一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定

摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性｡对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物｡生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%｡根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素｡质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素｡

关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定

Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity

Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic.

Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物

病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性｡采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素｡HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素｡

1材料与方法

1.1菌株

1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存｡

1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)､小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)､小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)､水稻纹枯病菌(Rhizoctonia

solani)､水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)､毛霉(Mucor sp.)均为湖北省生物农药工程研究中心保存｡

1.2培养基

1.2.1种子培养基葡萄糖-酵母粉-麦芽提取物培养基｡采用带挡板的500 mL三角瓶,装量100 mL｡

1.2.2抗生素发酵培养基甘露醇-豆胨液体培养基｡采用带挡板的500 mL三角瓶,装量100 mL｡

1.2.3生测培养基采用PDA培养基｡用管碟法生测时,下层琼脂质量分数为1.5%,上层琼脂质量分数为1.0%｡用96孔板进行生测时,琼脂质量分数为0.8%｡

1.3主要仪器设备

B?譈CHI ROTA V APOR R-200型旋转蒸发仪,瑞士生产;分析型液相色谱仪:Waters 2690采用2996二极管阵列式检测器;制备型液相色谱仪:Waters 2525泵,2767自动收集系统,2996二极管阵列式检测器;液质联用分析仪:Waters 2695高效液相色谱仪,采用Waters 996二极管阵列式检测器,Masslynx V4.0色谱工作站,美国Micromass Quattro micro?誖四极杆质谱仪,电喷雾离子源(ESI),Masslynx V4.1液质联用分析软件｡

1.4主要试剂

色谱纯级甲醇､乙腈均为天津基准试剂有限公司生产;分析纯乙醇,西陇化工股份有限公司生产;大孔吸附树脂D3520,南开大学化工厂生产;液质联用氮气,购自武汉市汉阳钢厂,纯度为99.999%｡

1.5色谱条件

1.5.1分析条件采用美国Sunfire C18柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min｡

1.5.2制备条件制备柱采用美国Sunfire OBD C18柱,250 mm×19 mm,粒径为10 μm;柱温为室温;流动相为水和乙腈,进样量为3 000 μL;流速为27 mL/min;检测条件:二极管阵列,全波长扫描｡

1.5.3质谱检测条件电喷雾电离(ESI),毛细管电压为3.5 kV,锥孔电压为45 V,离子源温度为100 ℃,干燥气温度为300 ℃,脱溶剂气体流速500 L/h,锥孔气体流速为50 L/h｡

1.6主要方法

1.6.1抗生素发酵取低温(-20 ℃以下)保藏的WS-23883甘油管1支,在严格无菌条件下用吸管取 1 mL甘油-菌丝悬浮物转入种子培养基中,在旋转式摇瓶机上28 ℃､140 r/min培养4 d后转入发酵培养基中,接种量为10%(V/V),相同条件下培养5 d后结束发酵｡

1.6.2发酵液处理将发酵液用稀盐酸调pH值至5.0后,5 000 r/min离心10 min,将菌丝体和上清液分开｡

1.6.3上清液过柱及洗脱将经预处理的大孔吸附树脂装入50 mm×1 000 mm四氟砂芯玻璃柱中,将上清液以10倍柱料体积,按BV=0.5~1.0的流速过柱,再以4倍于柱料体积的纯净水洗涤,用2倍于柱料体积的75%(V/V)乙醇洗脱,每200 mL收集1份｡

1.6.4菌丝体萃取称取菌丝体质量(湿体),加入2倍体积的75%(V/V)乙醇,充分搅匀后,转入带挡板的500 mL三角瓶中,每瓶装量200 mL,置摇床上180 r/min振荡萃取1 h,然后于5 000 r/min离心10 min,倒出上清｡菌丝残渣用同样的方法再萃取1次｡合并2次萃取液,置旋转蒸发仪上在50 ℃､160 r/min,7 kPa压力下浓缩至原体积的1/5,置4 ℃静置过夜析出结晶｡

1.6.5样品干燥将上述结晶物离心,再以纯水洗涤,再次离心以去掉可溶性杂质｡将沉淀物用纯水悬浮,转入不锈钢冻干盒中,冰冻干燥,即得奶黄色疏松粉末｡过柱后的洗脱液旋转蒸发除去乙醇后冰冻干燥｡

1.6.6样品活性测定称取1 mg样品,加入纯水,溶解后制得1 000 μg/mL溶液｡以毛霉为指示菌,用管碟法测定样品活性｡

1.6.7样品分析称取上述样品1 mg,加入1 mL甲醇溶解,10 000 r/min离心5 min,再以Mill ipore 0.5 μm膜过滤,HPLC分析,进样量3 μL｡

2结果与分析

2.1提取物活性测定

生物活性测定结果表明,WS-23883的提取物对5种真菌菌丝的抑制率均达到100%,表明其有很强的抗真菌作用｡

2.2精制样品分析

生测及HPLC分析(图1)表明,样品中主要活性物质保留时间为14.02 min,杂质峰很小,用面积积分法算出样品纯度在90%以上｡

从样品紫外吸收光谱(图2)来看,呈典型的指状吸收峰,最大吸收波长为291､304､319 nm,以304 nm吸收最强｡根据文献资料[1,2],该化合物应属多烯大环内酯类抗生素｡