实验室筛选.查氏培养基(北京双旋微生物培养基制品厂生产).查氏海水培养基配置时,蒸馏水与海水的体积比为4B6.真菌液体培养基为去皮土豆300g/L,蔗糖20g/L,麦芽糖2g/L.吕氏碱性美蓝染液[18].1.2菌种鉴定1.2.1形态观察(1)菌株培养.采用/点植法0将菌种接种于查氏和查氏海水培养基上,25e恒温培养获得菌落.每隔7d测量菌落直径,记录初生菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、局限性、有无色素产生等.(2)制片及镜检.挑取菌株产孢器及菌丝制成水封片,吕氏碱性美蓝染色,然后进行镜下观察,记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构,最后用Leica DME(M VC2000)显微仪摄像.1.2.218S rDNA-IT S序列分析1)菌株的发酵培养.挑取真菌孢子接种于液体培养基中,在25e条件下,以120r/min摇床培养4d,抽滤后收集菌丝球,无菌水冲洗后于-80e保存备用.2)DNA提取.采用液氮冰冻研磨法提取真菌DNA.3)PCR扩增.以ITS通用引物ITS86(5c-GT G AAT CAT CGA ATC T T T GAA C-3c)和ITS4 (5c-T CC TCC GCT TA T TGA T AT GC-3c s)[19],对供试材料的rDNA-ITS序列进行PCR扩增. IT S-PCR的扩增体系为:10@PCR Buffer5L L, 2.5mm ol/L dNT Ps4L L,5U/L L Taq DNA酶0.25L L,20L m ol/L IT S86/IT S4引物各1L L,模板DNA1L L,ddH2O37.75L L,反应总体积为50L L.扩增反应在BioRad PCR扩增仪上进行: 94e预变性5min;94e变性50s,51e退火50s, 72e延伸2m in,共30个循环;最后于72e补平10m in,终止温度为10e.每次试验时同时做阴性对照以检测试剂和模版DNA是否被污染.扩增产物的检测:取反应产物4L L于1%琼脂糖凝胶上电压90V电泳1h后取出,溴化乙锭溶液浸泡15min 后,在紫外分析仪中观察并照相.4)18S rDNA-ITS片段的回收、克隆及测序.采用BioTech公司的DNA凝胶回收试剂盒,从1%的琼脂糖凝胶中回收IT S片段.回收片段用大连宝生物工程公司的pUCm-T v ecto r连接,连接体系为: 10@连接缓冲液1L L,50%PEG40001L L,pUCm-T载体1L L,T4DNA连接酶1L L,PCR产物4L L,无菌去离子水2L L,置于16e连接8h以上.将连接液转化于大肠杆菌DH5A(BioDev, U SA)菌株感受态细胞中,经蓝白斑筛选后,用碱裂解法提取质粒进行PCR扩增和电泳检测.将菌株送上海生工生物工程有限公司完成测序.5)IT S序列比较.对所测得的IT S序列和从GenBank中通过Blast检索获得的参考序列进行多重对位排列(Multiple alig nm ents),确定其种属.2实验结果依据5真菌鉴定手册6[20]和5常见常用真菌6[21]方法,对照试验菌株的培养特征及显微结构,结合IT S1-5.8S rRNA-ITS2序列分析对P enicillium sp.BH06进行分类鉴定.2.1形态观察P enicillium sp.BH06的菌落特征见图1.图1a显示,菌落在查氏海水培养基中生长局限,于25e培养7d,其直径为22~24mm,表面绒毡状,呈灰绿色后转为灰黑色,具放射状或环状沟纹,无分泌物,菌落反面慢慢呈橙色;初生菌丝为白色,气生菌丝不发达,营养菌丝由具横隔的分枝菌丝构成,分枝繁复.图1b显示,菌落在查氏蒸馏水培养基中生长缓慢,7d培养物直径为14mm,表面艾绿色,亦无渗出液.图1c显示,分生孢子梗自基质生出,长62.50~93.75L m,直径为1.25L m;通常三轮,二轮偶见;壁光滑,帚状枝由3~5个轮生且靠合的梗基构成,梗基长度12.50L m,直径 1.25~ 2.50L m;每个梗基上簇生5~8个略紧密平行的瓶状小梗,瓶梗平均大小为3.75L m@1.88L m;分生孢子近似球形,直径为1.88~ 2.50L m.#60#天津师范大学学报(自然科学版)2009年1月abca.查氏海水培养基上的菌落特征,b.查氏蒸馏水培养基上的菌落特征,c.菌株的分生孢子器图1 BH06的菌落特征及产孢器结构2.2 分子鉴定2.2.1 真菌核糖体IT S -PCR 扩增利用ITS 通用引物,从菌株总DNA 中扩增特异性片段,如图2)3所示.图2为真菌总DNA 电泳图,图3为供试菌株的ITS -PCR 扩增产物电泳图.图2 真菌总DNA电泳图图3 供试菌株的ITS -PC R 扩增结果由图2)3可见,从Penicillium sp.BH 06基因组DN A 中,引物ITS86/ITS4对可成功地扩增出唯一的1条带,即位于P enicillium sp.BH 0618S rDNA -IT S 区(ITS1-5.8S -IT S2)的一段IT S 序列,序列长度大约300bp.2.2.2 测序结果测序结果如下:T CCT CCGCT TAT TGATA TGCTT AAGTT TAC AAGGTAT CCCT ACCT GATCCGA GGTCAACC T GAGAT AATT AAAGGTT GGGGGT CGGCT G GCGCCGGCCGGGCCT ACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCG GTGCCGCCGCT GCCT TT CGGGCCCGTCCCCC GGCGGGGGGGACGGGGCCCAACACACAA TC CGGGCTT GA GGGCAGCAAT GACCTCGGACA GGCAT GCCCT CCGGAA TACCAGA GGGCGCA AT GT GCGT TCAAAGAT TCGA TGAT TCAC经Blast 检索比对,供试的18S rDNA -ITS 序列与P enicillium sp.M ZKI P -266(EU069417)和Penicillium citrinum (EU128640)的相似性达98%,结合形态观察,本研究将P enicillium sp.BH 06修订为桔青霉(P enicillium citrinum ).3 讨论真菌分类的最终目的是追求原生态的分类系统.传统分类方法主要依据其有性繁殖器官的形态,结合宿主、致病性等其他次要性状进行分类,该方法对于操作者的经验和熟练程度要求较高,培养条件要求严格,培养时间较长,少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定,特别对于尚未发现有性阶段的菌种而言,形态学表征作为鉴定的唯一依据尚显不足.姚粟等[22]在对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的23株19种曲霉属菌种进行形态学复核鉴定时发现,形态鉴定的准确性达到95.16%,他们结合IT S1-5.8S -IT S2序列分析将CICC 2106菌株由溜曲霉(Asp erg illus tama -r ii )修订为黑曲霉(Asp er gillus niger ).本研究在形态学观察的基础上,结合IT S 序列分析对菌株P enicillium sp.BH 06进行了复核鉴定,发现该菌株与分类手册[21]中桔青霉的描述在有无渗出液上存在出入,认为是由于高盐分的生长环境改变了其表型,可见海洋真菌在标准培养条件下经过长期驯化,其表性特征会有细微改变.实验结果表明,形态观察与分子鉴定结果基本一致,P enicillium sp.#61#第29卷 第1期 张丽琳,等:一株渤海丝状海洋真菌的分子生物学复核鉴定BH06应为桔青霉(P enicillium citr inum).本研究为基于传统形态学观察结合ITS序列分析作为真菌分类鉴定的方法提供了例证.海洋微生物的种质资源及其代谢产物都具有广泛的开发应用前景.近年来,关于海洋桔青霉代谢产物的研究已见诸报导:M.T suda[23-24],M.Sasa-ki[25]分别从源自日本红藻和海鱼胃肠道的海洋桔青霉代谢产物中分离出结构新颖的五环生物碱))) citrinadin A和四环生物碱)))perinadine A,以及3种新的吡咯烷生物碱scalusamides A-C,其中citr-i nadin A能抑制肿瘤细胞活性; C.Christophersen 等[26]从海洋生物中分离出227株专性及兼性海洋真菌,用H PLC分析了61株生态型不同的桔青霉代谢产物,发现桔霉素含量以及菌株的抗细菌活性均与其生态型无关; A.Baakza[27]比较了10种分别源自海洋和陆地的真菌,发现包括桔青霉在内的9种海洋真菌均具有分泌含铁细胞的能力.因此,本研究为该菌株代谢产物中的生物活性物质的开发提供了建设性参考.参考文献:[1]刘晓红,赵丽冰,佘志刚,等.海洋微生物活性代谢产物的研究进展[J].中国抗生素杂志,2004,29(8):492-510.[2]郭跃伟.国际海洋天然产物研究进展及展望[J].中国海洋药物,2002(90):53-56.[3]王正平,张庆林,胡艳红,等.海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究进展[J].化学工程师,2004(4):41-42.[4]刘全永,胡江春,薛德林,等.海洋微生物生物活性物质研究[J].应用生态学报,2002,13(7):901-905.[5]关美君,丁源,林文翰.海洋药物:21世纪中国药物研究的新热点[J].中国海洋药物,2001,20(1):1-5.[6]王琳,骆祝华,黄翔玲,等.海洋真菌及其活性物质的研究概况[J].台湾海峡,2002,21(3):367-371.[7]Boot Claudia M,Amagata T,Tenney K,et al.Four c lasses ofstructurally unus ual peptides from tw o marine-deri ved fungi:Struc-tures and bioactiviti es[J].Tetrahedron,2007,63:9903-9914. 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