菌种鉴定流程
16srna菌种鉴定建树流程
16srna菌种鉴定建树流程英文回答：To identify and build a phylogenetic tree for 16S rRNA bacterial species, several steps need to be followed. The16S rRNA gene is commonly used for bacterial identification due to its conserved regions that allow for comparison across different species. Here is a general outline of the process:1. Sample collection and DNA extraction: The first step is to collect bacterial samples from the environment or the host organism. This can be done by swabbing surfaces, collecting soil or water samples, or isolating bacteriafrom clinical specimens. Once the samples are obtained, DNA extraction is performed to isolate the bacterial genomic DNA.2. PCR amplification of the 16S rRNA gene: The 16S rRNA gene is then amplified using polymerase chain reaction (PCR)with specific primers. These primers target conserved regions of the gene that are present in all bacterial species. The PCR amplification results in multiple copies of the 16S rRNA gene.3. DNA sequencing: The amplified 16S rRNA gene is then subjected to DNA sequencing. There are several sequencing technologies available, such as Sanger sequencing or next-generation sequencing (NGS) platforms. The sequencing results in obtaining the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.4. Sequence analysis and alignment: The obtained 16S rRNA gene sequences are then analyzed and aligned using bioinformatics tools. This step involves comparing the sequences to known databases, such as the NCBI's GenBank, to identify similar sequences and assign taxonomic information to the bacterial species.5. Phylogenetic tree construction: Once the sequences are aligned, a phylogenetic tree is constructed. This tree represents the evolutionary relationships between differentbacterial species based on their 16S rRNA gene sequences. Various software programs, such as MEGA or PHYLIP, can be used to build the phylogenetic tree using different algorithms, such as neighbor-joining or maximum likelihood.6. Tree visualization and interpretation: The final step is to visualize and interpret the constructed phylogenetic tree. The tree can be displayed using tree visualization software, such as FigTree or iTOL. The tree can provide insights into the relatedness and evolutionary history of the bacterial species included in the analysis.中文回答：鉴定和构建16S rRNA菌种的系统发育树需要遵循几个步骤。
菌种鉴定流程课件
菌种鉴定是微生物学研究的重要基础工作 ，对于揭示微生物的生态和进化关系、探 索生命科学的基本问题具有重要意义。
02
菌种采集
采集方法
01
02
03
采集方式
根据菌种类型和特性，选 择合适的采集方式，如表 面涂抹、深层挖掘等。
采集工具
根据采集需求，准备适当 的采集工具，如铲子、刀 具、试管等。
采集环境
选择适当的采集环境，如 土壤、水源、动物粪便等 ，并确保环境无污染。
ABCD
稀释分离法
将菌液进行稀释，然后涂布在培养基上，使菌落 分散生长，达到分离纯化的目的。
温度、pH等物理因素分离法
通过调节培养温度、培养基pH等物理因素，使 特定微生物生长繁殖，达到分离纯化的目的。
分离纯化的步骤
采集样品
选择适当的样品，并确保样品无 菌操作。
选择培养基
根据分离的微生物种类选择适宜 的培养基。
采集注意事项
采集安全
在采集过程中，注意个人 安全和卫生，避免交叉感 染。
采集代表性
确保采集的菌种具有代表 性，能够反映该地区的菌 种分布和特点。
采集量控制
根据需求适量采集，避免 过度采集和破坏生态环境 。
采集后的保存
保存容器
选择适当的保存容器，如密封袋 、试管等，并确保容器无菌。
保存环境
选择适当的保存环境，如干燥、阴 凉、避光等，以保持菌种的活性。
和鉴别。
结果分析的注意事项
1 2
准确性
确保鉴定结果的准确性，避免误差和偏差。
完整性
确保鉴定结果的完整性，涵盖菌种的所有相关信 息。
3
可重复性
确保鉴定结果的可重复性，以便于验证和复现。
细菌鉴定的一般步骤
新属的判定依据
16S rRNA序列同源性在95%以下 拥有该科的共有特性 与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异 生理生化差异明显 极性脂成分有差异 注意：判定依据要根据实际情况而定
七、几个发育树例子的分析
地衣芽孢杆菌模式种的生理生化特性
分类在一个支上，同源性大于99%，初步判定 为地衣芽孢杆菌
细菌鉴定的一般步骤
办公室：综合楼B419 邮箱：
一、确保菌株的纯度
在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度。 假若菌株没有纯化好，将会做大量的无用功
二、PCR扩增16S rRNA片段
菌落直接PCR 菌体新鲜、加菌量少、阴性菌较阳性菌容易、 退火温度要高点
DNA扩 PCR 高盐法或CTAB法提取细菌总DNA DNA量不要加太多
五、发育树的构建及作用
确认目标菌株跟模式菌株间的遗传距离 确认目标菌株的分类定位 同源性较低，认定可能为新种或新属，有必要重新扩
增序列克隆测序
六、序列同源性差异分析
16S rRNA序列同源性在大于97% 慎重考虑
16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新种的意义
16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新属
Lm et al. IJSEM (2006), 56, 2409–2414Ancylobcter rudongensis
IJSEM (2004), 54, 385–388
Angulomicrobium amanitiforme
IJSEM (2004), 54, 651–657
生理生化性质
IJSEM (2004), 54, 651–657
选择模式种进行实验
菌种 15561 Angulomicrobium amanitifo 培养基编号： 1 830
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。
菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。
下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。
一、形态学鉴定1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。
2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。
二、生理生化特性鉴定1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。
可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。
2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。
三、分子生物学特征鉴定1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。
2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。
菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。
其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。
这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。
在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。
2. 革兰氏染色按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。
3. 鞭毛染色挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。
滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
自然干燥后用油镜观察。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
4. 糖类分解试验将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。
如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。
培养基仍呈蓝色，说明未产酸。
选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。
5. 吲哚（靛基质）试验将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。
于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。
6. 淀粉水解试验将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。
将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。
9. V－P试验将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。
数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。
10.甲基红（M.R）试验接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。
11. 柠檬酸盐利用试验将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
环境微生物菌种鉴定
环境微生物菌种鉴定微生物是地球上数量最多的生物，它们在我们的生活和环境中无处不在。
为了更好地利用和保护这些微生物资源，我们需要对它们进行鉴定和分类。
本文将介绍环境微生物菌种鉴定的基本方法和应用领域。
一、微生物菌种鉴定的基本方法1、形态学鉴定形态学鉴定是根据微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征对其进行分类和鉴定的一种方法。
通过观察菌落的形状、大小、质地、颜色、边缘特征等，可以初步判断微生物的种类。
2、生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测试微生物对各种底物的发酵反应和代谢产物的性质，判断其生理生化特性，从而对其进行分类和鉴定的一种方法。
常见的生理生化试验包括糖发酵试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验等。
3、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是基于微生物基因组序列差异对其进行分类和鉴定的方法。
该方法通过提取微生物基因组DNA，进行PCR扩增，然后进行序列比对，判断微生物的种类和亲缘关系。
二、环境微生物菌种鉴定的应用领域1、环境保护环境微生物菌种鉴定在环境保护方面具有广泛的应用。
例如，在污水处理中，通过鉴定微生物的种类和数量，可以优化污水处理工艺，提高处理效率。
在土壤污染治理中，通过鉴定能够降解特定污染物的微生物种类，可以针对性地设计生物治理方案。
2、生物多样性研究环境微生物菌种鉴定在生物多样性研究中具有重要意义。
通过对不同生态环境中的微生物进行鉴定，可以揭示不同地区和不同气候条件下的生物多样性特征，为保护生物多样性和生态平衡提供科学依据。
3、生物技术应用环境微生物菌种鉴定在生物技术领域具有广泛的应用。
例如，在生物制药中，通过鉴定微生物的种类和代谢产物，可以发现新的药物资源和开发新的药物。
在农业微生物肥料开发中，通过鉴定微生物的种类和生理生化特性，可以研制出具有特定功能的微生物肥料。
三、总结环境微生物菌种鉴定是微生物资源保护和利用的重要手段。
通过形态学、生理生化和分子生物学等方法对微生物进行分类和鉴定，可以更好地了解和利用这些资源。
菌种鉴定方法
菌种鉴定方法实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作。
不论鉴定对象属哪一类，其工作步骤都离不开以下三步：①分离纯化菌种；②测定一系例必要的鉴定指标；③查找权威性的鉴定手册。
一、经典分类鉴定方法群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等* 形态个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等* 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等* 生理、生化反应酶；产酶种类和反应物性等* 代谢产物：种类，产量，显色反应等* 经典指标生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等* 生活史特点* 血清学反应* 噬菌体的敏感性* 其它二、现代分类鉴定方法* 近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展。
对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次上。
* （一）微生物遗传型的鉴定* DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。
每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间新缘关系的远近。
因此，测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标：1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 每一个微生物种的DNA 中GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA 中GCmol% 的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的GC mol% 范围。
DNA 中GC mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA 中GC 含量的变化范围一般在25 ％～75 ％；而放线菌DNA 中的GC 比例范围非常窄(37 ％～51%) 。
一般认为任何两种微生物在GC 含量上的差别超过了10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。
菌种鉴定实验过程
菌种鉴定实验过程一、仪器与试剂1仪器名称仪器来源型号测序仪Applied Biosystems 3730XL DNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司FR980恒温培养箱太仓市科教器材厂DHP-9162恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-CPCR仪Applied Biosystems 2720 thermal cycler 冷冻高速离心机BBI HC-2518R Surf系列精密单道可调移液器生工SP10-1000 1.试剂名称试剂来源cat. No.Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8255Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8259Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒生工SK8257DreamTaq-TM DNA Polymerase MBI EP0702dNTP 生工D0056琼脂糖BBI AB0014SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒生工SK8131DNA Ladder Mix maker 生工SM0337引物生工合成部合成枪头、PCR管、离心管等生工铸塑部生产克隆测序用pMD®18-T Vector 连接试剂盒Takara D101ASanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒生工SK8191二、实验过程1、基因组DNA提取按SK8255（细菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）试剂盒操作。
2、PCR扩增所属类别名称序列5'→3'扩增序列PCR长度/bp细菌7F1540RCAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA16S rDNA 1500bp左右27F1492RAGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT16S rDNA 1500bp左右真菌ITS1ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGA TA TGC内转录间隔区1和2600bp左右NS1NS6GTAGTCATATGCTTGTCTCGCATCACAGACCTGTTA TTGCCTC18S rDNA 1300bp左右酵母菌NL1NL4GCATA TCAATAAGCGGAGGAAAAGGGTCCGTGTTTCAAGACGG26S rDNAD1/D2区500bp左右2.2 PCR反应体系：试剂体积（μl）Template（基因组DNA 20-50ng/μl）0.510×Buffer（with Mg2+） 2.5dNTP （各2.5mM） 1酶0.2F（10uM）0.5R（10uM）0.5加双蒸H2O 至252.3 PCR循环条件：温度时间程序94℃4min 预变性94℃45 sec30 cycle55℃45sec72℃ 1 min72℃10 min 修复延伸4℃∞终止反应3、凝胶电泳1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察（见电泳图DNA Ladder Mix make）。
菌株鉴定流程总结
学习总结各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。
现将我在实验室学习的情况总结汇报。
一、细菌鉴定流程：1.表观观察鉴定：培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。
显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。
染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。
2.分子鉴定：细菌DNA的提取（试剂盒法）⑴将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。
⑵将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。
⑶向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。
如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。
⑷向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
⑸加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑹加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑺将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑻向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑼向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑽重复操作步骤⑼。
⑾ 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm 离心2min ，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
菌种鉴定方法大全
菌种鉴定⽅法⼤全⼀、⾦开瑞菌种鉴定服务简介在细菌/真菌的16/18SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌/真菌通⽤引物，扩增出细菌/真菌的16/18SrDNA⽚。
因此，16/18SrDNA可以作为细菌/真菌群落结构分析最常⽤的系统进化标记分⼦。
该鉴定⼿段试⽤于单种鉴定或者少量混杂菌种鉴定。
⾦开瑞拥有多种配套的通⽤菌种鉴定引物，实验周期短，可以帮您快速实现菌种鉴定。
服务流程引物设计合成—PCR扩增16/18S rDNA/ITS—PCR产物纯化—测序，序列⽐对分析客户提供基因组DNA：要求基因组DNA的浓度≥100 ng/µl，总体积≥20 µl，且⽆明显降解；平板或斜⾯：经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜⾯。
最终交付测序结果，BLAST⽐对得到细菌种属名称服务内容及说明服务名称服务周期（⼯作⽇）原核⽣物/16SrDNA 5-7真核⽣物/18SrDNA 5-7真菌ITS序列分析 5-7⼆、菌种鉴定⽅法介绍（1）常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和⽣理⽣化特征。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利⽤能⼒、各种代谢反应、酶反应等。
（2）BIOLOG碳源⾃动分析鉴定BIOLOG鉴定系统以微⽣物对不同碳源的利⽤情况为基础，检测微⽣物的特征指纹图谱，建⽴与微⽣物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微⽣物与数据库参⽐，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应⽤于⾷品和饮品企业、环保、海洋⽣物/⽔产品、制药、农业微⽣物、⽣物治理、化妆品、临床等领域的微⽣物鉴定试验中。
BIOLOG是⼀种微⽣物菌种快速鉴定系统，涉及⾰兰⽒阴性菌、⾰兰⽒阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微⽣物。
（3）分⼦⽣物学鉴定应⽤分⼦⽣物学⽅法从遗传进化⾓度阐明微⽣物种群之间的分类学关系，是⽬前微⽣物分类学研究普遍采⽤的鉴定⽅法。
CICC拥有微⽣物菌种分类鉴定的分⼦⽣物学实验室，配有PCR仪、⾼速冷冻离⼼机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
细菌分类鉴定规程
细菌分类鉴定规程细菌分类鉴定规程杜艳、余翔、罗国升新菌鉴定主要流程：1、潜在新菌的确定拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN ()或EzTaxon server 2.1() 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。
2、选择标准菌株构建进化树选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。
3、购买标准菌株根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。
具体信息可以在上查找。
标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。
2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重新分类。
总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。
4、表型特征实验培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。
细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。
特殊的细胞结构：鞭毛(着生位置、数量)，芽胞(形状、着生位置、是否膨大)，孢子(孢子形状、着生位置、数量、排列)，其它 (荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连鞘体等)。
超微结构：细胞壁、细胞内膜系统、放线菌抱子表面特征等。
菌种鉴定流程
2005年4月16日星期六
3.2.4
取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性 对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对 照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无 荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观 察比较，或将各管调换位置（阴性管居 中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光 强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察 时，亦可移去阳性对照管
2005年4月16日星期六
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2
菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用 量为0.1ml）
制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
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3.2.1 MUG法不必分离单个菌落
除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙 门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、 杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性 在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可 排除革兰阳性菌的干扰 志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难 生长，即使有生长，本法能检出。并且既 然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检
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3.2 MUG试验操作
以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、 供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液 各0.2ml，分别加入MUG－蛋白胨培养基 （培养基5.7）管，37℃培养4、24h后，将 各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光， 然后加欧波试液4～5滴于上述MUG管内，观 察液面颜色
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目得:建立菌种鉴定标准操作规程范围:适用于**＊***鉴定标准操作职责:内容:1整体操作步骤1、１纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应得培养基上（如TＳA)，划线分离,以出现微生物单菌落为止。
1、2挑取纯化后得单菌落，进行革兰染色、镜检,以确定待鉴定菌得革兰属性.1、3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性,则选用API２0NE试剂条进行鉴定;如发酵实验结果为阳性,则在经过细胞色素氧化酶实验后选用ＡＰI20E试剂条进行鉴定．1、4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定,如实验结果为阳性则选用API Stapｈ试剂条进行鉴定．1、5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞,则选用ＡPI 5０ＣHB试剂条进行鉴定;否则,根据运动性实验与过氧化氢酶实验结果选用AＰＩＣoｒｙne或其她试剂条进行鉴定。
１、6选定正确得试剂条以后,根据不同得ＡＰI试剂条得标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码,用API鉴定软件鉴定或查询待检菌得名称均可。
鉴定结果应记录,必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2、１染色剂得配制2、１、１结晶紫染色液：甲液:结晶紫1、０g９5%得酒精２0ml乙液：草酸铵０、８ｇ水8０mｌ将甲液与乙液混合均匀,静置48h使用,置密闭棕色瓶中储存。
２、1、2碘液：碘1、0g碘化钾2、0ｇ水３00ｍl配制时先用３～5ml水将碘化钾溶解,再加入碘,用力摇匀,使之全部溶解后,再加水稀释至30０ml,摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2、1、3稀石碳酸红溶液：碱性品红1、0g石碳酸5、0ｍl95%乙醇１0、0mｌ配制时用乙醇溶解碱性品红,然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml,摇匀。
2、2操作:２、2、１涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层.2、2、2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2~3次，以固定涂片.２、2、３染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本,染色1分钟。
菌种验证操作规程
菌种验证操作规程1.目的为菌种验证试验提供作业指导，保证菌种的纯度和良好生长力，保持其生物特性的稳定。
保证实验结果的可靠性和准确性。
2.适用范围本规范适用于新购买菌种及本中心所保藏菌种传代保种的验证试验。
3.职责3.1微生物检验室主管负责监督实施本操作规程。
3.2微生物室检验人员严格按该验证方法进行菌种的验证。
4.菌种确认试验主要内容4.1菌种的纯度确认4.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
4.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
4.2 菌种的特性确认4.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
4.2.2 菌种的确定方法用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
4.3根据不同菌种的生理生化特性做相应的鉴定试验，参照依据见下表。
5.菌种存活率验证将需要验证的菌种同时接种多个斜面，观察菌种的是否存活，然后进行记录，计算。
接种的斜面管总数－未存活的斜面数量/接种的斜面管总数·100％＝存活率6.相关记录菌种验证试验记录编制人：校核人：批准人：。
真菌鉴定方法
真菌鉴定的方法主要有直接涂片、墨汁涂片、涂片或组织切片染色和培养检查12。
1.直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。
取标本置玻片
上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火
焰上稍加热溶解角质后，轻轻加压盖玻片使标本透明即
可镜检。
可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。
2.墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。
取一
小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接
镜检。
3.涂片或组织切片染色：染色可更好地显示真菌形态和结
构。
革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等。
4.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接
种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养
1-3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。
细菌鉴定流程
变形杆菌-CLSI
• 菌落一定是有迁徙生长现象. • 奇异变形杆菌吲哚-,普通变形杆菌+ • 彭氏变形杆菌与奇异变形杆菌的鉴别
菌种
麦芽糖 鸟氨酸脱羧酶
彭氏变形杆菌 阳性 阴性
奇异变形杆菌 阴性 阳性
非发酵菌
试验
菌属
假单胞菌属 无色杆菌属
黄杆菌属
不动杆菌属 产碱杆菌属
丛毛菌属
摩拉菌属
氧化酶试 验
+
化脓性链球 A 菌
敏感
CAMP —
无乳链球菌 B
耐药
+
C群、G群 C、G
耐药
—
SMZ Rຫໍສະໝຸດ R Sβ溶血链球菌• 化脓性链球菌 • B群链球菌
杆菌肽试验
CAMP试验
化脓链球菌-CLSI
• BAP上孵育24H 后出现ß溶血,菌落直径 >=0.5mm,干燥,凸起或有边缘清晰的溶血 环.
• 革兰阳性球菌,成双或成链排列,触酶阴 性,PYR（吡咯烷酮酶）试验阳性可确认 为化脓链球菌
• 用血清凝集方法鉴定的准确性接近100%
无乳链球菌-CLSI
• 血平板上常表现为边缘光滑的窄的"溶血环" • 革兰阳性球菌成对或成链,触酶阴性; • 快速马尿酸盐水解试验阳性或快速CAMP因子
斑点试验阳性均可准确鉴定无乳链球菌 • 商用凝集试验鉴定该菌准确性接近100%
肠球菌
• 触酶试验阴性 • 七叶苷试验阳性 • 6.5%NaCl肉汤生长（高盐+）
矛盾实验
革兰阳性细菌鉴定卡GP -VITEK-2
• 局限性:VITEK-2 GP卡不能直接用于临床标本或含有
混合菌的样本，对过程的改变或修改都可能影响结果。 新的说明或罕见菌株不包含在GP数据库中，
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3.2.4
取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性 对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对 照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无 荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观 察比较，或将各管调换位置（阴性管居 中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光 强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察 时，亦可移去阳性对照管
2005年4月16日星期六
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3.2.1 MUG法不必分离单个菌落
除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙 门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、 杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性 在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可 排除革兰阳性菌的干扰 志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难 生长，即使有生长，本法能检出。并且既 然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检
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6 血浆凝固酶试验简介
主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 检测以试管法为参考方法
2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴验操作方法
无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支 加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液 0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］ 营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对 照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化 钠溶液0.5ml作阴性对照 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次， 直至24h
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2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
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5 氧化酶试验
5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新 配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐 渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。 若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应
2005年4月16日星期六
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B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的 VITEK系统等
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生化鉴定
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一、大肠杆菌检查法
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4 触酶试验
触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面 的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含 有触酶可能导致假阳性出现 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否 利于在有氧环境中生长
细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢， 具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌 氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生 （链球菌，此试验可用于菌种鉴别）
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菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用 量为0.1ml）
制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
药品微生物限度检查—— 控制菌检查
1
菌种分离鉴定流程
增菌 分纯 初步鉴别试验
革兰染色 生化试验 酶类试验 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴 定） 血清分型 毒素分析 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学， 基因序列等）
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全面鉴定
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8 自动化仪器
优点：
包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多， 可以提高菌种鉴定的准确率 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检 验提供保证 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴 定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更 多的选择和便利
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
15
6 凝固酶试验的结果判定
阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液 呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应； 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对 照管任何一管不符合要求时，应另制备血 浆，重新试验 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关 制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、 准确性
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2005年4月16日星期六
3.3 MUG与靛基质试验结果判定
如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基 质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻 轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线 于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h， 观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆 菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌 落生长时，供试品分离平板无菌落生长， 或有菌落但不同于下表所列特征，可判为 供试品1g或1ml未检出大肠杆菌
供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时 间，一般在4h、24h观察是否产生荧光，如 荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培 养至48h再观察结果 由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完 全相同，对底物和底物的浓度反应的差异； 培养基中选择因子的影响；培养温度；pH 的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分 的干扰等，对结果的判断亦有影响
中国药品生物制品鉴定所抗生素室 14
2005年4月16日星期六
6 凝固酶试验的注意事项
血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新 鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维 蛋白常已析出)易导致假阴性反应 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜， (动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观 察 试验时间过长容易导致假阴性
2005年4月16日星期六
了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌 落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下 面的试验
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2005年4月16日星期六
3
3.1 操作步骤 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细 胞结构使染料易透过 3.1.2 结晶紫染色-1分 3.1.3 碘液媒染-1分 3.1.4 乙醇脱色-30秒 3.1.5 沙黄复染-30秒
2005年4月16日星期六
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试验阳性图示
2005年4月16日星期六
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5.3
5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应 不可靠 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出 现假阳性。宜用玻璃棒或木棒 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲 基对苯二胺氧化变色不可用 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过 多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴 性反应 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验， 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性
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1
大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆 菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有 蟑螂埃希菌等四个种 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出 体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血 动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健 康，口服药品必须检查大肠杆菌 大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引 起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症
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3.2 MUG试验原理
2005年4月16日星期六
4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被β -葡糖 苷酸酶（GUD）水解，产生荧光 实验证明96％的大肠杆菌含GUD，约10％的沙门菌属一些 菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6％， 鉴于98％的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基 质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理 论上可使大肠杆菌的检出率达99％ 由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察， 没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临 床、食品、饮水、污水等的检测 MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性 （无荧光）、靛基质阴性（无色） 如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验 不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴 别
中国药品生物制品鉴定所抗生素室 26
3.2 MUG试验操作
以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、 供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液 各0.2ml，分别加入MUG－蛋白胨培养基 （培养基5.7）管，37℃培养4、24h后，将 各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光， 然后加欧波试液4～5滴于上述MUG管内，观 察液面颜色
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参看药典微生物限度检查法
有抑菌活性的检品应进行预处理
稀释法 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先 500r/min离心5min 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇 酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 同时做阳性和阴性对照