分离与菌种 鉴定

《高级微生物实验指导》

一、目标微生物的分离与鉴定

在无菌条件下取样品10 g加入100 mL无菌生理盐水，用均质机将组织破碎均匀。经充分震荡做成1:10的均匀稀释液。用1 mL的灭菌吸管吸取1:10稀释液，注入9 mL灭菌生理盐水的试管内，震荡试管混匀，按上述操作依次进行10倍递增稀释，选择3个适宜的稀释度，每个稀释度做2个平行，用灭菌涂布棒均匀涂布于冷却的细菌分离培养基（NA）和真菌分离培养基（PDA）表面，分别将细菌培养基和真菌培养基于30℃和28℃下恒温培养2-4d。待菌长出后，挑取不同形态菌落，纯化，挑取单菌落于PDA斜面上，培养并保存。

二、细菌与霉菌总DNA的提取（CTAB法）

1、菌株DNA的提取通用试剂

（1）CTAB抽提液：2%CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0；（2）β-疏基乙醇

（3）PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

（4）石英砂

（5）Tris平衡酚

（6）氯仿：异戊醇（24:1）

（7）异丙醇

（8）75%乙醇

（9）无水乙醇

2、菌株DNA的提取步骤

(1) 将已纯化的菌种，接种于相应的分离培养基平板上，28℃培养2d-4d。

(2) 用灭菌药勺或解剖刀从培养皿中刮取足量菌丝至1.5ml离心管中。

(3)加少量PVP、灭菌海砂和65℃水浴预热的200μl CTAB抽提液，用玻璃棒研磨至匀浆；

(4)加入400ul预热CTAB抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1h；期间轻柔颠倒混匀2-3次。

(5)冷却至室温后，12000rpm离心10min，上清液移至另一离心管中；

(6)加入1/2体积（约300ul）的Tris平衡酚及1/2体积（约300ul）的氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀。

(7)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中；

(8)重复（5）-（7）步2-3次，直到两相界面处无明显杂质；

(9)加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀；

(10)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中；

(11)向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置15min；

(12)12000rpm离心10min，弃去上清液，加入70%乙醇500ul以悬浮沉淀；也可250ul 70%乙醇分两次悬浮沉淀；

(13)12000rpm离心5min，弃上清，室温干燥；

(14)加50ul无菌水或TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1M EDTA，pH8.0）重新溶解沉淀，-20℃储存备用；

(15)取3-5ul DNA样品在1%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下检测提取的真菌基因组DNA。

3、总DNA琼脂糖凝胶电泳检测

1）实验试剂：50×TAE为电泳缓冲液、琼脂糖、DNA Marker、6×Loading Buffer 、DNA 染料goldwiew 。

注：50×TAE电泳缓冲液（242gTris，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDT（pH8.0），加双蒸水至1000ml，用冰醋酸调节至pH8.0），使用时将上述溶缓冲液稀释50倍，使浓度为1×TAE。

2）实验仪器：北京六一电泳仪、微波炉、0.5~10ul移液枪、凝胶成像仪

3）实验步骤：

①制胶：称取0.12g的琼脂糖加10ml的电泳缓冲液，在微波炉里加热至沸腾，冷却至

50~60℃加入1ul的goldwiew混匀，之后倒入插好梳子的制胶器中。

②上样：将制好的琼脂糖凝胶放入已加有电泳缓冲液的电泳槽中，吸取PCR产物5ul

与1ul的6×Loading Buffer混匀，之后将混匀液加入胶孔中。

③电泳：电泳电压80v,待蓝带下移至2/3处时停止电泳，将凝胶拿出放在凝胶成像仪

中观察拍照。

注：MARK为λ-Hind III DAN Marker

三、16S rRNA 或18S rRNA PCR扩增与鉴定

1、通用引物

真菌ITS-rDNA基因通用引物：

ITS1：5‘-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’

细菌与放线菌16S rRAN基因通用引物：

27F: 5‘- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’

1492R: 5‘- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’

2、以总DNA为模板的16S rRNA 或18S rRNA PCR

①霉菌的扩增：

反应体系：选用25 µL 反应体系。其中模板DNA 1 µL，ITS1（10 µmol·L-1）1 µL，ITS4 （10 µmol·L-1）1 µL，Master Mix 12.5 µL，补充ddH2O至25 µL 。

PCR反应条件：94 ℃变性5 min;94 ℃变性50 s,58℃退火50 s,72℃延伸60s,循环30 次；最后72℃延伸10min。

②细菌的扩增：

反应体系：同上

反应条件：细菌的PCR扩增条件：

98 ℃ 2 min

98 ℃10 sec

55 ℃15 sec 40个循环

68 ℃90 sec

10 ℃10 min

3、菌落16S rRNA 或18S rRNA PCR

实验准备：新鲜菌落、无菌牙签、0.5~10ul移液枪、冰盒、PCR管PCR仪①细菌PCR扩增体系：

2×MightyAmp Buffer Ver.2 10μL

MightyAmp DNA Polymerase（1.25U∕μL）0.5μL

Eubac27F （10 pmol∕μL）0.5μL

Eubac1492R（10 pmol∕μL）0.5μL

模板微量菌体

ddH2O 8.5μL

总体系20μL

②细菌的PCR扩增条件：同上

98 ℃ 2 min

98 ℃10 sec

55 ℃15 sec 40个循环

68 ℃90 sec

10 ℃10 min

4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

同总DNA检测，MARK用的是DL2000 DAN Marker