ITS菌种鉴定方-法

利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区（In ternally Tran scribed Spacer）的英文缩写,位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。其优点有：具有高拷贝数,整个序列的长度在600〜800 bp,利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因（rDNA）在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA小亚基单元（SSU）, 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元（LSU）组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区I和U （分别为ITS I和ITS H）的片段大小上。ITS 区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITS U区在种间变异性较高（22%），种内变异性较低（V 3%）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITS I区、5.8SrDNA 和ITS U

区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITS H区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。

ns r nsn

1、通用引物①:

ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG — 3' ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 一 3' 通用引物②

ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 一 3' ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC 一 3' U 通用引物①土

1TS1 ——► 5s TCCG TAGG TGAA CCTG CGG —『 ITS i ——k 5* -TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 3'

通用引物②

】TS1 ——► a -TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC —3k

ITS86 -------- 5F -CTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC-3'

2、反用体系£50ul ）

3、

91 fTf!变 fl.

5 n)i a

91

SOS =

51 f 退火

50S » 30个循环

72 r

2 min /

72 'CJ1 伸

10 nnii

10 X buffer 5订 M 严 d y L dXTPs

1 u L 上游引物（ITS4）

2 ul. 卜‘游引物（TTS8G ） 2 UL TriqNJ 0,a li I, ddIQO

30. S uL

2 uL

加完城剂后.

呵以加到一起.再分装

Accession Description Max score Total score Query covei BA000030.3Streptomyces avermitilis MA-4680 DHA, complete genome 2028397498% AL939123.1Streptomyces coelicolor A3(2) complete genome; segment 20/29 2248224898% AJ001205.3Streptomyces coelicolor A3(2) glycoger： metabo'ism cluster! 223?223798% HQ915641.1Streptomyces griseus subsp gnseus strain CGMCC 4.1419 trehaose synthase 1991199198% AP009493.1Streptomyces gnseus sjbsp gnseus HBRC133S0 ONA, complete genome 1991199198% FN554889.1Streptomyces scabiei 87.22 complete genome 2122421698% CP002475.1Streptomyces flavogriseus ATCC 33331, complete genome 1969196998% CP002993.1Streptomyces sp. SirexAA-E, complete genome 1921192198% AP010968.1Kitasatospora setae KM-60S4 DMA, complete genome 1707433197% CP003275.1Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangersis 5008, compete genome 2342458797% CP002994.1Streptomyces violaceusnigerlu 4113, complete genome 1919191997% CP003219.1Streptomyces cattleya DSM 46488丿complete genome 1908334697% FQB59185.1Streptomyces cattleya str. HRRL 8057 main chromcsome, comp ete genome 1908334697% CP002047.1Streptomyces bmgchenggensis BCW-1, complete genome 1969196997% AL939131.1Streptomyces coelicolor A3(2) complete genome; segment 28/29 2189218997% AJ001206.2Streptomyces coelicolor A3(2), glycogen metabolism cluster K 2189218997% "1238663,1Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 ieft chromosomal arm 2139213997% FR845719.1Streptomyces venezuelae ATCC 10712 complete genome 1905190597% FO117623.1Blastococcus saxobsidens DD2 complete genome 1212128194% CP001874.1Thermobispora bispora DSM 43833. complete genome 1225225194%