蛋白质的纯化与鉴定- 1p (1)

利用溶解度差别的纯化方法
1. 等电点沉淀和pH控制
蛋白质处于等电点时， 其静电荷为零，由于相邻蛋 白质分子之间没有静电斥力 而趋于聚集沉淀。
等电点沉淀实例
①工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性 蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定 浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现 含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0 的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40% 饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液 再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。 2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL-mg/mL。 3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的 缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。 4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的 降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解 DNA，防止DNA对蛋白的污染。

根据目标蛋白的特性，制定由粗到精，由 分离效率低到分离效率高的纯化路线 特殊：亲和层析 制定快速有效的目标蛋白跟踪方法 （酶活 性，抗原-抗体反应，其它方法） 纯度：
SDS-PAGE （染色方法） HPLC


计算纯化效率与产率
蛋白质纯化的一般注意事项
在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻 注意维护它的稳定，保护它的活性。

1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的水生栖热菌(Thermus aquaticus)
蛋白质的分子结构包括
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
球状和纤维蛋白质
根据蛋白质分子的形状可分为：
球状蛋白质(globular protein) 纤维状蛋白质(fibrous protein)
增加蛋白制品 (preparation) 的纯度 (purity) 或 比活（specific activity）。 去除变性的和不要的蛋白质。 所得蛋白质的产量达到最高值。
蛋白质分离纯化的一般程序

前处理（pretreatment） 粗分级分离（rough fractionation） 细分级分离（fine fractionation） 结晶(crystallization)及蛋白质的鉴定
通常长轴与短轴之比小于10者为球状
蛋白质，大于10者为纤维状蛋白质。
球状蛋白质
近似于球形或椭圆形，生物界中的大多数蛋 白质为球状蛋白质，如大多数的酶类、血红 蛋白、肌红蛋白以及多种溶解于胞液或体液 中的蛋白质。球状蛋白质一般可溶于水，并 且具有特异的生物学活性（如血红蛋白运输 氧、酶起催化作用等）。
纤维蛋白质
纤维状蛋白质多是构成机体的结构 材料，如皮肤、肌腱、软骨及骨组 织中的胶原蛋白，肺、大动脉等中 的弹性蛋白,毛发及皮肤中的角蛋白 ,蚕丝中的蚕丝蛋白等。它们一般难 溶于水，在机体中起着粘合、支撑 、保护、负重和营养等功能。纤维 状蛋白质的更新较慢。
第二部分 蛋白质的分离纯化原则和程序
蛋白质分离纯化的一般原则
Bradford法的优点
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突 出优点，因而得到广泛的应用。这一方法是目 前灵敏度最高的蛋白质测定法。 （1）灵敏度高 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。 （3）干扰物质少。
缺 点
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸 的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测 定时有较大的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰 物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸 钠（SDS）和0.1 N的NaOH。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，测定未知蛋白 的595nm吸光值需落在标准曲线的线性范围内。

蛋白质属于生物大分子之一，分子量范围可达1万 至100万之间，其分子的直径在1~100 nm，为胶 粒范围之内。

蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷（双电层） 水化膜：1g蛋白结合0.3-0.5g水

蛋白质溶液具有丁达尔效应、
布朗运动以及不能通过半透膜等 性质
三、蛋白质分子量的测定
蛋白质分子大小 6—1,000 kD
单位：Dalton(道尔顿）,
英国化学家、物理学家，原子学说创始人John Dalton. 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12=1/N g( N为阿伏伽德罗常数) ≈1.67×10-27千克
蛋白质分子量的测定
1、最小分子量测定法： 2、渗透压法 3、超离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.蛋白质的盐溶和盐析
低浓度，中性盐可以增加蛋白质表面的电荷， 促进蛋白质溶解。浓度增加到一定数值时，蛋白质 溶解度开始下降。
3. 有机溶剂分级分离
与水互溶的有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮等）能 使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 但在常温下，易引起蛋白变性，需在低温下进行。
有机溶剂沉淀实例
纯化策略的制定
2．紫外吸收法
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和 色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收， 操作简便，但精确度不高。
3．Folin-酚法（Lowry法）
蛋 白质 中的酪 氨酸或 半胱氨 酸 ，能 与 Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色 化合物，500nm比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。

1．双缩脲法 2、紫外吸收法 3．Folin-酚法（Lowry法） 4．BCA法 5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
1．双缩脲法
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝 色。当底物中含有肽键时（多肽），试液 中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通 过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的 波长为540nm。
1、最小分子量测定法
测定蛋白质中某一微量元素的含量 如Mb含Fe为0.335%，则M=55.8/0.335%=16700。 这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子 量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以 M=16700。
4、凝胶过滤法 （gel filtration)
分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
最常使用的两种缓冲液

添加成分

2、粗分级分离
目的：去除杂蛋白，核酸，多糖等杂质， 同时浓缩蛋白质溶液

特点：简便，处理量大 方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分 级分离、超过滤、凝胶过滤、冷冻真空 干燥、加热变性沉淀，等等。

3、细分级分离
目的：进一步纯化目的蛋白
特点：规模较小，分辨率很高
Advanced Biochemistry Fall 2014
Protein Separation and Purification 蛋白质分离和纯化-I
蛋白质分离纯化的必要性

需要单一的蛋白质研究其结构与功能 化学修饰需要单一的蛋白质 纯化改造过的蛋白质，从而开发出性 能更优良的蛋白质


Lecture Outline
蛋白质的分离纯化的基础 蛋白质的分离纯化原则和程序 蛋白质的含量测定 蛋白质纯度鉴定 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质层析技术 蛋白层析的主要技术

10/12/2014
3
第一部分 蛋白质的分离纯化的基础：
结构和特性
蛋白质的结构和特性
1. 2. 3. 4.
酸碱性质 胶体性质 分子量的测定 结构和形状
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结 合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度 负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟 形的长椭圆棒型。
四、蛋白分子的结构和形状
带负电荷的蛋白质 脱水作用
－ － － － － －
碱
酸
－ －
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷，不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
第四部分 蛋白质纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定
色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：能够获得蛋白质晶体 溶解度曲线单转折


相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方 法可能表现为不均一，因此需要互相验证。
电泳纯
结晶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 色谱纯
第五部分 蛋白质的分离纯化方法
5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质 的变性。 6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。 7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L DTT(或β巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。 8、加1~10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重 金属对目标蛋白的破坏。 9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。
纯化实例：纯化Taq DNA聚合酶
1、前处理（pretreatment） 去杂质、脱脂 细胞破碎
机械破碎法
研磨法 组织捣碎器法 超声波法 压榨法 冻融法

溶胀 自溶 化学法 酶解法
缓冲液溶提、离心或过滤去除细胞碎片
缓冲液的选择

离子强度：0.1-0.2 M pH范围：7.0 - 8.0 磷酸盐缓冲液 Tris缓冲液 1、抗氧化剂：DTT，BME，Cys，GSH 2、酶抑制剂：EDTA，蛋白酶抑制 PMSF 3、酶的辅因子或辅基 4、植物细胞（酚类化合物）：PVP 5、抗菌剂：NaN3
蛋白质的分离纯化方法

分子大小：透析，超过滤，凝胶过滤层析等 溶解度：沉淀，盐析等 电荷：电泳，离子交换等 吸附性质：吸附层析 对配体分子的生物学亲和力：亲和层析
根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析、超过滤
加 压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
脱盐，浓缩
2.密度梯度离心

1966年，Andrews得出一个经验公式： lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开 始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所 流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对 分子质量，a和b为常数。

5、 SDS-PAGE 测分子量 (sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis)
方法：一般使用层析法，还可以选
择电泳法
4、结晶及蛋白质的鉴定
只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形 成结晶。纯度越高，溶液越浓越容易结晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质 的结晶不仅是一个纯度的标志，也是断定制品处于 天然状态的有力指标。
第三部分 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团：α-NH3+ α-COO侧链上的功能基团 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 pI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH.
水化膜 + + + + + + + － － － －－ － － －
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用
碱 酸
带正电荷的蛋白质 脱水作用
+ + + + + + + +
4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基 -2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫 色，比色测定。
5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
考马斯亮兰法是1976年由Bradford建立的， 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马 斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合 ，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕红色变为兰色。 经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性 氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相 结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋 白质浓度成正比。