生物化学--蛋白质的分离纯化与鉴定

SDS
二、 蛋白质分子大小与形状
SDS与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分
电（ 泳六 ）
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
子的构象，SDS-蛋白质复合物在水溶液 中的形状是椭圆棒状，不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度约为1.8nm，长轴长度 随蛋白质的分子量成正比 蛋白质SDS-PAGE的迁移率与原有电荷、 Leabharlann Baidu子形状等无关 logM=K1-K2μR μR:相对迁移率。为：样品迁移距离/前 沿迁移距离
（ 四 ） 蛋 白 质 的 沉 降 分 析



蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时， 会发生沉降。 沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状和密度； 溶液的密度和粘度有关。 研究沉降作用，采用每分钟60000-80000转的 高速离心机，相当于重力的500000-600000倍 利用高速离心机测定蛋白质的分子量有两种方 法，一种是沉降速度法，另一种是沉降平衡法 此法还可以鉴定蛋白质分子的均一性
二、 蛋白质分子大小与形状
（ 二 ） 蛋 白 质 的 渗 透 压
当用一种半透膜将蛋白质
溶液与水隔开时，溶剂分 子将向蛋白质溶液中单向 扩散，使溶液内的体积增 加，液面升高。直到达到 一定的静水压力时维持平 衡。此时的静水压力就是 溶液在平衡浓度时的渗透 压。
（ 二 ） 蛋 白 质 的 渗 透 压
二、 蛋白质分子大小与形状
利用凝胶过滤层析法可以把蛋白质混合
量（ 五 ） 凝 胶 过 滤 法 测 定 分 子
物按分子大小分离开。 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接 取决于分子的质量，而是它的斯笃克半 径。 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体 具有相同的过柱速度即相同的半径，称 斯笃克半径。 用凝胶过滤法测定分子量时，标准样品 和待测蛋白质必须具有相同的形状。
正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电
荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
二、 蛋白质分子大小与形状
（ 一 用化学分析法测出蛋白质中某一微量元 ） 素的含量，并假设蛋白质分子中只含有 根 一个被测的元素原子，则可以由此计算 据 化 出蛋白质的最低分子量。 学 组 真实分子量为最低分子量的n倍 成 测 有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特 定 别少，也可以按照这个原理测定最低分 最 低 子量 分 子 量
第六节 蛋白质的分离纯化与鉴定
The Separation and Purification of Protein
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成
二、 蛋白质分子大小与形状
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基
电（ 泳六 ）
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
硫酸钠和少量的巯基乙醇，则蛋白质分 子的电泳迁移率主要取决于它的分子量， 而与所带电荷和分子形状无关。 SDS是一种变性剂，能够使蛋白质的肽链 伸展。 SDS使多肽链带上相同的负电荷， 掩盖 了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果 所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同 样的电荷/蛋白质比向正极移动。
凝胶过滤层析的工作原理
分子筛层析， Molecular-sieve chromatography; 凝胶过滤: Gel filtration chromato-graphy; 或 Gel retar-dation chromatography.
根据公式计算分子量：
logM=K1-K2Ve K1、K2为常数 Ve：洗脱体积 测定方法：测得几种标准蛋白质的Ve ，并 以它们的分子量对数对作图得一条直线， 再测出待测样品的Ve，即可从图中查出它的 分子量 待测样品可以不纯 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可 选用不同分离范围的凝胶。
二、 蛋白质分子大小与形状
（ 三 ） 蛋 白 质 的 扩 散
由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为扩散。 利用蛋白质的扩散，根据费克第二扩散定律

c x x e c 测定在两个不同部位的浓度，可以计算出D值
2 _ 2
1
2
2
4Dt
1

扩散系数一般不单独用来决定分子量，要和其 他手段结合
二、 蛋白质分子大小与形状
（ 1.沉降速度法 四 把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子 ） 将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界 蛋 面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速 白 度。 质 的 在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助 适当的光学系统，观察到界面的移动。 沉 降 斯维得贝格方程 M=RTs/[(1-υρ)D] 分 s：沉降系数；s=[dx/dt]/ω2x；把10-13秒 析 作为一个单位，称为斯维得贝格单位，用S表
SDS
二、 蛋白质分子大小与形状
测定几种标准单体蛋白分子量的对数值，
电（ 泳六 ）
对其μR值作图，再根据待测样品的μR， 从标准曲线上查出它的分子量。
蛋白质的稀溶液： π：渗透压（大气压） R：气体常数 T：绝对温度 c 0 c：溶质浓度（g/L） 测定几个不同浓度的渗透压，用π/c对c作图 外推到蛋白质浓度为0，得到截距，代入公式 求得分子量。 要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度 装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净

RT M＝ lim ｃ
示
υ：偏微比容；蛋白质溶于水0.74cm3/g D：扩散系数；cm2/s
二、 蛋白质分子大小与形状
（ 四 2.沉降平衡法 ） 蛋 在8000-20000r/min的离心力场中，分子颗粒 发生沉降，造成浓度梯度。扩散力和离心力平 白 衡时，在离心管内从液面到液底形成一个由低 质 到高的恒定浓度梯度。 的 沉 M=[2RTln(c2/c1)]/[(1-υρ)ω2(x22-x12)] 降 c1和c2是离旋转中心x1和x2处的蛋白质浓度； 分 只要实验测得c1和c2及υ和ρ，即可算出蛋白质 析 的分子量。