蛋白质的纯化与鉴定- 1p (1)
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。
许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。
到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。
且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。
蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。
因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。
其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。
对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。
同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。
另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
深入解析蛋白质表征研究的实验步骤
深入解析蛋白质表征研究的实验步骤蛋白质是生物体内最基本的功能分子之一，对于了解生物体的结构和功能具有重要意义。
蛋白质的结构鉴定是生物药物领域中的关键研究内容之一。
本文将深入解析蛋白质表征研究的实验步骤，带您了解蛋白质结构鉴定的过程。
步骤一：蛋白质纯化蛋白质表征研究的第一步是蛋白质的纯化。
由于生物体内蛋白质的复杂性，需要通过一系列的纯化步骤将目标蛋白质从其他杂质中分离出来。
常用的纯化方法包括离心、层析、电泳等。
离心可以根据蛋白质的大小和密度进行分离，层析则可以根据蛋白质的特性选择合适的分离介质，电泳则可以根据蛋白质的电荷和大小进行分离。
图1。
步骤二：蛋白质结构预测在蛋白质表征研究中，蛋白质结构的预测是一个重要的环节。
通过计算机模拟和算法预测，可以得到蛋白质的二级结构、三级结构以及可能的折叠方式。
这些预测结果可以为后续的实验提供指导，同时也可以帮助科研人员更好地理解蛋白质的功能和相互作用。
图2。
步骤三：质谱分析质谱分析是蛋白质表征研究中常用的技术手段之一。
通过质谱仪的高精度测量，可以得到蛋白质的分子质量和组成。
质谱分析可以通过不同的方法，如质谱图谱、质谱成像等，对蛋白质进行全面的表征。
同时，质谱分析还可以用于检测蛋白质的修饰和变异，为蛋白质结构鉴定提供重要的信息。
步骤四：核磁共振（NMR）技术核磁共振技术是蛋白质表征研究中常用的结构鉴定方法之一。
通过核磁共振仪的测量，可以得到蛋白质的原子间距离、化学位移和耦合常数等信息，从而确定蛋白质的三维结构。
核磁共振技术具有高分辨率和非破坏性的特点，对于研究蛋白质的结构和动态性具有重要意义。
步骤五：X射线晶体学X射线晶体学是蛋白质表征研究中最常用的结构鉴定方法之一。
通过将蛋白质样品制备成晶体，并通过X射线的衍射测量，可以得到蛋白质的高分辨率结构。
X射线晶体学可以提供蛋白质的原子级别的结构信息，对于研究蛋白质的功能和相互作用具有重要意义。
步骤六：电子显微镜（EM）技术电子显微镜技术是蛋白质表征研究中新兴的结构鉴定方法之一。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征
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2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
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盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
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盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
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蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
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三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质纯化与鉴定实验指南
二、Hela细胞核提取物的Sephacry S-300 HR柱层析98实验3 序列特异性DNA亲和层析101一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸 105二、DNA亲和介质的制备107三、亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用112四、亲和层析的操作 113实验4 DNA酶I足迹分析117一、DNA酶I足迹探针的制备118二、DNA酶I足迹分析122实验5 凝胶迁移变动分析126实验6 肝素-Sepharose CL-2B的制备129试剂的配制 131参考文献 138第3单元 大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化 Richard R. Burgess和Mark W. Knuth141实验1 大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制144实验2 包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析148 实验3 可溶性提取物（核心RNA聚合酶-复合物）的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层 152 析一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物153二、免疫亲和层析 154实验4 定量测定与制备小结158一、蛋白质的定量测定 158二、定量SDS凝胶染色与扫描159三、定量蛋白质斑点印迹 160四、酶测定法 163五、纯化记录表 164六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片 165实验5 蛋白质的鉴定167一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm167二、消光系数的测定（Scopes法）167三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度169四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性 169方案补充实验：从过表达细菌提纯 172一、快速蛋白质斑点印迹试验 172二、是可溶的还是不溶的？ 173三、溶解包涵体沉淀需多少N-十二烷基肌氨酸钠？ 173四、沉淀和RNA聚合酶需多少聚乙烯亚胺？174五、从PEI沉淀洗脱和RNA聚合酶需多少盐？175六、透析法除N-十二烷基肌氨酸钠需多少时间？ 176五、胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定 202实验2 膜胰岛素受体的溶解205一、胰岛素受体的溶解及活性测定 211二、溶解膜蛋白用的去垢剂的筛选 213实验3 溶解受体的凝集素亲和层析215实验4 部分纯化受体的胰岛素亲和层析219一、胰岛素亲和层析 220二、配体与活化介质的偶联 221实验5 胰岛素受体与胰岛素的交联223实验6 胰岛素激素的胰岛素受体自磷酸化226实验7 胰岛素受体糖基化的分析229试剂的配制 234参考文献 240附录 243附录1 pH的测量243附录2 缓冲液的配制245附录3 电导率的测量247附录4 固态硫酸铵法分级分离248附录5 蛋白质的SDS-PAGE电泳249一、电泳 251二、凝胶染色 256三、样品制备（沉淀法） 259附录6 蛋白质的过甲酸氧化263附录7 用亚氨基二乙酸Sepharose 6B分离磷酸肽265附录8 蛋白质内序分析用肽段的分离与纯化267附录9 推荐读物269技术索引 271主题索引 273。
蛋白质纯化和鉴定技术
蛋白质纯化和鉴定技术近年来，蛋白质研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
作为生命体内的重要组成部分，蛋白质不仅承担着生命体内物质转化和生长发育的任务，还在许多生理和病理过程中发挥着不可替代的作用。
因此，开展蛋白质研究对于增进人类健康和生命科学的发展至关重要。
而蛋白质纯化和鉴定技术则是蛋白质研究的基础和关键。
蛋白质纯化是指通过一系列具有选择性的物理、化学和生物学分离技术，将混合物中目标蛋白质从其他杂质中分离出来的过程。
蛋白质纯化最初的目的是为研究人员提供足够纯度的蛋白质样品，以利于后续的功能和结构分析。
随着人们对蛋白质结构和功能的了解日益深入，越来越多的研究需要更高纯度的蛋白质。
因此，蛋白质纯化技术也越来越多地应用于生物制药、医学诊断、基因工程和食品工业等领域。
目前，蛋白质纯化技术主要包括离子交换、分子筛、凝胶过滤、亲和层析、逆相层析、电泳法等多种方法。
其中，各种方法的选择取决于目标蛋白质的大小、形态、生物学特性和纯化要求等因素。
例如，对于较小的蛋白质，分子筛和凝胶过滤法是常用的纯化方法；对于大分子复合物或已知的结构域，亲和层析法则经常用于富集目标蛋白质。
然而，蛋白质分离纯化的过程中常常伴随着蛋白质的失活、失去特异性或聚集等问题。
为了克服这些问题，一些辅助工具也被应用于蛋白质纯化，例如保护剂、还原剂、表面改性剂等。
同时，对于一些需要保持天然结构和功能的蛋白质，需要采用温和的纯化条件，例如低温、原处性、无需或少需添加保护剂等。
纯化后的蛋白质如何鉴定其纯度和质量也是蛋白质研究中的重要问题。
传统上，蛋白质纯度评估主要依靠胶体银染、染料结合、免疫学检测、活性分析等方法进行。
这些方法虽然直观、便捷，但存在一定的局限性。
例如，胶体银染法中银染胶对经典的低丰度致癌基因表达的靶分子能够检测得非常精细地蛋白质表达分析方法，但是其重复性和定量性相对较差。
因此，近年来，许多高通量和高分辨率的蛋白质鉴定技术被提出并得到成功应用。
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；（2）250mL2.蛋白质浓度测定（1）溶液配制1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。
（2）0~100ug/mL标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL蛋白质浓度0 20 40 60 80 100µg/ml1mg/mL BSA溶0 40 80 120 160 200液（µl）蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。
以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。
（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。
蛋白质分离纯化与鉴定
蛋白质分离纯化与鉴定蛋白质分离纯化与鉴定是蛋白质的关键步骤，它包括从蛋白质样品中分离出蛋白质和去除剩余的其他杂质，从而确保得到高纯度的蛋白质，同时也可以利用这一步骤对蛋白质进行识别和定量。
蛋白质分离纯化和鉴定依赖于特定的结合机制来对蛋白质样品和它们之间的干扰进行分离，纯化和定量，重要的是选择合适的结合机制，包括静电结合、磁性结合和生物类比结合。
静电结合是利用离子的电荷来实现蛋白质的结合的一种方法，如逆流苯胺凝胶电泳（IEX）、硼滤膜萃取（BFE）、凝胶乳液沉淀（GFC）等。
其优势是有效的提取蛋白质，不会分离出太多的杂质，因此可用于纯化以及分离同种蛋白质，但存在着选择性不高和操作复杂的问题。
磁性分离是利用磁性粒子将蛋白质（如金蛋白）从样品中分离出来的一种技术，主要应用于从生物体或细胞内筛选靶向蛋白质，如免疫磁珠筛选和快速免疫磁珠筛选等。
优势是极好的选择性和高回收率，缺点是不能太多的纯化和定量。
生物类比结合是指使用小分子有机分子的氢键与蛋白质聚合体的氢键形成竞争，使蛋白质结构发生变化、表面可溶性结构发生变化，以达到蛋白质分离纯化和鉴定的目的。
生物类比结合技术同时具有高分辨率、高效率、低毒性及可控性优点。
如两亲聚酰胺模型（TCA）技术、新型聚乙二醇活性纤维素（PEG）技术等。
优势在于可同时提取多种蛋白质，经纯化后的蛋白质也能保留蛋白质的完整性，但缺点是技术操作比较复杂，耗时较久。
蛋白质分离纯化与鉴定是一个综合技术，因此在蛋白质分离纯化及鉴定过程中应根据蛋白质特性，选择最适合自身情况的结合机制，进行一系列的步骤，以得到最纯净的蛋白质分离纯化，识别和定量的目的。
生物化学--蛋白质的分离纯化与鉴定
聚 ➢ SDS是一种变性剂，能够使蛋白质的肽
丙 烯
链伸展。
酰 ➢ SDS使多肽链带上相同的负电荷， 掩盖
胺 了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果
凝 所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同
胶 电
样的电荷/蛋白质比向正极移动。
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二、 蛋白质分子大小与形状
泳 （ ➢ SDS与蛋白质结合，改变了蛋白质单体
第六节
蛋白质的分离纯化与鉴定
The Separation and Purification of Protein
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1
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条 件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成
七 ） 蛋
X射线晶体结构分析。 ➢ 测定蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可
白 以判断蛋白质分子的形状
质 分
蛋白质的摩擦系数 f=RT/ND
子 理想刚性球体的摩擦系数
的
形 状
f/f0是蛋白质分子的摩擦比
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二、 蛋白质分子大小与形状
（ ➢ 当摩擦比大于1.0时，蛋白质分子的形状
七 ） 蛋
➢ 待测样品可以不纯
➢ 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可 选用不同分离范围的凝胶。
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二、 蛋白质分子大小与形状
泳 （ ➢ 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基
蛋白质分离纯化及鉴定
蛋白质具有多种生物活性，通过分离纯化及鉴定具有特定功能的蛋白质，
可以研发功能性食品，满足消费者对营养和健康的需求。
03
食品添加剂生产
一些蛋白质可作为食品添加剂用于生产，如乳清蛋白、大豆蛋白等。蛋
白质分离纯化及鉴定有助于优化生产工艺，提高产品质量。
在环境科学领域的应用
环境污染监测
蛋白质在不同环境中的表达会发生变 化，通过分离纯化及鉴定蛋白质，可 以监测环境污染状况、评估环境质量。
生物治疗
蛋白质在生物治疗中具有重要作用，如酶替代疗法、免疫 治疗等。蛋白质分离纯化及鉴定有助于筛选和优化治疗性 蛋白质，提高治疗效果。
在食品工业领域的应用
01食品成分分析来自蛋白质是食品的主要成分之一，通过分离纯化及鉴定蛋白质，可以分析
食品的营养成分、品质和安全性，为食品加工和质量控制提供依据。
02
功能性食品研发
VS
应用
适用于分离不同分子大小的蛋白质，常用 于高度纯化蛋白质和去除杂质。
03
蛋白质鉴定技术
蛋白质的质谱鉴定技术
质谱鉴定技术
利用质谱仪对蛋白质进行检测和鉴定，通过测定蛋白质的分子量 和部分氨基酸序列，确定蛋白质的种类和结构。
优势
高灵敏度、高分辨率和高准确性，能够同时测定多个蛋白质，广泛 应用于蛋白质组学研究。
蛋白质分离纯化的方法分类
大规模分离、微量分离等。
根据样品量分类
粗分离、部分纯化、高度 纯化等。
根据纯度要求分类
电泳法、离心法、色谱法 等。
根据分离原理分类
02
蛋白质分离纯化技术
蛋白质的沉淀技术
盐析法
利用高浓度的盐离子与蛋白质结合，使蛋白质在水中的溶解度降低而析出。常用的盐析剂包括硫酸铵 、氯化钠等。
蛋白质的分离纯化与分析鉴定
蛋白质的分离纯化与分析鉴定摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点。
根据蛋白质的酸碱性质、分子大小与形状、溶解性质及其与配体亲和性等,对其分离纯化和分析鉴定方法进行了综述。
分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步，本文重点介绍讨论了步骤三中的几种主要方法。
关键词：蛋白质，分离，纯化，鉴定一、引言生物体内的大部分生命活动如催化代谢反应、物质运转、运动的相互协调、兴奋的传导、生长与发育等，均是在蛋白质的参与下完成的。
因此,研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大意义,而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。
必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定出合理的分离纯化方法。
由于不同的蛋白质结构和性质不同,分离方法也不同,例如根据分子大小可使用差速离心、分子筛、超滤或透析等分离技术；根据溶解度大小的不同，使用盐析、溶剂抽提、分配层析、结晶等方法分离；根据所带电荷的不同，可采用电泳、等电点沉淀、离子交换层析等方法；根据结合亲和性，可用新和层析进行分离。
蛋白质的分离纯化技术种类是很多的而且发展很快某些技术如以前不多见的超滤分离方法,目前在国内应用已相当普遍，除此之外广泛使用的层析、电泳方面也不断出现新的技术和方法。
如层析方面,高压液相色谱是一种具有快速和分辨力的柱层析技术。
二、正文分离纯化某一特定蛋白质的一般方法包括前处理、粗分级分离、细分级分离和纯度鉴定四步：一、选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的材料进行预处理。
根据分离纯化的原料不同,要采取不同的方法进行预处理。
例如动物材料要去掉结缔和脂肪组织；植物和细菌要将细胞壁进行破碎；植物种子的去壳除脂；微生物的菌休和发酵液要进行分离等等。
破碎主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。
组织和细胞破碎以后,选择适当的缓冲溶液将目的蛋白质提取出来,细胞碎片等不溶物质用离心或者过滤的方法除去。
蛋白质的纯化与鉴定
蛋白质的分离纯化方法
分子大小：透析，超过滤，凝胶过滤层析等 溶解度：沉淀，盐析等 电荷：电泳，离子交换等 吸附性质：吸附层析 对配体分子的生物学亲和力：亲和层析
根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析、超过滤
加 压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
脱盐，浓缩
2.密度梯度离心
带负电荷的蛋白质 脱水作用
－ － － － － －
碱
酸
－ －
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷，不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
球状蛋白质
近似于球形或椭圆形，生物界中的大多数蛋白 质为球状蛋白质，如大多数的酶类、血红蛋白 、肌红蛋白以及多种溶解于胞液或体液中的蛋 白质。球状蛋白质一般可溶于水，并且具有特 异的生物学活性（如血红蛋白运输氧、酶起催 化作用等）。
纤维蛋白质
纤维状蛋白质多是构成机体的结构 材料，如皮肤、肌腱、软骨及骨组 织中的胶原蛋白，肺、大动脉等中 的弹性蛋白,毛发及皮肤中的角蛋 白,蚕丝中的蚕丝蛋白等。它们一 般难溶于水，在机体中起着粘合、 支撑、保护、负重和营养等功能。 纤维状蛋白质的更新较慢。
2．紫外吸收法
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和 色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收， 操作简便，但精确度不高。
蛋白质分离纯化与鉴定技术
体积排阻层析介质的选择
分子量分离范围
3000-70000
Sepharose
Sephadex
Superdex
凝胶类型
颗粒大小
SELECTION GUIDE BY TECHNICAL OVERVIEW - Gel Filtration Useful Useful Fractionation Fractionation Range (Mr) Range (Mr) Product Superdex Prepacked HR, PC and PE columns Superdex Peptide<ENDREF< FONT> Superdex 75<ENDREF< FONT> Superdex 200<ENDREF< FONT> Superdex prep grade Superdex 30 prep grade<ENDREF< FONT> Superdex 75 prep grade<ENDREF< FONT> Superdex 200 prep grade<ENDREF< FONT> Superose Prepacked HR and PC columns Superose 12<ENDREF< FONT> Superose 6<ENDREF< FONT> Superose prep grade Lab packs Superose 12 prep grade<ENDREF< grade<ENDREF< Superose 6 prep FONT> FONT> Sephacryl 1 × 103 - 3 × 105 5 × 103 - 5 × 106 up to 3 × 105 up to 1 × 106 1 × 103 - 3 × 105 5× 103 -5× 106 NA NA 100-7 000 (peptides) 3× 1× 1037 × 104 105 5× 1× 104 -6× NA 102 103 -3× -1× 104 105 (Proteins) (Dextrans)
蛋白质分离纯化及鉴定
浓缩胶缓冲液 水
分离(fēnlí)胶 (8%) 浓缩胶 (4%)
1.25 ml
/
/
0.5 ml
2.4 ml
1.2 ml
TEMED
10 ul
5 ml
AP
60 ul
25 ul
第二十四页，共27页。
2.2 样品处理 适量浓度蛋白溶液加入1×上样缓冲液混匀，
95℃水浴中处理5分钟。
2.3 加样 用微量进样器取10-15 l上述(shàngshù)混合液，通过 电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 2.4 电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接， 打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离 胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
适用的凝胶浓度/(%)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
第十七页，共27页。
1.3 种类
1) 连续系统与不目前常用(chánɡ yònɡ)的多为圆盘电泳(图1) 和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。
第十页，共27页。
5. 样品 上柱、洗脱、 (yàngpǐn) 收集。
a. 如图装好层析装置，打开下端(xià duān) 出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶 面
b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端 出口，使样品溶液流出至刚好达到凝 胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱 壁。
c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收集，
4.样品槽模板 5.固定螺丝(luó sī) 6.上贮槽 微型(wēixíng)电泳系统
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1、最小分子量测定法
测定蛋白质中某一微量元素的含量 如Mb含Fe为0.335%，则M=55.8/0.335%=16700。 这就是最小分子量。其实，真实分子量是最小分子 量的n倍，n指Fe的数目，Mb的n=1，所以 M=16700。
4、凝胶过滤法 （gel filtration)
分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
第四部分 蛋白质纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定
色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：能够获得蛋白质晶体 溶解度曲线单转折
相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方 法可能表现为不均一，因此需要互相验证。
电泳纯
结晶纯 色谱纯
第五部分 蛋白质的分离纯化方法
增加蛋白制品 (preparation) 的纯度 (purity) 或 比活（specific activity）。 去除变性的和不要的蛋白质。 所得蛋白质的产量达到最高值。
蛋白质分离纯化的一般程序
前处理（pretreatment） 粗分级分离（rough fractionation） 细分级分离（fine fractionation） 结晶(crystallization)及蛋白质的鉴定
根据目标蛋白的特性，制定由粗到精，由 分离效率低到分离效率高的纯化路线 特殊：亲和层析 制定快速有效的目标蛋白跟踪方法 （酶活 性，抗原-抗体反应，其它方法） 纯度：
SDS-PAGE （染色方法） HPLC
计算纯化效率与产率
蛋白质纯化的一般注意事项
在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻 注意维护它的稳定，保护它的活性。
4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基 -2,2’-二喹啉（BCA）形成配合物，显紫 色，比色测定。
5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
考马斯亮兰法是1976年由Bradford建立的， 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马 斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合 ，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕红色变为兰色。 经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性 氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相 结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋 白质浓度成正比。
1．双缩脲法 2、紫外吸收法 3．Folin-酚法（Lowry法） 4．BCA法 5．考马斯亮蓝法（Bradfold法）
1．双缩脲法
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝 色。当底物中含有肽键时（多肽），试液 中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通 过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的 波长为540nm。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结 合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度 负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟 形的长椭圆棒型。
四、蛋白分子的结构和形状
单位：Dalton(道尔顿）,
英国化学家、物理学家，原子学说创始人John Dalton. 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12=1/N g( N为阿伏伽德罗常数) ≈1.67×10-27千克
蛋白质分子量的测定
1、最小分子量测定法： 2、渗透压法 3、超离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、前处理（pretreatment） 去杂质、脱脂 细胞破碎
机械破碎法
研磨法 组织捣碎器法 超声波法 压榨法 冻融法
溶胀 自溶 化学法 酶解法
缓冲液溶提、离心或过滤去除细胞碎片
缓冲液的选择
离子强度：0.1-0.2 M pH范围：7.0 - 8.0 磷酸盐缓冲液 Tris缓冲液 1、抗氧化剂：DTT，BME，Cys，GSH 2、酶抑制剂：EDTA，蛋白酶抑制 PMSF 3、酶的辅因子或辅基 4、植物细胞（酚类化合物）：PVP 5、抗菌剂：NaN3
5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质 的变性。 6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。 7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L DTT(或β巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。 8、加1~10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重 金属对目标蛋白的破坏。 9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。
纯化实例：纯化Taq DNA聚合酶
带负电荷的蛋白质 脱水作用
－ － － － － －
碱
酸
－ －
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
二、蛋白质的胶体性质
胶体性质（colloidal system）
胶体溶液的特点： 分散相质点直径在1-100 nm内 分散相质点带同种静电荷，不易聚集沉淀 溶于水 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
Bradford法的优点
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突 出优点，因而得到广泛的应用。这一方法是目 前灵敏度最高的蛋白质测定法。 （1）灵敏度高 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。 （3）干扰物质少。
缺 点
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸 的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测 定时有较大的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰 物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸 钠（SDS）和0.1 N的NaOH。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，测定未知蛋白 的595nm吸光值需落在标准曲线的线性范围内。
蛋白质的分离纯化方法
分子大小：透析，超过滤，凝胶过滤层析等 溶解度：沉淀，盐析等 电荷：电泳，离子交换等 吸附性质：吸附层析 对配体分子的生物学亲和力：亲和层析
根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析、超过滤
加 压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
脱盐，浓缩
2.密度梯度离心
一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团：α-NH3+ α-COO侧链上的功能基团 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 pI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH.
水化膜 + + + + + + + － － － －－ － － －
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用
碱 酸
带正电荷的蛋白质 脱水作用
+ + + + + + + +
最常使用的两种缓冲液
添加成分
2、粗分级分离
目的：去除杂蛋白，核酸，多糖等杂质， 同时浓缩蛋白质溶液
特点：简便，处理量大 方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分 级分离、超过滤、凝胶过滤、冷冻真空 干燥、加热变性沉淀，等等。
3、细分级分离
目的：进一步纯化目的蛋白
特点：规模较小，分辨率很高
2．紫外吸收法
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和 色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。 280nm比色，测定后蛋白质溶液还能回收， 操作简便，但精确度不高。
3．Folin-酚法（Lowry法）
蛋 白质 中的酪 氨酸或 半胱氨 酸 ，能 与 Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色 化合物，500nm比色测定。 Folin-酚试剂的配制比较复杂。
蛋白质的分子结构包括
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
球状和纤维蛋白质
根据蛋白质分子的形状可分为：
球状蛋白质(globular protein) 纤维状蛋白质(fibrous protein)
1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的水生栖热菌(Thermus aquaticus)
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。 2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL-mg/mL。 3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的 缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。 4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的 降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解 DNA，防止DNA对蛋白的污染。
利用溶解度差别的纯化方法
1. 等电点沉淀和pH控制
蛋白质处于等电点时， 其静电荷为零，由于相邻蛋 白质分子之间没有静电斥力 而趋于聚集沉淀。
等电点沉淀实例
①工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性 蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定 浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现 含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0 的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40% 饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液 再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
方法：一般使用层析法，还可以选
择电泳法
4、结晶及蛋白质的鉴定
只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形 成结晶。纯度越高，溶液越浓越容易结晶。 由于结晶中ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ未发现过变性蛋白质，因此蛋白质 的结晶不仅是一个纯度的标志，也是断定制品处于 天然状态的有力指标。
第三部分 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
1966年，Andrews得出一个经验公式： lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开 始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所 流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对 分子质量，a和b为常数。