DNA循环测序中的影响因素和图例分析
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DNA测序常见问题及其分析
测序常见问题及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。
问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。
如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。
解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。
4、poly A/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。
DNA测序分析常见问题整理[优质ppt]
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酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明” 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
割胶纯化
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
有机物污染（瀑布效应）
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA测序分析常见问题整理
DNA测序分析常见问题整理
酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
DNA测序分析常见问题整理
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
DNA测序分析常见问题整理
有机物污染（瀑布效应）
● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受 激发产生一定波长的荧光，抬高 基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗 或更换胶引导块、针筒。
DNA测序分析常见问题整理
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers
DNA测序分 析常见问题 整理
DNA测序分析常见问题整理
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T CG
DNA测序分析常见问题整理
影响测序质量的主要因素
引物 DNA模板 纯化 困难模板 机器影响
DNA测序分析常见问题整理
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射 。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
DNA测序分析常见问题整理
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
DNA测序分析常见问题整理
有机物污染（瀑布效应）
● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受 激发产生一定波长的荧光，抬高 基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗 或更换胶引导块、针筒。
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四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers
DNA测序分 析常见问题 整理
DNA测序分析常见问题整理
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T CG
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影响测序质量的主要因素
引物 DNA模板 纯化 困难模板 机器影响
DNA测序分析常见问题整理
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射 。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
DNA测序分析常见问题整理
一、引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
共同学习，重在交流
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个 同样荧光信
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一
● 现象：每个峰前面有个 同样荧光信
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DNA测序 分析常见问
题整理
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T C G
共同学习，重在交流
影响测序质量的主要因素
➢ 引物 ➢ DNA模板 ➢ 纯化 ➢ 困难模板 ➢ 机器影响
共同学习，重在交流
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
共同学习，重在交流
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它 颜色
● 原因：PCR主带与杂带混在 一起测序
● 对策：凝胶电泳回收主带，
重新测序
割胶纯
化
共同学习，重在交流
点突变（SNP）
突变点
模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
共同学习，重在交流
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
共同学习，重在交流
酒精峰
DNA测序分析常见问题整理
模板上没有引物结合位点
● 现象：没有特异性的 测序峰图 ● 原因：引物无法结合 模板 ● 对策 重新设计引物
引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常 （引物二聚体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净 ● 对策：割胶纯化
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受 激发产生一定波长的荧光，抬高 基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗 或更换胶引导块、针筒。
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
特殊结构
Poly结构
酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶 引导块、针筒。
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。 Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
高GC
Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。
重复序列
GT 重复导致信号衰减
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T CG
影响测序质量的主要因素
DNA测序分析常见问题整理
DNA测序分析常见问题整理
特殊结构
DNA测序分析常见问题整理
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
DNA测序分析常见问题整理
高GC
Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。
DNA测序分析常见问题整理
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
DNA测序分析常见问题整理
DNA测序分析常见问题整理
一、引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
DNA测序分析常见问题整理
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
DNA测序分析常见问题整理
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
特殊结构
DNA测序分析常见问题整理
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
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高GC
Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。
DNA测序分析常见问题整理
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
DNA测序分析常见问题整理
DNA测序分析常见问题整理
一、引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
DNA测序分析常见问题整理
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
DNA测序分析常见问题整理
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA循环测序中的影响因素和图例分析
82" Q4#>6" H23U"1 #331 1$8$C 02" L"$VH H23><1 P" H2$6L， U"<< 1"Q45"1 *： $51 H;$<"1 24#2C +： 534H: 1$8$ U$H ;2$6$;8"64W"1 P: $ 24#2 P$;V#63>51 $51 （024H #"5" U$H ;<35"1 4583 C 9： $P6>L8 H4#5$< <3HH L"$VH >51"6 L"$VH（ RH） 07)$H: X";836）
基金项目： 国家 !"# 高科技生物技术领域资助基金 （!"# $ %&’ $ &( $ &’ $ &(） 作者单位： %&&&)& 北京， 卫生部艾滋病预防与控制中心
（ POQ） 的 %/% 测序的 *+, 标本 人免疫缺陷病毒 标本 份， 马传染性贫血病毒 （ ） *+, % %&& RO,Q *+, 标本 !&& 份， 趋化受体 （ J>913K?@9 =9<9G53=4） *+, 样 品 %’& 份， 其他 *+, 标本 ’& 份。 （ @94597 LJS） 方法， %/’ LJS 产物 通过套式 LJS 扩增所需要基因。POQ 基因是从我国 POQ 感染者血 中扩增所需的基因片段， 详见文献 ［(］ 。趋化受体基 因从我 国 维 吾 尔 族， 汉 族 等 献 血 血 样 扩 增 JJS)， JJS’ 和 JT#JS% 等受体基因。 RO,Q 基因原始毒株 是由协作单位哈尔滨兽医所提供。 LJS 产物的纯化 主要使用 U?;C9@ 公司出品的 U?B9M 试剂盒。 %/# 质粒产物 为多种不同的 LJS 产物分别克隆 不 同 的 质 粒（ 0F9;48，GVJ%W，G+930X，G<*+,OO， 和 G0RP 等） 中扩增。用 U?;C9@， GYZ##!正常情况下 07)$H: 载体系统克隆样品的序列图谱 02" H"=>"5;" 1$8$ 3P8$45"1 Q63! #"5"H ;<35"1 U482 07)$H: X";836 >51"6 536!$< ;35148435
DNA测序分析常见问题整理
● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺 、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导 块、针筒。
第二十一页，共30页。
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
第二十二页，共30页。
特殊结构
第二十三页，共30页。
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
第三页，共30页。
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。
● 对策：重新合成引物
第四页，共30页。
第六页，共30页。
引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚 体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净
● 对策：割胶纯化
第七页，共30页。
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套 峰
● 原因：模板有两个引物结合位点，同时和 两个引物结合
● 对策：重新设计单个引物
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基
A TCG
第一页，共30页。
影响测序质量的主要因素
• 引物
• DNA模板
•引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
第八页，共30页。
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
第二十一页，共30页。
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
第二十二页，共30页。
特殊结构
第二十三页，共30页。
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。
第三页，共30页。
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信
号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。
● 对策：重新合成引物
第四页，共30页。
第六页，共30页。
引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚 体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净
● 对策：割胶纯化
第七页，共30页。
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套 峰
● 原因：模板有两个引物结合位点，同时和 两个引物结合
● 对策：重新设计单个引物
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基
A TCG
第一页，共30页。
影响测序质量的主要因素
• 引物
• DNA模板
•引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
第八页，共30页。
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
DNA测序分析常见问题整理
实用文档
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子
原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
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三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
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染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
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DNA测序分 析常见问题 整理
实用文档
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A TCG
实用文档
影响测序质量的主要因素
• 引物 • DNA模板 • 纯化 • 困难模板 • 机器影响
实用文档
一、引物对测序结果的影响
实用文档
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
实用文档
四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
实用文档
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖， 有小突起
实用文档
实用文档
割胶纯化
实用文档
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
实用文档
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
实用文档
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
实用文档
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子
原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
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三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
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染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
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DNA测序分 析常见问题 整理
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测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A TCG
实用文档
影响测序质量的主要因素
• 引物 • DNA模板 • 纯化 • 困难模板 • 机器影响
实用文档
一、引物对测序结果的影响
实用文档
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
实用文档
四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
实用文档
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖， 有小突起
实用文档
实用文档
割胶纯化
实用文档
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
实用文档
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
实用文档
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
实用文档
DNA测序分析常见问题整理
26
重复序列
GT 重复导致信号衰减
2021/10/10
A/G重复导致信号衰减 或信号乱
27
回文结构
其他复杂的二级结构也
四、机器因素对测序结果的影响
① 毛细管寿命 ② 其它
2021/10/10
29
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后拖， 有小突起
2021/10/10
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
2021/10/10
噪音信号高
终止峰
11
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
割胶纯化
2021/10/10
12
点突变（SNP）
突变点
如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。
8
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就 出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时 和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物
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二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
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正常模板与噪音
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三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
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染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
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中华实验和临床病毒学杂志 APPF 年 E 月第 F3 卷第 5 期
Байду номын сангаас
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表! "#$% !
引物 !#*+(# 8? 6!N QF5R :"2SA :"2<A !%9@ G5 M? MG3 K*&M 8"$S 78RAP R8RDP <TDP <<RA KD T 序列 （34!54） 6(/-(01( 8@@8@<:@<8<@<8@8@:::@:@ <@8@<:@888@::8:@<@<8@8@: <@::@@@<@:<8@8:@<< <:@:@:<:8<@:8@88@@:<:: :::<@@@8::8@<@8<@::<<@ 8@@@::@@:<8<<@88@: 8::<@:8<8@:<@:@@: <8:88@@@8::<@:8<8@:< @8:::@8<@@@:<<8@@@:<<@8:8: @:@8::@@<@@:<<<<@:@@:@<< @@8::@:<<@:8@:@8< :<<88@@8:<@@<@:8< ::8@8@:8:@@@8@8:<@8<8<< @@:8:@:::@<@8<<::<8 ::@88:@@<@@::@<:<@888@@@@ :@::8<<88<@::@@@8<8::<<<:8:
*+, 测序技术已日益广泛的应用于分子生物 ［%］ 学的研究 。我们在进行我国 POQ 分子流行病学调
［’F)］ ［"］ 查 和 POQ 分 子 疫 苗 的 研 究 中， 对不同类型 （包括 POQ， 基因 ’ &-& 样品 RO,Q 和人的趋化受体）
B
材料和方法
进行序列分析， 通过对序列结果的回顾性分析研究， 我们认为 *+, 循环测序对双链 *+,， 包括 LJS 产 物、 各种大片段的基因组 *+, 和 <*+, 克隆均能得 到较好的测序结果， 具有精密度高， 可读序列长， 快 速方便等特点。但要得到高标准的 *+, 序列图谱， 除了严格按标准操作， 控制好测序中各个环节如所 用水、 玻璃的清洁度外， 模板的制备、 测序所用的引 物和反应产物纯化等因素对测序结果有重要影响。
・ BT’ ・
中华实验和临床病毒学杂志 BDD% 年 E 月第 %F 卷第 N 期
9245"H" Z )[L 9<45 A463<， ."L8"!P"6 BDD%， A3< %F， R3C N
!"#$ 等公司质粒提取试剂盒制备。 %&’ 测序反应 测序反应为循环测序法。采用 () 公司的三种试剂盒： *+, (-,./0/ 1-231$!45" 0"6!47 5$836 9:;<" ."=>"5;45# -"$1: -"$;8435 ?48， *+, (-,./! +4#@:"0/ 0"6!45$836 9:;<" ."=>"5;45# -"$1: -"$;8435 和 *+, (-,./! +4#@:"0/ 0"6!45$836 9:;<" ."=>"5;7 ?48， 45# -"$1: -"$;8435 ?48 A B C D。测序反应循环条件为 EF G %D H， FD G F H， ID G ’ !45， BF 个循环， ’ G保 存。测序反应产物的纯化用下列三种方法： JF K 异 丙醇 （ ,H3L63L$53<） 沉淀法， 测序反应产物加入 %BD ! < 混均， JF K 异丙醇， ’ G %D DDD 6M!45 离心， ND !45。 用移液器吸去上清， 室温干 燥。乙 醇 M 乙 酸 钠 沉 淀 法， 按 ?48 说明书进行。层析柱提纯法按 ?48 说明书 进行。 用 N! 取 < O3$145# P>QQ"6 悬 起 反 应 物， 在 *+, NJJ @R* 测序仪中进行电泳； 用 %&% ! < 上样， ."=>"5;45# *5$<:H4H A"6H435 N C D 进行分析。 %&F ! 结果 电泳
中华实验和临床病毒学杂志 ’&&% 年 W 月第 %) 卷第 # 期
J>?@949 \ RMG JA?@ Q?=3A， ]9G591D9= ’&&%， Q3A %)， +32 #
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技术方法・ ・
*+, 循环测序中的影响因素和图例分析
赵全壁 潘品良 温宁 邵一鸣
【摘要】 目的 研究。结果
通过对 ’ &-& 份样品的 *+, 测序， 回顾性分析和研究 *+, 循环测序过程中一些 对测序中模板、 引物、 测序反应条件及其产物的纯化等因素进行比较
正常序列图谱， 曲线的波峰高， 尖、 界限清晰； 序列图谱有噪 *： +： 出现信号突然终止现象 （此 峰出现， 背景混乱， 碱基不易判读； 9： 序列样品基因是以 07)$H: 为载体克隆的） 图" #$%& " 序列图谱 02" H"=>"5;45# Q4#>6"
B&% @R* 模板对测序结果的影响 见图 %。 @R* 模板的质量是测序成败的主要因素， 因模板的原因 引起测序失败的占 JDK 。图 %* 为标准图谱。而模 板质量不好， 如有些 (9- 产物纯度不够， 其序列曲 线有噪峰出现， 碱基不易判读 （图 %+） 。当模板浓度 过大， 可读序列长度明显降低， 且核苷酸曲线在高峰 值过后迅速降低； 模板量过低时， 序列曲线的信 S 噪 比值明显减少， 甚至得不到核苷酸信号。另外， 假如 重组质粒的产物纯化不好， 也会出现信号突然终止 的现象 （图 %9） 。而同一质粒克隆的产物提纯效果 好， 序列可读到 TDD 多个碱基， 见图 B。 B&B 测序引物对测序结果的影响 由于引物问题 而引起测序失败占 %F&’K 。主要的原因有： " 引物 失效， 由于保存时间过长， 反复冻融， 使纯度降低， 占 测序失败的 %D&FK ； # 引物不匹配及结合位点发生 突变， 占测序失败的 ’&EK 。表 % 所列为测序使用的 部分引物。 B&N 三种测序产物纯化方法的比较 乙醇 M 乙酸钠 沉淀法， 纯化测序反应产物需要几个步骤， 且残余酒 精经室温挥发后， 有残余的荧光染料。层析柱提纯 法， 纯化效果好， 但进行大规模测序则是不经济的。 只需 % 次离心， 室温挥发 D&F 2 JFK 异丙醇沉淀法， 即可， 效果好且经济。
基金项目： 国家 !"# 高科技生物技术领域资助基金 （!"# $ %&’ $ &( $ &’ $ &(） 作者单位： %&&&)& 北京， 卫生部艾滋病预防与控制中心
（ POQ） 的 %/% 测序的 *+, 标本 人免疫缺陷病毒 标本 份， 马传染性贫血病毒 （ ） *+, % %&& RO,Q *+, 标本 !&& 份， 趋化受体 （ J>913K?@9 =9<9G53=4） *+, 样 品 %’& 份， 其他 *+, 标本 ’& 份。 （ @94597 LJS） 方法， %/’ LJS 产物 通过套式 LJS 扩增所需要基因。POQ 基因是从我国 POQ 感染者血 中扩增所需的基因片段， 详见文献 ［(］ 。趋化受体基 因从我 国 维 吾 尔 族， 汉 族 等 献 血 血 样 扩 增 JJS)， JJS’ 和 JT#JS% 等受体基因。 RO,Q 基因原始毒株 是由协作单位哈尔滨兽医所提供。 LJS 产物的纯化 主要使用 U?;C9@ 公司出品的 U?B9M 试剂盒。 %/# 质粒产物 为多种不同的 LJS 产物分别克隆 不 同 的 质 粒（ 0F9;48，GVJ%W，G+930X，G<*+,OO， 和 G0RP 等） 中扩增。用 U?;C9@， GYZ##!， G[L0， L=3F
影响因素及其序列图谱。方法
模板因素是测序成败的主要原因， 占测序失败的 (&. 。模板的质量直接影响着测序图
谱， 模板纯度不够， 序列曲线表现为可读序列短， 开始时波峰过高不易判读， 然后峰值迅速降低， 并有 噪峰出现， 信号减弱， 在原始资料中核苷酸曲线的波峰扁平或者没有信号。模板浓度过高， 序列曲线 呈现头重脚轻， 可读序列短； 而浓度过低， 则信号衰减。引物问题引起测序失败占 %)/-. ， 主要原因为 引物失效， 与模板匹配不完全， 效果好 01 值过低等因素。利用 (). 异丙醇沉淀纯化测序反应产物， 且简单， 经济。结论 异丙醇沉淀法。 【主题词】 循环测序； *+,； 噪峰 !"# $%&’(#%)$*’ &*)+,-. ,% /01 )2)’# .#3(#%)$%4 *%5 5*+* #6*’(*+$,% ,& 7-*)+$)*’ #8*97’# !"#$ %&’()* ， +#, +*(-*’(. ，/0, ,*(. ， 12 ’- 2 ,’2*3(’- 41(215 635 #789 +51:1(2*3( ’(; 43(253- ，<1*=*(. %&&&)&， 4>*(’ 【1:.+-*)+】 ;:<#)+$6# 03 45678 4319 :;<53=4 5>;5 1;8 ?@:A69@<9 *+, 49B69@<?@C D8 ;@;A8E?@C ’ &-& 49F B69@<?@C 4;1GA94 =95=34G9<5?H9A82 =#+",5. 0>9 9::9<54 3: *+, 591GA;594，G=?19=4， <8<A9 49B69@<?@C =9;<5?3@4 ;4 I9AA ;4 G6=?:?<;5?3@ 195>374 I9=9 <31G;=;5?H9A8 ;@;A8E972 >#.(’+. (& G9=<9@5 3: 49B69@<?@C :;?A6=9 ?4 <;6497 D8 ;<F *+, 591GA;592 J>;=;<59=?45?<4 3: 7;5; :=31 G33= 591GA;59 G=9G;=;5?3@ ?@<A679 53GF>9;H8 I?5> ; 4>3=5 =9;7 A9@C5>， ， <9G5;DA9 4?C@;A I?5> 4319 @3?49 G9;K4（ +4） I9;K 4?C@;A， 3H9=;AA @3?49 ;@7 :A;5 A?@94 3= @3 4?C@;A2 0>9 ?@9::9<5?H9 G=?19=4 <;@ <;649 %) 2 - G9=<9@5 49B69@<?@C :;?A6=92 L344?DA9 9MGA;@;5?3@4 ?@<A679 G=?19= 1?41;5<>94 ;@7 A3I 01 H;A692 ?,%)’(.$,% 0>9 B6;A?58 3: 591GA;59 *+, <;@ >;H9 ; 1;N3= ?1G;<5 3@ 5>9 B6;A?58 3: 5>9 *+, 49B69@<?@C2 L6=?:?<;5?3@ 3: 5>9 9M59@4?3@ G=376<54 ?4 ;D43A659A8 @9<944;=8 ?@ *+, 49B69@<?@C ;@7 O43G=3G;@3A L=9<?G5?5;5?3@ ?4 >?C>A8 =9<3119@797 :3= 5>?4 G=3<976=92 【@#2 A,-5.】 J8<A9 49B69@<?@C； *+,； +3?49 L9;K4 （+4） 测序的质量与模板的纯度、 浓度有着直接的关系， 在大规模的测序中， 推荐使用