利用ITS序列鉴定真菌

北方民族大学实验论文

题目：利用ITS序列鉴定真菌

学院：生物科学与工程学院

专业：生物技术

班级： 082

姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽

张瑞莉陈波艾克拜尔

指导老师：刘建利

完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日

利用ITS序列鉴定真菌

李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波

（北方民族大学生物科学与工程学院银川750021）

摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。

关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定

1 材料与方法

1.1试验材料与试剂

实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。

YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。

裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。

醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。

氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。

70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。

10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。

1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备

表一实验中使用的主要仪器

仪器名称型号产地

立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂

数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司

电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂

制冰机AF200PSC50R ΜSA

生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany

电子精密天平HR-200 上海精科天平

酸度计DELTA302 上海

电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂

紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂

台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany

微量移液器多型号Germany

生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司

基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia

电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂

1.3实验方法

1.3.1酵母菌的活化及培养

采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4]，先将菌株接于斜面中，25℃培养24h，再转接入三角瓶中100ml/250ml，25℃培养24h，保存于4℃冰箱备用[5]。1.3.2酵母菌基因组DNA的提取

DNA的提取按照Makimura等[6]（1994）的方法进行。

⑴用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min，弃上清；

⑵加入250μl裂解液；

⑶100℃水浴15min；

⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h；

⑸在4℃下13000rpm离心5min，上清夜移至一新1.5ml离心管内；

⑹加入500μl的氯仿-异戊醇（24：1），剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内；

⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内；

⑻加入500μl的冷的异丙醇，放置在-20℃静置15min；

⑼13000rpm离心15min；

⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀；

⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀；

⑿将沉淀置于室温下干燥；

⒀加入50μl已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h；

⒁放于-20℃冷藏备用；

1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7]

⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。

⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。

⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。

⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示

出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏，直接用相机拍照)。

1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测

1.3.4.1 PCR反应体系见下表，于冰浴下进行[8]。

表二核糖体基因反应体系的组成（25µl体系）

试剂浓度体积(µl)

PCR缓冲液(包含TaqDNA

聚合酶、Mg2+和dNTP)

2.5×10

正向引物10 µM 0.2

反向引物10 µM 0.2

模板DNA 10 ng/µl -1 µg/µl 1.0

ddH2O 13.6

1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。

表三核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件

扩增片段引物(5’-3’)PCR扩增反应条件

ITS1区ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG

ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC

95℃5min；(94℃45s，52℃1min，

72℃30s)×30；72℃8min。

1.3.4.3 PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。

1.3.5 ITS片段的测序

将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。

1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种

登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。

2 结果与分析

2.1基因组DNA电泳图

图一酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

如上图所示，标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；C为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark，共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段，根据原图对