黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化

黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化
学生姓名: 方三秀
学号: 07055216
指导老师: 李敏
专业: 生物技术
二○一○年九月十日
摘要
通过摇瓶培养实验,对酶黑曲霉A3生长曲线进行了初步摸索,并进一步对其产CMC 酶活的液体发酵的最适培养基和培养条件进行了初步探讨。

关键词：黑曲霉；CM-纤维素酶；液体发酵
绪论
纤维素是自然界中最丰富的生物资源, 但纤维素大部分难以被人类或动物利用, 如利用纤维素酶将纤维素降解成可被人类利用的糖无疑是开辟了一个新的能源来源[1]。

纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称，应用极其广泛，如
酿造果汁与蔬菜加工，粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面[2]。

纤维素
酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，但研究和生产中所用的纤维素酶都是用真菌发酵得到的，菌种大多是木霉、曲霉和青霉、根霉属和漆斑霉属等。

而黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性，可望用于食品和医药等领域。

故希望通过对黑曲霉A3 产纤维素酶的液体发酵产酶条件的优化，以获得酶的高产量，为纤维素酶的生产应用奠定基础。

1．材料与方法
1.1 菌种
黑曲霉A3(Aspergillus niger A3)：当地采取。

1.2 培养基及培养条件
1.2.1营养盐液Mandels 氏营养盐液[3]，再加入NaNO3 4.0 g/L。

1.2.2 斜面培养基(1)菌种保藏培养基(g/L)：麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，用营养盐液配制；(2)产孢子培养基：PDA 培养基。

1.2.3 发酵产酶基础培养基产纤维素酶基础培养基(g/L)[4]：玉米芯80，用改
良
Mandels 氏营养盐液配制，250 mL 三角瓶30 mL 装液量，起始pH5.5～6.0。

上述所有培养基均在1.0×105 Pa、121 ℃灭菌30 min。

1.2.4 斜面培养将接种后的斜面于28 ℃培养4～5 d。

1.2.5 摇瓶发酵产酶培养将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬液，接种3 mL(1.2×108 个孢子)到发酵培养基中，于28 ℃、200 r/min 振荡培养。

1.3 测试及计算方法
1.3.1 酶活力的测定方法CM-纤维素酶活力的测定：取适当稀释的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的羧甲基纤维素钠悬浮液中(pH4.6，0.2 mol/L醋酸缓冲液配制)于50 ℃水浴反应10 min，用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法，测定产生的还原糖。

以木葡萄糖为标准，在本实验条件下，每min 产生1 μmol 还原糖所需的酶[5-6]。

定义为1 个酶活力单位(IU/mL)。

1.3.2 pH 值的测定采用国产精密pH 试纸和pHs-25 型酸度计。

2 结果
2.1 产纤维素酶发酵特性研究
为了对黑曲霉产纤维素酶的发酵条件进行研究，首先对其发酵产纤维素酶的特性进行了考察。

实验按25 g/L 的浓度加入麦秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同碳源，用营养盐液配制250 mL 三角瓶装液量30 mL，在28 ℃、200 r/min 振荡培养，每隔24 h 取样测定纤维素酶的活力，结果见表1。

表1 黑曲霉A3 产纤维素酶发酵时间与酶活的关系
碳源(25 g/L)
不同发酵时间的相对酶活力/%
24 28 72 96 120
玉米芯
甘蔗渣
麦秸粉
2.2 碳源浓度对产纤维素酶的影响
在确定最佳产纤维素酶的碳源后，以玉米芯为碳源，在30 mL 装液量(250 mL 三角瓶)下，对碳源浓度进行了考察，结果见表2。

表2 不同浓度玉米芯对A3 产纤维素酶的影响
玉米芯浓度/(g/L) 相对酶活/%
CK 100
40
60
80
100
考察了不同附加碳源对黑曲霉A3 产复合酶的影响，结果见表3。

表3 不同附加碳源对A3 产纤维素酶的影响
附加碳源/(10 g/L) 相对酶活/%
CK 1
蔗糖
萄葡糖1
乳糖
麦芽糖
可溶性淀粉
2.3 不同氮源对产纤维素酶的影响
在确定玉米芯的最适浓度后，以80 g/L 的玉米芯为碳源，在去除(NH4)
2SO
4
的Mandels 盐液中分别加入酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钠以及它们的复合物，浓度为6 g/L，来研究氮源对纤维素酶酶活的影响(其他条件同基础产酶培养基)，其结果表明黑曲霉产纤维素酶对氮源的利用以蛋白胨效果最佳(见表4)。

表4 不同氮源对A3 产纤维素酶的影响
培养时间/h
氮源0 48 72 84
pH pH 纤维酶
活力/% pH 纤维素酶
活力/%
pH 纤维素酶
活力/%
尿素
蛋白胨
酵母膏
蛋白胨+酵母
膏
NaNO
3
(NH
4)
2 SO
4
(NH
4)
2
SO
4
+尿素
尿素+ CK
2.4 调控发酵pH 对产酶的影响
研究发现，黑曲霉产纤维素酶发酵始末pH 值的变化很大，可见黑曲霉发酵
产纤维素酶的同时产酸，使得发酵液的pH 值下降，而抑制了酶的产生。

因此，
在培养基中添加CaCO
3
考察对产酶的影响(表5)。

表5 CaCO
3
的添加量对发酵产酶的影响
CaCO
3
的量
/(g/L)
CK 10 20 30 40 50
纤维素酶活力
/%
发酵72 h pH
值
2.5 装液量对产酶的影响
在250 mL 的三角瓶中分别装入20、30、50、70、90 mL 的发酵液，并接入等量的孢子进行发酵培养，考察不同摇瓶装液量对A3 产纤维素酶的影响，结果见表6。

表6 摇瓶装液量为A3 产纤维素酶的影响
装液量/mL CK(30) 20 50 70 100 纤维素酶
/(IU/mL)
2.6 发酵温度对产酶的影响
温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。

一方面随着温度的升高，细胞内参与生命活动的酶反应速度加快，代谢和生长也相应加快；另一方面，随着温度的进一步增高，生物体内的活性物质(如蛋白质、核酸等)发生变化，使细胞功能下降，甚至死亡。

因此，每种微生物都有其最适生长温度范围。

在上述优化条件的基础上，就不同温度下黑曲霉产纤维素酶进行了研究(见表7)。

表7 温度对产酶的影响
温度/℃25 28 30 32 34
纤维素酶活力/%
3 结论
在纤维素酶的生产过程中，影响酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还
有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等，而这些因素之间又不是孤立的，而是相互联系的[7]。

参考文献
[1] 舒国伟, 陈合, 谢宏霞, 等.纤维素酶液体发酵条件的优化.中国酿造,2008年第24期
[2] 张明霞,段长青,张文娜.纤维素酶在食品工业中的应用与展望[J].酿酒科技,2005,(4):99-100
[3] 赵玉林,陈中豪,王福君.纤维素酶在造纸工业中的应用研究进展[J].纸和造纸,2002,(2):64-66
[4] 李辉,李友明.纤维素酶在废纸脱墨技术中的应用[J].西南造纸,2003,(1):36-38
[5] 曾傲,叶君.纤维素酶水解及其在能源与环境保护中的应用[J].广东化工,2006,33(10):25-28
[6] 徐晓飞,林炜铁,杨继国,等.纤维素酶在纺织工业中应用研究的进展[J].上海纺织技,2003,31(5):34-
36
[7] 吕东海,周岩民,李如治.饲用纤维素酶应用研究.中国饲料,2004,(9):25-27。