ITS菌种鉴定方-法

合集下载

its引物pcr体系学则

its引物pcr体系学则
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA片段的技术。

ITS （内转录间隔区）是真菌分类和鉴定的一种标记。

ITS引物PCR是一种基于PCR技术使用ITS序列进行菌种分类和鉴定的方法。

ITS引物PCR体系是包含DNA模板，引物，酶和缺失DNA，反应缓冲液和其他诸如浓度和pH值等条件的反应混合物。

常见的ITS引物包括ITS1和ITS4，是从内转录间隔区序列中选择的特定引物。

PCR反应分为三步，即变性、回退和延伸。

引物与DNA模板杂交，引物延伸成DNA链，扩增目标DNA序列，不断重复该过程可得到数百万个复制的DNA片段。

ITS引物PCR技术可以在短时间内快速确定真菌的系统分类位置和物种鉴定。

它简单易行，并可用于复杂菌群的鉴定。

因此，在微生物学、生态学、农业、食品科学等领域中得到了广泛的应用。

菌种鉴定方法大全

菌种鉴定方法大全一、金开瑞菌种鉴定服务简介在细菌/真菌的16/18SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌/真菌通用引物，扩增出细菌/真菌的16/18SrDNA片。

因此，16/18SrDNA可以作为细菌/真菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。

该鉴定手段试用于单种鉴定或者少量混杂菌种鉴定。

金开瑞拥有多种配套的通用菌种鉴定引物，实验周期短，可以帮您快速实现菌种鉴定。

服务流程引物设计合成—PCR扩增16/18S rDNA/ITS—PCR产物纯化—测序，序列比对分析客户提供基因组DNA：要求基因组DNA的浓度≥100 ng/μl，总体积≥20 μl，且无明显降解；平板或斜面：经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。

最终交付测序结果，BLAST比对得到细菌种属名称服务内容及说明服务名称服务周期（工作日）原核生物/16SrDNA5-7真核生物/18SrDNA5-7真菌ITS序列分析5-7二、菌种鉴定方法介绍（1）常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。

形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。

（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。

通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。

BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。

（3）分子生物学鉴定应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。

CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。

一种用ITS1区测序方法鉴定独活药材

一种用ITS1区测序鉴定独活药材的方法最近省食品药品检验研究院的一位老师想知道一些栽培的独活药材经过长期的人工种植是否产生了变种（药材成品的外观上差异确实挺大的），于是请我们的实验室尝试了一次从分子生物学角度来探索这些药材是否已经产生了变化。

一、实验目的鉴定6种独活药材的亲缘关系。

二、实验材料1.对照独活DH-0、待测样本DH-1、DH-7、DH-10、DH-14、DH-18药材图片如下：2.研钵、1.5ml离心管、2ml离心管若干。

3.植物/真菌DNA试剂盒（Simgen Cat.No.3200050）4.2×PCR Mix（Simgen Cat.No.7003100）5.ITS1区引物（F:CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA/R:GCTACGTTCTTCATCGAT）6.超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT,TP-213）、电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）、台式离心机（eppendorf centrifuge5415D）、超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）、电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）、PCR仪（Techne FPROG5Y Progene Thermal）三、实验方法（一）DNA提取1.称取50mg样本于研钵中，加入200μl65℃预热的Buffer PD和2μlβ-巯基乙醇，用力研磨至匀浆状。

2.研磨充分后加入800μl65℃预热的Buffer PD，继续研磨1分钟，使组织完全裂解。

3.转移800μl裂解产物至2ml离心管中，将离心管置65℃水浴30分钟。

水浴期间每隔5~10分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

4.加入800μl Buffer EX，用力混合均匀，12000rpm离心5分钟。

5.小心吸取上清，转入一个新的1.5ml管中。

6.在上清中加入等体积的Buffer GP，混合均匀。

ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用

2 ITS 在真菌分子检测中的应用
目前，关于真菌分子检测的研究主要是针对致病真菌进行的。传统病原真菌的检测主要基于形态学特征、致病性测定等。但是这种方法耗时长、程序繁琐，不宜从发病初期的植株中分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期检测。随着生物学的发展，很多生物技术应用于检测领域，如酶联免疫荧光技术。但是该方法利用多克隆抗体进行检测，特异性不强，实际应用中存在漏检现象［22］。近年来，利用 PCR 扩增病原真菌核糖体 ITS 基因片段进行病原菌检测得到了很大发展。由于核糖体基因
第1期
白树猛等：ITS 序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用
53
面的研究起步较早，发展迅速，而且研究的范围比较广泛，主要集中在黑粉菌、疫霉菌、轮枝菌等植物病原菌的分类和系
［12］［13］［14］
利用 ITS 分子标记技术进行分子检测已经广泛应用于炭疽病菌、大丽轮枝菌、黑斑病菌［27］、大豆疫霉菌等真菌分子检测中。
ITS 序列系统发育树。结菌株序列相似性较低。陈永青［8］等采用随机扩增多态性 DNA 技术和核糖体 ITS 序列分析，对 22 种拟茎点霉共 34 个菌株进行了系统发育研究，结果表明，两种技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定是可行的。杨雅云［9］等对马铃薯及番茄晚疫病菌的核糖体 DNA 的 ITS 区段序列分析表明，相似的序列使得生物学特性也很相似，从而确定它们的亲缘关系也就近。Karen 等［10］对 l7 属 44 种外生菌根菌 rDNA 上的 ITS 多样性进行了研究，证实了 ITS 区域种间多样性较高，而种内多样性较低。 Pritsch 等［11］系统研究了赤杨根系 16 种不同形态类型的外生菌根 ITS 的多态性，并与采集于 3 个赤杨林地的 28 种外生菌根菌的子实体 ITS 多态性进行了比较研究。国外这方

白僵菌菌株的ITS序列鉴定

Science &Technology Vision 科技视界白僵菌属Beauveria Vuill.是全球分布的最常见的土壤虫生真菌[1],包含有球孢白僵菌B.bassiana (Bals.-Criv.)Vuill.和布氏白僵菌B.brongniartii (Sacc.)Petch 这两种具有重要经济价值的种类。

前者是森林生态系统中最为常见的一种昆虫病原真菌,属世界性分布物种,是害虫虫口自然调节的重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料[2]。

因其具有致病性强、寄主范围广、对动物植物无害、不污染环境及易培养的优点,被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一[3]。

随着分子生物学技术的发展,相关技术也开始广泛被应用于昆虫病原真菌的分类和鉴定中。

ITS (内转录间隔区Internal Transcribed Spacer)ITS 区域序列的测定是目前真菌分类研究的一项重要技术手段,对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗传关系具有重要作用[4-8]。

ITS 区指的是5.8S rDNA、18S rDNA 和28S rDNA 之间的转录间隔区,因其进化相对迅速而具多态性与保守性,对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低水平的系统学研究,真菌的ITS 序列长度一般在550-750bp(碱基对)。

ITS 序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分类鉴定,也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。

本文以研究室保存的8株白僵菌菌株为研究材料,通过对其ITS 序列的鉴定,明确菌株的遗传背景,找出不同菌株间的遗传差异,为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。

1材料与方法1.1供试菌株随机选取8株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。

其编号分别为Bb01-Bb08。

1.2培养基液体SDY 培养基:蛋白胨1.0%,酵母粉1.0%,葡萄糖4.0%,pH 值7.0;PDA 培养基:200g 土豆去皮沸水煮20min,取汁,葡萄糖2.0%,琼脂粉2.0%。

基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品

基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【摘要】目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaera calvatia及其混伪品.方法:收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品,提取基因组DNA,经PCR扩增后双向测序.同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列.将所有序列进行剪切校准拼接后分析,基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树.结果:大马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0;脱皮马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0.003;紫色马勃的ITS序列种内最大遗传距离为0.003.大马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.019,脱皮马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.031,紫色马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.634.大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内最大遗传距离均小于它们与混伪品的种间最小遗传距离.NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支,表现出良好的单系性,能够与混伪品明显的区别开来.结论:基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2016(011)005【总页数】5页(P777-780,785)【关键词】马勃;混伪品;ITS;条形码【作者】张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【作者单位】武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;安利(中国)植物研发中心,无锡,214145;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700【正文语种】中文【中图分类】R282马勃Lasiosphaera calvatia为灰包科真菌脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.、大马勃Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，能够清肺利咽、止血，用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽；外治鼻衄，创伤出血[1]。

ITS菌种鉴定方法

利用ITS 进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。

ITS 是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。

其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。

这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。

每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。

本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。

种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。

ITS区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。

其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。

选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。

因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。

1、通用引物①：ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’通用引物②ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’。

真菌its鉴定

真菌its鉴定真菌（Fungi）是一类特殊的生物，可以在各种环境中生存并繁殖。

它们通常以分解有机物质为生，有着重要的生态作用。

在鉴定真菌时，我们可以使用ITS（Internal Transcribed Spacer）序列来进行分析和判断。

ITS序列位于真菌的核糖体RNA基因间区域，是真菌基因组中高度变异的部分。

通过对ITS序列的测定和比对，我们可以确定真菌的物种归属和亲缘关系。

ITS序列的鉴定已经成为现代真菌分类学的重要手段之一。

ITS序列的鉴定过程通常包括以下几个步骤：第一步是样品的采集和处理。

我们可以从土壤、水体、植物组织、动物体表等不同的环境中采集样品。

采集后，我们需要将样品进行处理，提取其中的真菌DNA。

第二步是PCR扩增。

在这一步中，我们使用特定的引物对样品中的ITS序列进行扩增。

PCR扩增是一种将目标DNA序列扩大数百倍的技术，可以提高后续的测序效果。

第三步是测序和比对。

在这一步中，我们使用测序仪对PCR扩增得到的产物进行测序。

测序结果将是一系列的碱基序列，我们可以将这些序列与已知的ITS序列数据库进行比对，以确定真菌的物种归属。

第四步是数据分析和解读。

在这一步中，我们将根据比对结果来判断真菌的物种归属和亲缘关系。

通常情况下，我们会将测序结果与数据库中的参考序列进行比对，并计算相似性和进化距离等指标来评估真菌的分类位置。

通过ITS序列的鉴定，我们可以辨别出不同物种的真菌，了解其在生态系统中的分布和功能。

这对于研究真菌的多样性、生态学和进化等方面具有重要意义。

除了ITS序列，还有其他一些DNA标记物可以用于真菌的鉴定，如18S rRNA、28S rRNA等。

不同的标记物具有不同的特点和应用领域，在具体的研究中可以根据需要选择合适的标记物进行分析。

总结起来，真菌的ITS序列鉴定是一种常用且有效的方法，可以帮助我们准确地鉴定真菌的物种归属和亲缘关系。

随着测序技术的不断发展和数据库的不断完善，我们对真菌的了解也将越来越深入。

真菌its鉴定

真菌its鉴定真菌ITS鉴定一、引言真菌是一类广泛存在于自然界中的生物，它们在生态系统中扮演着重要的角色。

然而，在许多情况下，真菌的鉴定对于研究者和生物学家来说是一项具有挑战性的任务。

近年来，随着分子生物学技术的发展，特别是通过ITS序列分析，真菌ITS鉴定成为了一种常用且准确的方法。

二、真菌ITS序列ITS（Internal Transcribed Spacer）序列是真菌基因组中的一段高变区域，位于核糖体RNA基因之间。

由于ITS序列的高变性和高保守性，它成为了真菌鉴定的理想标记。

ITS序列的长度通常在150到600个碱基对之间，其中包含了1个或多个转录间隔区（ITS1）和1个内转录间隔区（ITS2）。

通过测定ITS序列的核苷酸组成，并与已知真菌ITS序列进行比对，可以准确确定待鉴定真菌的种属归属。

三、真菌ITS鉴定的步骤1. 样品采集：首先，需要采集待鉴定真菌的样品。

可以选择从不同的环境中采集，如土壤、水体、植物组织等。

采样时要注意避免外部污染，并尽量保持样品的完整性。

2. DNA提取：将采集到的真菌样品进行DNA提取。

常用的DNA提取方法包括CTAB法、菌丝破碎法等。

提取的DNA应该具有足够的纯度和质量，以确保后续的PCR反应能够成功进行。

3. PCR扩增：使用特定的引物对ITS序列进行PCR扩增。

引物的选择应该基于已知真菌ITS序列的保守区域。

PCR反应的条件需根据引物的特性进行优化，以获得高效的扩增。

4. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确定扩增的片段大小和纯度。

通常使用琼脂糖凝胶和DNA分子量标记物来判读PCR产物的大小。

5. 测序和序列分析：对PCR产物进行测序，并将测序结果与已知真菌ITS序列进行比对。

可以使用多种软件和数据库进行序列比对和物种归属的确定，如BLAST、NCBI等。

6. 结果解读：根据比对结果，确定待鉴定真菌的物种归属。

通常，根据ITS序列的相似性百分比和支持率来判断物种归属的可信度。

基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究

摘要本实验是利用采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌子实体作为研究对象，通过常规CTAB法对该子实体进行基因组DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4对特异的DNA片段进行PCR扩增，将扩增产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，并在紫外透射反射分析仪下观察检测的结果，对于较好的扩增产物利用回收试剂盒进行纯化，后将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将测序所得到的序列输入GeneBank数据库中的局部相似性查询（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)程序进行比对，列出数据库中与所测得到的序列同源性较高的序列信息并进行分类鉴定，然后运用软件raxmlGUI进行系统发育树构建。

最终的研究结果显示该菌种属于报道的choiromyces helanshanensis。

关键词：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物学；鉴定AbstractIn this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongolia, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were tested by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of the gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong for DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequencedsequences and perform the classification and identification. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final results showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia.Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification目录引言 (1)1 材料与方法 (3)1.1 实验材料 (3)1.2 实验设备及药品 (3)1.2.1 试剂配方 (3)1.3 实验方法 (3)1.3.1 基因组DNA的提取 (3)1.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增 (4)1.3.3 PCR扩增产物的回收和纯化 (5)1.3.4 DNA测序分析 (5)2 结果与分析 (6)2.1 PCR产物的检测 (6)2.2 提纯效果的检测 (6)2.3 rDNA ITS序列的同源性分析 (7)2.4 raxmlGUI系统发育树分析 (9)3 结论与讨论 (10)参考文献 (11)致谢 (12)引言贺兰山坐落于宁夏回族自治区的西北部，是银川平原的原始屏障，也是三北防护林建设的重点地段[1]。

真菌核糖体its检测实操目的

真菌核糖体its检测实操目的真菌核糖体ITS检测实操目的目的：真菌核糖体ITS（Internal Transcribed Spacer）序列是一种常用于真菌分类和鉴定的分子标记。

ITS区域包含了16S和23S rRNA基因之间的非编码DNA序列，其高度变异性使其成为真菌物种鉴定的理想工具。

本实操旨在介绍真菌核糖体ITS检测的实际操作步骤和相关技术。

一、材料准备1. 真菌样品：选择需要进行ITS检测的真菌样品，可以是环境中采集得到的土壤、水样或植物组织，也可以是临床标本等。

2. DNA提取试剂盒：根据实验室使用情况选择适合的DNA提取试剂盒，如基于磁珠或柱子等原理的试剂盒。

3. PCR试剂盒：选择适合进行PCR扩增反应的试剂盒，包括聚合酶、引物、dNTPs等。

4. DNA电泳试剂：准备琼脂糖、TAE缓冲液和DNA染料等。

二、DNA提取1. 根据所选DNA提取试剂盒的操作手册，准备所需的试剂和设备。

2. 根据样品类型选择合适的提取方法，如土壤样品可以采用差异离心法或磁珠法，植物组织可以采用CTAB法等。

3. 按照试剂盒说明书的操作步骤进行DNA提取，注意保持操作环境的无菌和干净。

三、PCR扩增1. 根据所选PCR试剂盒的操作手册，准备所需的试剂和设备。

2. 设计合适的引物对，一般选择ITS1和ITS4引物对进行扩增。

根据需要可以选择其他引物对进行特定真菌属或种的扩增。

3. 准备PCR反应体系：将PCR试剂按照比例加入PCR管中，并加入模板DNA。

注意设置阴性对照组和阳性对照组。

4. 设置PCR反应条件：根据引物、模板DNA浓度等因素设置合适的PCR反应条件，包括温度、时间等参数。

5. 进行PCR扩增反应：将装有反应体系的管放入热循环仪中进行扩增反应。

四、电泳分析1. 准备琼脂糖电泳胶：按照比例将琼脂糖加入TAE缓冲液中，加热溶解后倒入电泳槽中，插入电泳膜。

2. 准备样品：将PCR扩增产物和DNA标记物混合，加入适量的DNA加载缓冲液，轻轻混匀。

基于ITS区序列的疑似野生双孢菇菌株的分子鉴定

图１显示，Ｓ区段是位于５０—７０ｂ间的序列，ＩＴ０５ｐ之琼
脂糖凝胶电泳检测条带单一、清晰，说明Ｉ通用引物适合疑ＳＴ
似野生双孢菇菌株的核糖体基因转录间隔区，样本符合测序的条件。
Ｃ３～０ｐＧＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＴＣ；５４０ｂ：ＴＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ１
（．１塔里木大学食用菌研究所，新疆阿拉尔８３０；４３０２塔里木盆地生物资源保护利用省部共建国家重点实验室培育基地，．新疆阿拉尔８３０）４３０
摘要：通过提取新疆南疆疑似野生双孢菇基因组ＤＡ，Ｎ采用通用引物ＩＳＴ１和ＩＳＴ４扩增ＩＳ区序列，ＧｎａｋＴ在ｅＢｎ中进行ＢＡＴ，ＬＳ对疑似菌株双孢菇进行初步分子鉴定。结果表明：Ｇｎａｋ的核酸序列数据库中登陆的、在ｅＢｎ与双孢菇
收稿日期：０１—１９２１０—１
退火３，２℃延伸１ｍｎ共３０ｓ７ｉ，０个循环；２℃延伸１ｉ。７０ｍｎ１２４ＩＳ区序列测定．．Ｔ将ＰＲ产物送往上海生工生物工Ｃ
基金项目：疆生产建设兵团科技攻关项目（编号：新
ＩＳＴ序列相似度为９％，数十种之多，中与登录号为Ｅ４０５９达其Ｆ６３４的双孢菇同源性达１０，０％覆盖率达９％。根据１ｒＮＳ区序列分析准则和双孢菇的形态特征，ＤＡＩＴ鉴定新疆南疆疑似野生双孢菇为双孢菇（ｇｒｕｂｐｒ）Ａａｃｓｉｏｓ。ｉｓｕ

木霉菌定殖的its鉴定方法

木霉菌定殖的its鉴定方法
木霉菌（Wood-decay fungi）是一类生长在木材上并导致木材腐烂的真菌。

其鉴定方法通常涉及到对其内部转录间隔区（ITS，Internal Transcribed Spacer）的序列进行分析。

以下是关于木霉菌ITS鉴定方法的详细解释：
1. 样品收集，首先需要收集含有木霉菌的样品，例如腐烂的木头或者土壤样品。

确保样品收集的干净和完整性，避免外部污染。

2. DNA提取，从样品中提取木霉菌的DNA。

这通常涉及使用商业DNA提取试剂盒，遵循制造商的指南进行操作。

DNA提取的质量和纯度对后续的ITS序列分析至关重要。

3. PCR扩增，使用特定的引物（primers）对木霉菌的ITS区域进行PCR扩增。

这些引物通常是针对ITS1和ITS4区域设计的，能够特异性地扩增木霉菌的ITS序列。

4. 测序，对PCR扩增得到的ITS片段进行测序。

现代测序技术如Sanger测序或者高通量测序均可用于ITS序列的获取。

5. 序列分析，获得ITS序列后，将其与已知的木霉菌ITS序列数据库进行比对分析，以确定该木霉菌的物种。

常用的数据库包括GenBank、UNITE等。

6. 生物信息学分析，对获得的ITS序列进行生物信息学分析，包括构建系统发育树、物种多样性分析等，以进一步确认木霉菌的分类地位和系统发育关系。

除了上述的分子生物学方法外，还可以结合形态学特征、培养特性等传统的鉴定方法，以获得更全面的木霉菌鉴定结果。

总之，木霉菌ITS鉴定方法涉及到从样品收集到分子生物学分析的一系列步骤，需要综合运用多种技术手段和方法。

评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用

力。方法
对１６９株曲霉临床分离株分别进行ＩＴＳ、ＢｅｎＡ和ＣａＭ序列测定，并在Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中进行比对分析以获得
其菌种鉴定信息。结果１６９株曲霉经ＩＴＳ、ＢｅｎＡ和ＣａＭ序列分析分别有５２．７、６６．３、９７．６菌株鉴定至种水平，４７．３、３３．７、２．４菌株鉴定至属水平，３个序列对曲霉均不存在无法鉴定情况。结论ＩＴＳ、ＢｅｎＡ和ＣａＭ均可用于曲霉菌种鉴定，其中以ＣａＭ的鉴定能力最强。【关键词】内转录间隔区（ＩＴＳ）；微管蛋白基因（ＢｅｎＡ）；钙调蛋白基因（ＣＡＭ）；序列分析；曲霉；菌种鉴定【中图分类号】Ｒ３７９．６【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７３～３８２７（２０１７）１２－００７４ — ０４
ｂａｎｋｄａｔａｂａｓｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌｗｉｔｈｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆ５２．７（８９／１６９），６６．３
李颖徐英春

野生硫磺菌分离株ITS序列分析

野生硫磺菌分离株ITS序列分析采用组织分离的方法从野生硫磺菌(Laetiporus sulphureus)子实体上分离得到菌株ts，以其基因组为模板扩增获得该菌株的ITS序列，序列分析结果表明：该菌株与GenBank中Laetiporus sulphureus var. sulphureus的3个日本分离株聚为一簇，ITS核苷酸一致率为98.31%～99.25%，而与其它22个来自不同国家的硫磺菌属菌株的ITS核苷酸一致率为91.93%～98.12%，依此结果，ts菌株应为L. sulphureus var. sulphureus。

硫磺菌硫磺原变种；转录间隔区硫磺菌（Laetiporus sulphureus）又名硫磺多孔菌、硫色多孔菌，为担子菌门（Basidiomycota）、伞菌亚纲（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、白肉迷孔菌科（Fomitopsidaceae）、硫磺菌属（Laetiporus）真菌［1］，是一种食药兼用大型真菌。

该菌子实体单生或覆瓦状生于柳树（Salix sp.）、板栗（Castanea sp.）等阔叶树干或树枝上。

子实体肥厚，幼时可食用，味道较好；也可药用，性温，味甘，能调节肌体，增进健康、抵抗疾病，是治疗乳腺癌、前列腺癌的辅助药物［2-4］。

硫磺菌的形态特征已有记载［5］。

目前还未见有对其进行ITS序列分析的报道。

笔者从泰山上采集到一株野生硫磺菌子实体，通过组织分离方法，3次纯化后获得其纯培养，利用现代生物技术手段获得了该菌株的ITS序列并构建了系统发育树，初步明确了其分类地位，以期为育种工作提供遗传背景清楚的野生种质资源，同时为驯化栽培提供参考。

1 材料与方法1.1培养基PDA加富培养基：200 g去皮马铃薯，40 g麸皮，20 g葡萄糖，3 g磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁，20 g琼脂，水定容至1 L，pH自然。

1.2菌株来源野生硫磺菌（L. sulphureus）子实体采自泰山药乡林场（海拔700～800 m）20多年生栎树（Quercus sp.）树干上。

野生花脸香蘑的分离纯化及ITS序列鉴定

野生花脸香蘑的分离纯化及ITS序列鉴定邹莉;杨苑艺;孙婷婷;王世新;崔嵘;李晶莹【摘要】以采自内蒙古根河地区的野生花脸香蘑为材料,采用组织分离法分别对其菌盖处、菌盖与菌柄交界处和菌柄处的组织进行分离纯化;通过测定生长速度和污染率等方法,研究分离纯化的最适培养基和最佳部位;最后将分离物进行ITS序列分析,计算遗传距离,并采用邻接法构建NJ系统发育树.结果表明,分离纯化最适培养基为PDA+子实体煮水培养基;菌盖与菌柄交界处为最佳分离部位,菌丝生长速度快、长势好、污染率低;并且子实体经自然风干2d后能有效降低污染率;最后分离物经ITS序列测定,系统发育分析证实其为花脸香蘑.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2016(028)002【总页数】5页(P264-268)【关键词】花脸香蘑;组织分离;ITS序列分析;系统发育分析【作者】邹莉;杨苑艺;孙婷婷;王世新;崔嵘;李晶莹【作者单位】东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】S646花脸香蘑(Lepista sordida)又叫紫晶香磨、丁香蘑等，属真菌界(Fungi)担子菌门(Basidiomycomycota)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)口磨科(Tricholomataceae)香蘑属(Lepista)[1]。

子实体中等大小，菌盖直径2.0～10.5(12)cm，紫色、浅红菱色或藕粉色，菌肉薄并带淡紫色，菌褶淡蓝紫色或浅红菱色[2-3]。

花脸香蘑含有丰富的蛋白质和氨基酸，还富含钙、铁、锌、硒等微量元素[4]，其菌株发酵物有较强的抗癌、抗菌等活性[5]，是营养价值与药用价值兼优的野生食用菌，具有极大的开发价值[6]。

利用ITS序列鉴定真菌

利用ITS序列鉴定真菌摘要：采用蘑菇提取的DNA及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后进行分析照相，测序。

随着核糖体Rdna ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息的到阐明。

关键词：ITS序列酵母菌 PCR 菌种鉴定1 材料与方法1.1材料与试剂：真菌组织（蘑菇）、菌丝体或孢子、氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。

70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。

10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。

1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次，CTAB 溶液、异丙醇，双蒸水，3MNaAc，PH5.2 20ug/RNaseA，特异性片段PCR扩增，ITS引物（F:CCGTAGGTGAACCTGCGG,R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）。

1.2主要仪器与设备表一实验中使用的主要仪器仪器名称型号产地立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂数显HH-4 国华电器有限公司电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂制冰机AF200PSC50R ΜSA生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany电子精密天平HR-200 上海精科天平酸度计DELTA302 上海电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany恒温水浴锅多型号Germany生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂1.3实验方法：真菌基因组DNA的提取（1）CTAB溶液在65℃水浴中预热（使用前加入1％巯基乙醇），取适量（2）取适量蘑菇置于研钵中，加入液氮，用小杵磨制粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。

ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出的两种真菌

1 材料和方法
1.1 材料
烟株烤烟品种云32，邵武地区种植，发病后送检。
孟加拉红培养基北京奥康星生物技术有限责任公司 PDA培养基北京奥康星生物技术有限责任公司真菌基因组DNA快速抽提试剂盒生工生物工程上海股份有限公司。改良马丁培养基配方1 L 蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g， pH值 6.4，121 ℃灭菌20 min。
PCR反应体系为50 L DNA模板2 L 10缓冲液5 L d NTP每种2.5 mmolL12 L 引物10 molL1各2 L Taq DNA 聚合酶5 UL10.4 L 无菌水补足至50 L。PCR反应程序为 95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 L PCR产物加1 L 6溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min，凝胶成像仪拍照。
1.2.4 ITS序列分析测序交由生工生物工程上海股份有限公司进行，对所得序列进行BLAST分析[6]，采用Maximum LikelihoodML法构建系统发育树，Bootstrap 重复500 次检验各分支的置信度，最终确定菌株的分类地位。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化
烟草作为一种重要的经济作物，在我国的种植面积和产量均居世界前列，但每年烟草病害的发生比较严重，给烟农和国家经济带来巨大损失。我国烟草种植区域广，病害种类、分布和危害情况因不同地域而有很大差异，全国 16个主产烟省区烟草侵染性病害有62种，其中真菌性病害30种[1]。福建省是我国烟草主产区，烟草侵染性病害发生种类有31种[2]，主要为烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草黑胫病、烟草青枯病、烟草病毒病等5类[3]，在31种烟草侵染性病害中真菌性病害有10种，且新的侵染性病害不断出现，如米根霉引起的烟叶霉烂病等[4]。

ITS菌种鉴定方-法

its引物pcr体系学则

菌种鉴定方法大全

一种用ITS1区测序方法鉴定独活药材

ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用

白僵菌菌株的ITS序列鉴定

基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品

ITS菌种鉴定方 法

真菌its鉴定

真菌its鉴定

基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究

真菌核糖体its检测实操目的

基于ITS区序列的疑似野生双孢菇菌株的分子鉴定

木霉菌定殖的its鉴定方法

评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用

野生硫磺菌分离株ITS序列分析

野生花脸香蘑的分离纯化及ITS序列鉴定

利用ITS序列鉴定真菌

ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出的两种真菌

ITS菌种鉴定方法