血清双向电泳研究中的失误分析及解决
双向电泳过程中的常见问题及解决方法
油 ，％ Ｓ Ｓ １ ＇ ５ ｍ ｌＬＴ ｓＨ １ｐ ２ Ｄ ，％ＤＩ ０ｍ ｏ ｒ — Ｃ ，Ｈ值 ８ ８ 中轻缓 震 Ｔ， ／ ｉ ．） 荡平衡 １ ｏ ５ｍｉ。在 Ｓ Ｓ平衡液 Ｂ ６ｍ ｌＬ尿素 ， ％甘油 ，％ Ｄ （ ｏ ／ ３ ０ ２
质 。根据 每个蛋 白质点 的等 电点 和分 子量 进行 双 向 电泳
随着大量生物基 因组序列 的测 定 ， 们发 现在 生物 的基 人 因组 序列中有许 多序 列不 能够 找 到 已有 的同 源序 列 。这 些
序列 的功能就成 为后 基 因组 时代 的重 要工 作 内容 。现 有 的 鉴定基 因功能 的方 法主 要有 Ｎ ｒ ｅ ｏ ｈｒ ｔ ｎ印迹 、 Ｄ Ｔ 基 因芯 片 ＤＲ 、 等 。但是这些 方法 都没 有 考虑 到 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的翻译 以 及翻 译后
分离能够进行大量 蛋 白质点 的分离 。
１ 材料与方法
Ｓ Ｓ２５ Ｄ ，．％碘 乙酰 胺 ， 量溴 酚 蓝 ， ｍ ｌＬＴｓ Ｃ，Ｈ值 痕 ５ ｍ ｏ ｆ— １ｐ ０ ／ ｉＨ
８８ 中轻缓震 荡平衡 １ ｉ。 ．） ５ｍｎ
１６ Ｄ ．Ａ Ｅ聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电泳 ． Ｓ ＳＰ Ｇ
主要有 ： 电聚焦不充分 ； 白质样 品纯度不 够 ； 向电泳前 等 蛋 双
８８甘油的浓度至少要 达到 ２％； ．， ０ ⑤蛋 白质氧化交 联或者 重
新折 叠 ， 白在 二 向分离 时氧化 容易 出现纵 条纹 ， 蛋 如果样 品
胶条平衡不充 分。
没有烷基化 ， 以在含有 碘代乙酰胺 的第 二次平衡 缓 冲液中 可
２ 中存 在 的主 要问题 有 ： 白质 点太 少 ； 白质 点 拖 蛋 蛋
作者简介 舒海燕（９５ ） 女 ， １７ 一 ， 河南 罗山人， 师， 讲 从事遗传学研究
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳中的问题及其解决方法
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在两个方向上进行电泳分离的技术，通常用于核酸和蛋白质的分析。
在进行这种电泳过程中，可能会遇到一些问题。
以下是一些常见问题及其可能的解决方法：
1.电泳带模糊或不清晰：
-可能原因：
-样品质量不纯。
-缓冲液配制有问题。
-电场均匀性差。
-解决方法：
-使用纯净的、高质量的核酸或蛋白质样品。
-重新配置新鲜的缓冲液。
-检查电场均匀性，确保电场平均分布。
2.电泳速度过快或过慢：
-可能原因：
-电流设置不当。
-缓冲液浓度不正确。
-解决方法：
-调整电流，确保在设备规定的范围内。
-检查并重新配置适当浓度的缓冲液。
3.电泳带变形或扭曲：
-可能原因：
-样品加载不均匀。
-凝胶浓度选择不当。
-解决方法：
-确保样品加载均匀，使用适当的体积和加载方法。
-重新制备适当浓度的凝胶。
4.电泳凝胶干燥或开裂：
-可能原因：
-凝胶聚合物浓度太高。
-电泳室湿度不足。
-解决方法：
-降低凝胶聚合物的浓度。
-提高电泳室的湿度，可以考虑使用湿度控制设备。
5.样品负载量过多或过少：
-可能原因：
-样品量测量错误。
-样品浓度过低。
-解决方法：
-确保准确测量样品量。
-调整样品的浓度，确保在电泳中可以产生明显的带。
在实验过程中，及时记录实验条件和参数，有助于更容易地识别和解决问题。
如果问题持续存在，建议向实验室同事、导师或相关领域的专家寻求帮助。
蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析
蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析Ξ刘健平,陈国华,陈本美,周 平,唐瑶云(中南大学湘雅医学院分析测试中心,中国湖南长沙 410078)摘 要:从以固相pH梯度等电聚焦为第一向,S DS2PAGE电泳为第二向进行的蛋白质组双向电泳实验中挑选了一些常见的硝酸银染色22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.关键词:固相pH梯度;蛋白质组;双向电泳中图分类号:Q5233 文献标识码:A文章编号:100727847(2003)022******* Analysis of T roubles in22Dimensional G elsE lectrophoresis of Proteomic StudiesLIU Jian2ping,CHEN G uo2hua,CHEN Ben2mei,ZHOU Ping,T ANG Y ao2yun (The Central Testing Lab,Xiangya School o f Medicine,Central South Univer sity,Changsha410078,Hunan,China)Abstract:S ome failure images in22dimensional gel electrophoresis of proteomic studies were collected and classified.P ossible reas ons for troubles were analyzed and the methods to overcome them were discussed.K ey w ords:imm obilized pH gradient;proteome;tw o2dimensional gel electrophoresis(Life Science Research,2003,7(2):177～180) 蛋白质组学是新近形成的生命科学研究热点,一般包括双向电泳分离技术和质谱检测鉴定技术两大部分.双向电泳分离技术所涉及的环节较多,一般包括蛋白质提取、等电聚焦、蛋白质转移、S DS2PAGE电泳、凝胶硝酸银染色等环节,每一环节又包括若干步骤,如蛋白质提取环节又可以细分为裂解液组成配方、裂解方式选择、抑制蛋白酶降解活性、使蛋白质溶解、去折叠、变性及解聚合、除去核酸、离子、脂类、多糖类、酚类等杂质步骤.由此可见双向电泳分离技术是一个受多种因素控制的技术,其中任何一种因素没有理想地控制好都有可能引起整个实验的失败,而且这种失败往往要等到双向电泳图谱硝酸银染色显影之后才能看到,此时不但已耗费大量人工和试剂,而且有时还难以迅速和准确地找到失误的真正原因.我们从实际工作中挑选了一些典型的22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.1 取图方法根据蛋白质斑点的有或无、斑点是否规则清晰、斑点是否有横向或纵向条纹、斑点在整张图谱中的分布是否扭曲或倾斜或团聚或离散、凝胶的背景色是否清晰均匀、凝胶图谱中非斑点处是否有横向或纵向的条纹及条纹出现的位置等标准,从大量22DE凝胶硝酸银染色结果图谱中挑选出一些典型的失误图谱作为分析研究的对象.第7卷 第2期2003年6月 生命科学研究Life Science Research V ol.7 N o.2June2003Ξ收稿日期:2002212229;修回日期:2003202225作者简介:刘健平(19712),男,湖南溆浦人,中南大学助理研究员,硕士,主要从事蛋白质组学和蛋白质化学研究,T el:+86207312 4805312,E2mail:hnljp888@2 失误图谱图1～10中,从左到右为第一向等电聚焦阳性到阴性的方向,从上到下为第二向S DS2PAGE 电泳高分子量蛋白质到低分子量蛋白质的方向.图1 仅图谱下端能看到少量斑点Fig.1 Only little spots are visible in low p art of thegel图2 部分斑点在垂直方向向某条纵轴倾斜Fig.2 Spots concentrate to a vertical axis line ofgel图3 部分斑点在局部区域团聚Fig.3 Some spots aggregate and crowd in thegel图4 图谱上端非斑点处有较多垂直方向条纹或团块Fig.4 V ertical streakΠsmear or agglomerate in thegel图5 有黑色颗粒和手印等杂质,看不到斑点Fig.5 Spots are invisible,contaminated by black p ar2ticles andfingerprint图6 图谱上端非斑点处有水平方向的浓条纹Fig.6 H orizontal stripes across the whole up p art of gel 871 生 命 科 学 研 究 2003年图7 在垂直方向单个斑点变成双点Fig.7 Spots verticallydoubled图8 斑点在水平方向有拖迹条纹Fig.8 Spots streakhorizontally图9 图谱在非斑点处有垂直方向的“∧”型纹、空白间隙或斑点不规则扭曲Fig.9 V ertical “∧”streak or gap or spots distortion across the wholegel图10 部分斑点有垂直方向拖迹条纹,背景色很深Fig.10 Some spots streak vertically and high b ack 2ground3 原因分析及讨论对于图1,可能的原因及解决办法:1)蛋白质从第一向转移到第二向时不完全,应该在第二向电泳开始时按单片凝胶10mA 先跑30min 的低电流电泳,然后再升高到单片凝胶20mA 电泳至溴酚蓝迁移到底部为止;2)平衡时间不充分,蛋白质被重新氧化,应该延长胶条的平衡时间至15min ,平衡液需要新鲜配制;3)蛋白质在水化时没有充分进入胶条,应该新鲜配制并且添加足够体积的水化液进入第一向电泳槽中,如在18cm 规格的第一向电泳槽中应该添加350μl 的水化液,另外还可提高IPG 缓冲液的浓度,如由0.5%提高到2%及延长等电聚焦的时间;4)蛋白质在高重力场下(>105g )长时间离心会使高分子量的蛋白质非特异性地丢失,应该避免对样品的这种离心处理.对于图2,可能的原因及解决办法:1)凝胶聚合太快或聚合时发生泄露引起左下角局部区域不均匀,应该将凝胶混合均匀再灌胶并且检查是否泄漏后再封一层薄水层;2)第二向凝胶顶端不平整引起胶条与它接触不好,使得琼脂糖固定液渗入两者之间的接触面空隙,或气泡或杂质渗入,应该平整好第二向凝胶顶端,放置胶条时要排除气泡或杂质.971第2期 刘健平等:蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析 对于图3,可能的原因及解决办法:1)凝胶浓度不合适,或聚合不均匀,应该调整分离胶的浓度并正确灌制凝胶;2)电泳时电流过大,电泳过程太快,应该降低电泳的电流至单片凝胶20mA;3)琼脂糖固定液浓度过高,或杂质阻止高分子蛋白质顺利进入第二向凝胶,应该使用新鲜配制0.5%的琼脂糖固定液,或除去杂质.对于图4,可能的原因的解决办法:1)蛋白质样品中含有较多的核酸,它们增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹,甚至还可能封闭凝胶孔,应该使用DNase I和RNAase A酶降解它们;2)核苷酸、磷脂、代谢物等内源性的小离子杂质常常造成胶条阳性端等电聚焦不理想,应该用TC AΠ丙酮法、透析等方法除去它们;3)两性电解质被银染上色,应该使用IPG缓冲液作为两性电解质,必要时可将其浓度降低至0.5%.对于图5,可能的原因及解决办法:1)银染步骤中硝酸银试剂失效,应该使用新鲜配制的硝酸银溶液染色,要戴干净的塑料手套并使用新鲜过滤的双蒸水;2)敏化、显影等步骤中的试剂含较多杂质,应该使用高纯度的试剂.对于图6,可能的原因及解决办法:1)第二向电泳缓冲液中含有杂质,或电泳装置不干净,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使用干净的玻璃板和电泳槽电泳;2)琼脂糖固定液含有杂质,应该使用新鲜配制的琼脂糖固定液.对于图7,可能的原因及解决办法:1)胶条在第二向凝胶顶端没有正确放置,应该以胶条的塑料保护膜面紧贴长玻璃板的方式放置胶条入两玻璃板的空隙内;2)水化液体积不够,或水化液在等电聚焦槽内分布不均匀使得胶条或胶条的局部区域水化不充分,应该确保足够的体积的水化液在整个第一向等电聚焦槽内均匀铺开,排除胶条胶面与槽面之间的气泡.对于图8,可能的原因及解决办法:1)等电聚焦不充分,应该延长等电聚焦的时间,可以使用3 500V或8000V的高电压以便取得良好的等电聚焦效果;2)过度等电聚焦(>105Vh)能够造成电渗和蛋白质飘移,应该减少等电聚焦的时间;3)蛋白质样品中含有离子,或离子型去污剂如S DS,应该将水化液的离子浓度控制在10mm olΠL以内,可以采用透析、层析、TC A沉淀等方法脱去离子,或使非离子型去污剂的浓度至少8倍于S DS的浓度;4)离子等杂质影响等电聚焦,尤其在酸性端如此,应该除去样品中的杂质.对于图9,可能的原因及解决办法:1)对水平S DS2PAGE而言,凝胶上面的水滴,或下面的气泡会引起热传导不均匀,应该使凝胶稍干燥或排除气泡后再电泳;2)气泡或水化液中的杂质存在于胶条与第二向凝胶顶端的接触面之间,应该排除气泡或杂质;3)电泳时热传导不均匀,或温度过高,应该调节电泳时恒温水循环仪温度为16℃;4)蛋白质没有充分溶解,应该增加裂解液中尿素或CH APS等试剂的含量使蛋白质尽可能完全地、稳定地溶解.对于图10,可能的原因及解决办法:1)硝酸银染色中显色时间太长导致凝胶背景底色过深,应该减少银染和显色时间;2)第二向电泳缓冲液配制不当,S DS含量不足,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使S DS含量达到0.1%;3)对水平S DS2PAGE而言发生了电渗现象,应该在平衡液中添加甘油和尿素.蛋白质组双向电泳分离技术是受多种因素影响的多步骤实验,只有处理好样品的裂解、蛋白质的提取、溶解和变性、杂质的去除、胶条的水化、蛋白质的等电聚焦、胶条的平衡、S DS2PAGE、凝胶的硝酸银染色显影等步骤,才有可能获得较高重现性、可比性和稳定性的22DE图谱,蛋白质组双向电泳分离技术的实验条件才算成功建立.参考文献(R eferences):[1] BERKE LM AN T om,STE NTE DT T irra.22D E lectrophoresis UsingImm obilized pH G radients Principles&M ethods[M].US A:Amersham Pharmacia Biotech,1998.37241.[2] ESTE VE2ROMERO J,SIM O2A LFONS O E,BERSCIANI F.Sam plestreaks and smears in imm obilized pH gradient gels[J].E lectrophoresis,1996,17:7042708.081 生 命 科 学 研 究 2003年。
血清样本双向电泳实验方法学研究
Fig 3 MS analysis and identification of the protein spot A： Mass spectra showing the determination of a partial peptide sequence of beta2glycoprotein 1 ； B： MASCOT search results and probability plots corresponding to beta2glycoprotein 1
为验证这种敏化步骤不会对后续的生物质谱分析产生 影响， 我们对染色后凝胶上的一个蛋白质斑点进行了质谱分 得到其多肽序列信息见 Fig 3A。 根据所得肽段信息， 通 析， 查询与之相匹 过 Mascot search engine 检索 NCBInr 数据库， 22glycoprotein 1 ） ， 配的蛋白， 结果为 β糖蛋白 1 （ beta详细 本文所述优化的硝酸银 肽段匹配情况见 Fig 3B。结果可见， 染色方法中敏化步骤的引入并不会影响到后续的生物质谱 分析， 我们应用该方法进行的其它血清蛋白质组学的研究 （ 资料未显示） 也表明， 这是一种质谱兼容的并且具有更高 灵敏度和信噪比的硝酸银染色方法 。 3 讨论 目前， 蛋白质组学技术已经广泛应用于人类疾病相关机 制的研究， 并且经常用于差异表达蛋白质的发现和生物标记 物的筛选。应用蛋白质组学方法对血清中各种蛋白质的变 可以为疾病病理机制的探讨 、 疾病特异生 化情况进行研究，
双向电泳问题
现象14：垂直拖尾
可能原因：SDS电泳缓冲液中的SDS量不足
解决办法： 使用0.1%SDS 点评： SDS的量不足一般不是因为加少了， 而是因为操作上的损失， 因为SDS所加的 量很少， 而且是很轻的粉尘， 所以在配电极液的时候不能在加完水之后才加， 容易造 成SDS浮在溶液面上难以溶解。（如果是前一天配的话， 充分搅拌后静置等泡沫消除， 第2天补足到3L）， 除了这种情况以外，平衡不完全和第二向的缓冲buffer有问题的话 也能造成垂直方向拖尾的产生。 这个时候就要注意严格控制2步平衡的时间，并且注意 擦干洗胶面的水， 如果是2向BUFFER的问题的话， 就注意看是不是每次都出现相似的 竖条纹， 如果是就必须更换新的溶液。
探讨检验科血液标本检测中的常见误差原因及预防措施
探讨检验科血液标本检测中的常见误差原因及预防措施血液标本检测是临床检验中非常重要的一环，它可以帮助医生诊断疾病、监测疾病的进展以及评估治疗效果。
在这一过程中，常常会出现各种误差，这些误差可能会影响到诊断结果的准确性和可靠性。
了解血液标本检测中的常见误差原因及预防措施对于提高检验质量非常重要。
一、常见误差原因1. 人为操作失误：在采集、储存、运送、处理和分析血液标本的各个环节，都可能受到操作员的不规范操作而引起误差。
在采血时未正确定位静脉、使用不干净的采血器具、采血后混入异物等，都会对检测结果产生影响。
2. 样本不合格：由于各种原因，包括采样过程中的错误、血样的不合适储存和运输，以及标本的污染等，会导致血液标本不合格，无法得到准确的检测结果。
3. 仪器故障：仪器本身的故障或不良品，也会导致检测结果的误差。
温度、湿度和磁场等环境条件对于某些仪器的精度会有很大的影响。
4. 试剂质量：试剂的质量问题也是造成误差的一个重要原因。
试剂若沉淀、过期或被污染，都会导致检测结果的不准确。
5. 数据处理：数据的处理过程中，由于操作员的疏忽或者不正确操作，也可能引起误差。
输入的信息错误、转录错误或者计算错误等都会影响数据的准确性。
二、预防措施1. 严格规范操作流程：在采集、处理和分析血液标本的全过程中，必须严格遵守操作规程，确保操作的规范性和准确性。
对于每一个环节，都要有相应的操作规程，并严格执行，消除人为操作失误的可能。
2. 定期维护设备仪器：对于所有使用的设备仪器，必须定期进行维护和检验，确保它们的正常运转。
还需要培训操作员正确使用设备仪器，并对设备仪器进行定期的校准和验证。
3. 样本质量控制：在采样、储存和运输过程中，必须严格控制样本的质量。
采样时必须使用清洁无菌的工具，样本必须在规定时间内进行分析等，确保样本的质量满足检测要求。
4. 试剂的质量控制：对于使用的试剂，也必须进行严格的质量控制。
采用品质可靠的试剂，并进行正确的保存和使用，严禁使用过期试剂和污染试剂，确保试剂的质量。
血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见的问题分析
血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见的问题分析电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与带电颗粒电性相反的电极迁移的现象。
电泳法可用于分离、鉴定或提纯许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等，因此电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究工作的一种常规的不可缺少的工具。
电泳法(血清醋酸纤维薄膜电泳分离及测定)作为一项基本方法，已成为医学生生物化学实验教学常规开设的实验内容，该法操作简便，快速、价廉，样品用量少，实验技术成熟，分辨能力强，没有吸附现象、效果直观，便于保存等优点，但影响电泳图谱的因素较多，学生在实验中操作不当等，均可导致实验失败而得不到理想的电泳图谱。
因此，为了达到预期的实验效果、提高学生对电泳实验的动手能力，根据我校学生血清醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）实验的实际情况，本文对CAME实验中电泳图谱常见的问题进行分析，以期为CAME实验教学提供参考。
1.出现五条以上的区带在CAME实验中，有的同学电泳实验结果看起来很“完美”，有“许多”区带——五条以上（实验结果应是五条区带，分别是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），为什么会有这种现象呢？原来出现的“许多”区带（五条以上）正是在点样中出现的，有的同学在点样过程中实施“二次”点样［１］。
CAME实验包含准备、点样、平衡、电泳、染色、漂洗、定量（该步骤没要求）等步骤，其中点样成功是获得清晰电泳图谱的关键。
在试验中，为了便于学生操作，我们应用玻片进行点样，有的同学没有擦干玻片两侧的血清；有的同学觉得点样量太少，又重复进行一次点样。
没擦干玻片两侧的血清，导致玻片两侧有两个点样面，后者进行的“二次”点样不可能在同一个位置，在进行电泳时，有的区带“跑”得快，有的“跑”得慢，区带与区带之间有的重叠，有的未重叠，因而分离出五条以上的区带（事实上，在某一区带并不是同一种蛋白质）；有的同学进行多次（两次以上）点样所得到的电泳图谱成片。
双向电泳常见问题
用户园地26双向电泳常见问题回答(一)——样品制备试剂盒篇双向电泳，作为蛋白质组学研究的经典手段，已经得到非常广泛的应用。
然而双向电泳不是一件简单的差事，太多的不确定性困挠大家，我们近期将推出系列双向电泳常见问题回答，内容涵盖样品制备，一向等电聚焦，到二向SDS电泳等，希望能给大家的实验提供参考。
众所周知，要得到良好的双向电泳结果，其技术的核心就是样品制备，这一步处理的好坏将直接影响2-D 结果。
在最初的样品制备中丢失的关键蛋白永远不能失而复得，GE Healthcare Ettan系列的样品制备试剂盒为双向电泳的样品制备提供了方便、可重复的、一致的解决方案。
以下我们总结分析了大家在使用样品制备试剂盒时常见的问题及可能原因，便于参考。
Sample Grinding kit 样品研磨试剂盒应用：样品研磨试剂盒是即用型裂解少量组织和细胞样品以提取蛋白的试剂盒Q：树脂干了，是否还能再用？A：可以，树脂是惰性的材料，没有影响Q：是否研磨树脂会破坏高分子的蛋白或DNA？是否会结合蛋白和核酸吗？A：不同于其他的研磨材料，我们的研磨树脂很不会破坏gDNA或高分子量的蛋白，也不会结合蛋白和核酸。
2-D Protein Extraction Buffer蛋白抽提缓冲液应用： 2-D蛋白抽提缓冲液为制备高质量的蛋白裂解液提供了一种便利的方法。
目前有6种蛋白抽提缓冲液可供选择，便于用户筛选最合适的缓冲液。
这6种蛋白抽提缓冲液皆源自对可靠而有效的蛋白抽提缓冲液的升级改良，以求进一步提高2D凝胶分析中的点分辨率。
Q：一个包装的抽提缓冲液可以用来处理多少样品？A：对于Trial Kit，处理10-20个样品（100mg组织），常规包装的缓冲液可以处理50-100个样品。
Vivaspin sample concentratorsVivaspin超滤浓缩管应用：Vivaspin Sample Concentrators适用于以膜超滤的方式对生物样品进行快速非变性的浓缩。
血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化
血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化张明顺; 李雪华; 兰晓霞; 栾大伟; 赵化冰; 王世鑫【期刊名称】《《医学信息》》【年(卷),期】2010(023)007【摘要】目的建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性。
方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦（IEF）为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化。
结果两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数（678±32）个,非还原烷基化蛋白质斑点数（358±26）个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰。
结论还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用。
【总页数】3页(P2310-2312)【作者】张明顺; 李雪华; 兰晓霞; 栾大伟; 赵化冰; 王世鑫【作者单位】天津武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室天津300162【正文语种】中文【相关文献】1.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 董红;王世鑫;罗来龙;栾大伟2.寻常型银屑病血清蛋白质组学研究中双向凝胶电泳-质谱技术的初步建立 [J], 刘占奎;谭升顺;于春水;樊靖华;白转丽;李俊杰3.优化并建立双向凝胶电泳初步研究糖尿病视网膜病变血清蛋白质组 [J], 李俊;贾丽丽;陆琳娜;王悦4.家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立 [J], 要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲5.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 张明顺;李雪华;兰晓霞;栾大伟;赵化冰;王世鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
双向凝胶电泳缺陷胶及其原因
［ 要 ］ 双 向凝 胶 电泳 是 蛋 白质组 学研 究 中 的关 键 技 术 之 一 ， 及 较 多 的 实验 步骤 和 试 剂 ， 出现 缺 陷胶 而 导 致 实 验 失 摘 涉 常
败 。 从 数千 张 电 泳胶 图中选 取 了 ２ 张 典 型 的 缺 陷胶 图 ， 它们 进 行 了归 类和 总结 ， 析 和 讨 论 了形 成缺 陷胶 的 多 种原 因 ， １ 对 分 提 出 了实验 改进 的方 法 和注 意 事 项。 ［ 键 词 ］ 双 向电泳 ； 陷胶 ； 白质 组 学 关 缺 蛋
根据样品的实际情况合理选择胶条窄范围ph梯度的胶条可以提高分辨率和灵敏度某些样品如结核杆菌含有较多的多糖这些多糖可以与载体两性电解质及蛋白质发生亲和作用干扰胶上蛋白点的分离并产生条纹图1g提取此类蛋白时建议采用净化试剂盒进行处理
维普资讯
生 物 技 术 通 讯 Ｌ Ｔ ＥＲ Ｎ Ｂ１ ＥＣ Ｅ Ｔ Ｓ Ｉ ０Ｔ ＨＮ０Ｌ ０ＧＹ Ｖ １１ ． ｕ． ０ ８ ｏ．９ Ｎｏ４ Ｊ １ ．２ ０
Ｎ ｔ ｎ ｌＣ ｎｅ ｆＢｏ ｅ ｉ ｌ ｎ ｌ ｉ ｅ ｉ ８ ０ Ｃ ｉａ ａｉ ａ ｅ ｔｒｏ ｉ ｄｃ ａ ｓ ，Ｂ ｉｎ １ ０ ５ ， ｈｎ ｏ ｍ ａＡ ｙｓ ｊｇ ０
［ ｂｔａｔ Ｔ ｏｄｍ ｎｉ ａ ｇｌｅ ｃ ｈ ｒ ｉ２ Ｅ ｓａ ｋｙ ｔ ｈ ｏ ｇ ｏ ｐｏｅｍｃ，ｈｗ ｖｒ ｔｏｅ ｎ ｅ ｎ ｄ— Ａ ｓ ｃ］ ｗ — ｉ ｅｓ ｎｌ ｅ １ ｔ ｏｅ ｓ Ｄ ）ｉ ｅ ｅ ｎ ｌ ｙｆｒ ｒ ｏ ｉ ｒ ｏ ｅ ｍｐ ｓ （ ｃ ｏ ｔ ｓ ｏ ｅｅ，ｉ ｆ ｎ ｅ ｄｄ ｉ ｅ ｔ
蛋 白质 组 学 的 经典 分 离 方法 ，它 利 用 蛋 白 质 等 电点 和相 对 分 子 质 量 的 不 同 而将 混 合蛋 白 质 分 开 ， 有 结 果 直 观 、 辨 率 较 高 、 具 分 技术 成 熟 等优 点 。从 ２ Ｅ图上 ， Ｄ 我们 可 获 得 细胞 、 组织 等生 物 体
双向电泳法问题回答
双向电泳法双向电泳法是一种用于分离蛋白质的方法，它可以将复杂的蛋白质样品划分成更小、更简单的部分。
通过该方法，人们可以更深入地研究蛋白质的结构、功能以及表达。
双向电泳法包括两个主要步骤：等电聚焦和SDS-PAGE。
等电聚焦利用电场的不同电势将蛋白质分离成在不同等电点停留的充电种类。
这些蛋白质将从水面通过凝胶的毛孔流动到其他场中。
最外部的电极会使凝胶中的这些蛋白质向相反方向移动，然后再进行SDS-PAGE步骤，通过蛋白质的大小来将它们分类。
尽管双向电泳法已经存在了很长时间，但它仍然是生物学研究人员中非常受欢迎的技术之一。
它可以用于各种样品，如人类组织、细胞培养物、微生物以及植物，这些样品都可以用来进行不同范围和实验室需求下的研究。
相比于其他蛋白质分析技术，双向电泳法具有许多优点。
例如：1. 高解析度。
双向电泳法可以将复杂的蛋白质混合物分离成百上千的谱带。
这使得研究人员可以在不同的谱带上针对不同的蛋白质进行研究。
2. 对小分子靶标进行优化。
一些较小的蛋白质，像激素和细胞因子，往往不能被其他分离技术轻易捕捉。
双向电泳法可以确保在凝胶中打出一个小谱带，并通过调整电泳参数来使这些小蛋白质也可以被检测到。
3. 无需标记。
使用双向电泳法，不需要先对样品进行标记，因为样品中的蛋白质被用电势和电压从样品移动到凝胶上。
虽然双向电泳法已经成为了研究蛋白质及蛋白质体系结构的主要方法，但是其也带来了许多挑战。
其中最重要的是凝胶表面的不均匀性，以及分子的截断现象。
凝胶表面的不均匀性会影响蛋白质的分离，而分子的截断现象则意味着某些蛋白质的片段可能比完整的蛋白质更容易被检测到。
总的来说，双向电泳法是对蛋白质研究进行更深入了解的重要工具。
它提供了高分辨率、高通量和无需标记的优点，仍在各种研究领域广泛应用。
随着基因和蛋白质测序技术的快速发展，相信它也将在不远的将来得到不断地改进和提升。
电泳实验报告误差分析
电泳实验报告误差分析
电泳实验是生命科学领域中常用的一种实验方法,广泛应用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的分离以及分子量的测定等方面。
在电泳实验报告中,误差分析是一个非常重要的环节,以下是几种可能出现的误差及其分析：
1. 电泳实验操作误差：操作不规范、不精确或不严谨,例如取样量、试剂添加量、电极浸泡深度、电压电流的设置不准确等等,都会导致实验结果的偏差。
2. 样品制备误差：样品的质量和浓度会直接影响电泳实验分离结果的准确性。
如果样品制备不充分,例如蛋白质没有充分溶解、DNA存在大量污染物等等,都会对实验结果造成误差。
3. 仪器误差：电泳仪器的质量、状态和精度会影响结果的准确性。
比如说,电泳板的平整度、电极的匀称度、电泳时间的分辨率、槽内温度的稳定性以及紫外灯的寿命等等,都可能对实验结果造成误差。
4. 数据处理误差：电泳实验后的数据上处理也要注意,如果处理方法不正确或处理软件使用不当,也会对实验结果造成误差。
在分析误差的同时,我们可以尽可能地采取以下措施来减小电泳实验误差：
1. 严格按照实验操作规范进行操作；
2. 样品制备时,充分震荡或混合样品,避免出现堆积等现象；
3. 选用高质量、精度高的仪器,定期维护保养电泳仪器以确保设备正常运转；
4. 在数据处理过程中,要遵循正确的数据分析方法和软件使用规则。
电泳中常犯的六大错误
正确的操作 煮沸后让样品冷却至60°C左右，然后加入碘乙酰胺。通常我们在100 μl样品中加入10 μl 20%（w/v）的碘乙酰胺水溶液，并在室温下孵育30分钟。
通过这一步，我们可以获得更为锐利的条带，并排除了一些假象，如两条带、其他的高 分子量条带、点样孔中的沉淀，以及凝胶上的线。
4. SDS电泳中运行缓冲液的滴定 到目前为止，大部分单向和双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于Lämmli的不连 续缓冲液系统中开展的[1]。其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分 辨率和重复性不高。在不连续的“Lämmli”系统中，积层胶和分离胶缓冲液是由指定pH 值的Tris和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含SDS，运行缓冲液中则包含SDS、 Tris和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓 慢进入聚丙烯酰胺凝胶，并实现积层效应，产生非常锐利和清晰可辨的区带。
参考文献 [2] Rabilloud, T., Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in twodimensional electrophoresis. Electrophoresis 1998, 19, 758 –760.
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血清免疫固定电泳常见问题的分析
血清免疫固定电泳常见问题的分析作者：王艳生姚宏静王立成林筠黄琪朱国庆来源：《中国实用医药》2014年第24期【摘要】免疫固定电泳最长用于M蛋白相关疾病的鉴定。
通过对日常工作中遇到的血清免疫固定电泳常见问题进行了认真的分析，针对相应问题提出了解决办法，以便提高血清免疫固定电泳的检测水平。
【关键词】免疫固定电泳；M蛋白；β巯基乙醇M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖分泌的大量结构均一的，无抗体活性和无免疫活性免疫球蛋白或其肽链亚单位，临床上称之为单克隆免疫球蛋白（monoclonal proteins， M蛋白）[1]。
免疫固定电泳技术是结合区带电泳的分离作用和单克隆抗体的特异性及高敏感性来检测样本中的单克隆免疫球蛋白[2]。
此技术在恶性单克隆免疫球蛋白血症的诊断、分型、疗效随访和意义未名单克隆免疫球蛋白血症转化的病程监测都有重要意义。
1 血清免疫固定电泳常见问题①抗原抗体比例不合适免疫增殖性疾病中会出现某种或几种免疫球蛋白异常增高，高浓的球蛋白使血清免疫固定电泳某个球蛋白区出现有着色较深的浓密条带或出现边缘着色而中心区域蛋白不着色的“口型”。
着色较深的浓密条带的出现会使判读很困难，是否有单克隆条带隐匿在其中不容易判读；还是此样本为一个多克隆免疫球蛋白病无法区分。
“口型”容易出现假阴性的结果。
② IgM型聚合度高，非特异性沉淀影响判读，在β或γ区可见致密而均质条带。
第一种情况凝胶的点样处和整个泳道出现沉淀。
另一种情况是出现两条单克隆带。
③IgA型谱带宽而弥散， IgA型较其他类型的单克隆比较谱带宽而弥散不易判读。
④血清免疫固定只有重链单克隆成分，初诊时血清免疫固定只有重链单克隆成分勿轻易诊断为重链病。
⑤血清免疫固定只有轻链单克隆成分。
⑥血清免疫固定电泳阴性的浆细胞病，临床上典型的浆细胞病特征及病理损伤，但血清免疫固定电泳为阴性。
⑦血清免疫固定的血清蛋白电泳条带假的狭区带易与M蛋白混淆。
以上讨论了对血清免疫固定电泳技术在日常工作中常见问题，现就其问题逐一分析和解决。
血清脂蛋白电泳实验失败总结
血清脂蛋白电泳实验失败总结1. 电泳图谱不齐或分离不良这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。
点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。
首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。
然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。
点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。
点样要力求做到均匀迅速，有报道，在实践中把加样器干沾血清，改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清，这样加样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。
2. 电泳图谱出现条痕问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。
因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。
在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。
控制电压100~110 V，电流0.5~0.6 ma/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带展开3.5~4 cm 即可（另加一条溴酚蓝预染血清，同样操作，指示区带展开的距离）。
3. 区带拖尾或区带过于紧密缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象，离子强度>0.075则区带过于紧密。
此时需要检查更换缓冲液。
常规操作一般使用连续电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6，离子强度0.06。
电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。
王祖植通过实验说明，离子强度愈低，区带展开愈长，电泳速度愈快。
电泳区带展开的距离也跟薄膜数量有关。
在教学实验中，经常发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰的现象。
在仪器输出电压相同的情况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。
双向凝胶电泳缺陷胶及其原因
双向凝胶电泳缺陷胶及其原因双向凝胶电泳是常用的分离和检测DNA分子的方法之一。
在这种电泳中，DNA样品在两种不同的凝胶中移动，以实现更高的分辨率和精度。
然而，双向凝胶电泳中有时会出现缺陷胶的现象，这会导致分离和检测结果的错误和不可靠性。
本文将探讨双向凝胶电泳缺陷胶的原因及解决方法。
双向凝胶电泳简介双向凝胶电泳通常使用两个跑道进行分离，从而获得更高分辨率的DNA带。
第一个泳道使用富含琼脂的缓冲液进行分离，而第二个泳道使用聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
这种双向分离的过程可以消除非特异性带和不受限制的DNA扩增产物。
在双向凝胶电泳过程中，常常会出现缺陷胶的问题，这可能是由各种因素引起的。
以下是一些可能导致缺陷胶的原因。
原因一：琼脂注入时需要慢慢滴入在凝胶制备过程中，琼脂通常需要按比例加入缓冲液中并充分溶解。
然而，大量的琼脂过快地加入到溶液中，可能导致不均匀的凝胶达到缺陷胶的结果。
因此，在制备琼脂凝胶时需要细心慢慢添加琼脂。
原因二：凝胶中存在气泡凝胶中存在气泡也是导致双向凝胶电泳缺陷胶的原因之一。
当凝胶中存在气泡，会在电泳过程中产生电场差异，从而导致DNA分离不均匀。
因此，在凝胶制备过程中需要尽可能避免气泡的产生。
原因三：电场分布不均匀电场也是影响双向凝胶电泳的一个重要因素。
如果电场分布不均匀，将导致样品在凝胶上移动的不均匀。
因此，在进行电泳过程中需要确保电场分布均匀。
原因四：凝胶制备温度不稳定凝胶制备过程的温度也会影响电泳分离的结果。
如果温度不稳定，可能会导致凝胶中的缺陷和不均匀。
为了最大程度地避免这种情况发生，精确地控制凝胶的制备温度是非常重要的。
解决方法为了避免双向凝胶电泳中出现缺陷胶，可以采取以下措施：1.凝胶制备过程中注意细心，慢慢添加琼脂，并避免气泡产生。
2.确保电场分布均匀，可以通过合适的电场调节和减少跑道的长度和宽度来实现。
3.准确地控制凝胶制备温度，避免温度变化过大。
另外，排除缺陷胶的其他原因也是很重要的，这包括检查标记物或样品浓度是否正确、注射样品时是否加入了过多的物质、电泳时间是否恰当等等。
双向凝胶电泳在临床血浆蛋白质组学研究中的技术难点和解决方法
２．２ 去除高丰度蛋 白
样 品 的 制备的另一重要技术就是去除高丰度蛋 白。 目
前可采用染料、免疫等多种层析方法去除高丰度蛋白〔１７１
以前广泛采用 ＣｉｂａｃｒｏｎＢ ｌｕｅ染料亲和层析去除血浆或血清
中蛋白［１８１，目前已有免疫亲和层析去除白蛋白［‘，〕。利用蛋
白Ａ，Ｇ 免疫亲和层析柱吸附去除 ＩｇＧ免疫球蛋白［２０１
询〔｀０１ｏ Ｓ ＤＳ虽然可促进蛋白质的可溶性，但是一种强去污
剂 ，可以使蛋白充分变性 。ＳＤＳ的负离子性可影 响样品的 等电点 ，因此在等电聚焦前用两性离子或非离子去污剂将 样品中 ＳＤＳ应稀释０．２５％ （质量浓度）以下，降低副作用。
Ｂａｎ ｇ等 比 较了血浆的三氯乙酸、丙酮、氯仿／甲醇、硫
酸钱和超滤的方法。三氯 乙酸、丙酮 、超滤等可更有效 的 收集蛋 白和去盐 ，硫酸馁能有效 的去处 白蛋 白，但沉淀法
３ 展望
虽然 双 向 凝胶 电泳技术仍有很多局限性 ，在 自动化、 重复性 、灵敏度等还有待于改进 ，但仍在不断的改进和完 善 ，比如 目前双向凝胶电泳的定量分析还可采用荧光着多 重染料着色来 比较不 同标本 图谱 的蛋 白差异性 表达 。以及
２ 血浆双 向凝胶 电泳在样 品制备和分离方
面 常 用 方法
２．１ 去盐、去脂
第 ４期
双向凝胶电泳在临床血浆蛋 白质组学研究中的技术难点和解决方法
４３ ５
去盐 、去 脂 ， 增加蛋 白的溶解性。样品的制备主要包 括减少杂质影响、减少蛋 白酶的消化作用、增加蛋 白的溶 解性。血浆经过简单 的裂解液稀释后 ，即可上样 电泳。但 电泳前去盐、去脂 ，血浆蛋 白的完全溶解和解聚有助于获 得良好 电泳 图谱。 目前传统 的方法是在血浆样 品 中加人 １０％的十二烷基硫酸钠 （ＳＤＳ）和２．３％二硫苏糖醇 （ＤＴ）， 然后 ９５℃加热 ５ｍｉｎ。再行双向凝胶 电泳 ，可明显改善 图 谱 ，增加蛋白的表达量。 目前采用该方法的二维凝胶 电泳 图谱已建成数据库 ，在 ｅＳＷＩＳＳ－２Ｄ ＰＡＧＥ网上可 以进行查
血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验常见的问题及对策
“醋酸纤维素薄膜电泳”是医学研究及临床检验的常规技术，也是生物类与医学类专业学生必须掌握的一项技术。
我校在生化及生化检验教学中开设血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳实验，由于本实验主要由手工操作，并且影响因素较多，实验时间也长，往往花费了很长时间，但最终结果却并不理想，这在一定程度上挫伤了学生学习的积极性。
笔者结合多年的实践教学经验，对学生实验中常见的问题进行了分析、归纳，并提出了相应的解决办法，从而大大提高了实验课的教学效果，现报告如下。
1常见问题1.1血清紧缺本实验由于是盖玻片蘸取点样，血清用量相对较多，尤其近年来随着学校的发展，招生规模不断扩大，学生人数不断增多，以致实验成本较高，但教学经费投入十分有限，故实验用血清较紧缺。
1.2点样技术不熟练学生对点样技术掌握不好，结果或因点样量太大而使组分谱峰重叠[1]；或因蘸取血清量少、点样时间短，血清没有渗入薄膜；或因蘸取血清量过少而出现电泳图谱染色浅，导致各组分显示不清，甚至只能观察到白蛋白区带，其余区带显示不清；或因蘸取血清不均匀导致区带不整齐，或者有拖尾现象。
1.3实验条件选择不当由于不同电泳仪、不同薄膜条数所需电压、电流不同，时间也不固定，要灵活掌握（一般用电压10~15V/cm膜长，或90～160Ⅴ/cm膜长，若用电流则按照0.4~0.6mA/cm膜宽进行换算。
夏季通电40～50分钟，冬季通电60分钟左右[2-4]），故学生在实验中可能因选择的电压低、电流小、时间短而出现图谱距点样线近、区带集中，各组分分离不佳（常见α2与β区带），尤其是在点样量过多时，只能观察到四条区带现象；也可能因为选择的电压高、电流大、时间长而使蛋白迁移速度过快，常出现白蛋白迁移至靠近薄膜一端而被盐桥吸附的现象，且图谱位置也不居薄膜中段。
1.4薄膜的透明过程掌握不好由于本实验费时较长，学生实验一般只进行到染色之后，观察到结果即可。
但部分学生的结果较理想时，他们往往要求保存图谱，这就需要透明处理。
二维电泳常见问题及其解答
二维电泳常见问题及其解答摘要：二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.本文总结了二维电泳中常见的14个问题并对其解答.二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.第一向等电聚焦电泳：根据蛋白的等电点分离蛋白质;第二向SDS-PAGE电泳：根据蛋白分子量的大小分离蛋白质.本文总结了二维电泳中常见的14个问题及其解答.1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑2D的一向吗?一般情况下是可以的.但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完1D和2D胶后,会有很多横向条纹.所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳.2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面?这是因为BioRad的电泳槽有个盖子.为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条.由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面.如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的.为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量(80%满)的矿物油.3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50μA/胶)?电流的平方和功率成正比.电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加.当温度超过30摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响.4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高?刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子).所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的.由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压.当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的pH条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的pH区域移动.5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动?蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的.溴酚蓝也是pH指示剂,当它移动到酸性区时(pH4 ),颜色会变成黄色.溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前.6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值?当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值.7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低?当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值,从而变成中性分子.这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小.8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生?等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的pI值区域,而成为中心分子.这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气.9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么?硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性.双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性.当蛋白移动到相应的pH值后,就变成了中性分子.而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾.而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集.10. 怎样估计2D胶上蛋白质点的分子量和pI值?可以用 BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准.也可以用体系内已知蛋白来做比对.11. 为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?横的脱尾可能是：1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高.竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好.12. 什么成分会影响2D胶的效果?核酸,盐,去垢剂等等.13. 2D胶的上样量应该在什么范围?上样量和样品有关.样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到.一般的全细胞裂解体系,上样量大概在100微克(银染)到500微克(考染)之间.14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩?蛋白质的浓缩有很多方法.大致有超滤法,沉淀法和透析法.超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失.它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附).另外超滤对样品的要求比较高.甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果.沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好.缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失).沉淀法中,又以TCA法最为普遍使用.使用TCA法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的TCA和其他沉淀下来的杂质.透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难. 透析法可以和超滤法联用.先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤.注意事项：要想获得比较好的电泳结果,蛋白样品的制备是很关键的一个步骤,蛋白样品中存在杂质会影响等点聚焦,一定要采取有针对性的办法去除相应的杂质例如：盐和带电小分子、核酸等.。
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血清双向电泳研究中的失误分析及解决
*
向明钧,唐 云,周小舟,罗 飞
(赣南医学院,江西 赣州 341000)
中图分类号:Q -33 文献标志码:B 文章编号:1001-5779(2011)02-0299-02 双向凝胶电泳是蛋白质组学的一种基本技术,它以固相p H 梯度等电聚焦进行第一向电泳,再用SDS PAGE (sodi u m dodecy l s u lfate polyacry la m i de ge l electropheres i s)进行第二向电泳[1-2]。
由于其稳定性高、重复性好等特点,故它在血清样品研究中有独特的优点。
但该方法操作步骤多,包括样品的处理、等电聚焦、胶条的平衡及转移、SDS PAGE 电泳及凝胶的染色等,同时每个步骤的操作要求较高。
而血清样品中除了含有丰富的蛋白质外,还含有较多其它的物质如较高浓度的盐类和脂类、氨基酸、酚类和糖类以及可能存在的核酸等,并且蛋白质的种类多,含量差异大,高丰度蛋白质的浓度与低丰度蛋白质的浓度比值可达109倍[2],这就要求应用双向电泳研究血清样品时要采用相应的方法尽可能去除样品中的非蛋白杂质,同时还要考虑除去高丰度蛋白质。
整个研究过程影响因素众多,其中任何一个因素没控制好都将会导致整个实验的失败,而结果却只能在整个实验结束后才能确定,这样就耗费了大量的时间,浪费了大量的试剂,而且导致实验失败的因素往往很难确定。
本文以我们研究中的一些失误为例,分析探讨了其失误的可能原因及相应的解决办法,总结了实验中应该注意的问题,可为血清双向电泳实验技术体系的建立及条件的优化提供参考。
1
操作失误图谱
图1 蛋白点少,点没分开,出现横条纹,胶的左上部
和右中部出现气泡图2 凝胶有污渍,
蛋白点少
图3 出现纵向较大的团块,蛋白点少 图4 蛋白聚集成块,
胶的右边蛋白少
图5 蛋白点没有分开,凝胶破裂
图6 出现较粗的横条纹,
较多纵横条纹
图7 大量的蛋白停留在胶的上半部,蛋白点大,拖尾 图8 出现较大一团横斑,一小团块
299 第31卷第2期 赣 南 医 学 院 学 报 Vol .31NO .22011年4月 J OURNAL OF GANNAN M EDI CAL UN I V ERSI TY APR .2011
*基金项目:赣南医学院科学研究重点项目(2008100)
2 原因分析及解决的办法[2-5]
2.1 图1: 进入IPG胶条中的样品太少,样品裂解和水化不充分,应充分裂解和水化样品,充分泡涨胶条使蛋白尽量完全进入胶条。
平衡时间过长,导致损失大量的蛋白,应将平衡时间控制在10~15m i n;蛋白质第一向转移到第二向时不完全,应该在第二向电泳开始时按15mA/ge,l30m in再采用30mA/ge,l至溴酚蓝迁移至垂直胶的底部为止; 点没分开的原因:等电聚焦不充分,应调整聚焦程序达到最佳聚焦效果。
出现横条纹的原因:血清样品中的盐浓度较高,应尽量去掉样品中盐,可选用BI ORAD公司的A urum TM Seru m P ro teinM i n i k it。
胶的左上部和右中部出现气泡的原因:图像采集时胶下面有气泡。
应在图像采集时赶走胶下面的气泡。
2.2 图2: 实验过程中所戴的手套不洁净,手印留凝胶上,应使用干净的塑胶手套。
染色过程所用试剂含有杂质,应该使用高纯度的试剂。
2.3 图3:样品中未去掉的杂质使蛋白质裂解水化效果差,聚焦效果差,应充分去掉杂质并调整聚焦程序;平衡液中DTT量不足,应加入适量DTT;封口胶杂质较多,应配制新的封口胶(用进口试剂)。
2.4 图4: 胶条没有均匀溶胀限制了蛋白的运动,应将胶条充分均匀溶胀。
聚焦时间过短,应调整聚焦程序,延长聚焦时间。
第一向和第二向之间的平衡时间过长,导致蛋白损耗过多,应将胶条每次平衡时间控制在15~20m i n之内。
2.5 图5: 应调整聚焦程序。
胶易碎,所以在操作过程中要小心操作,避免胶的破裂。
2.6 图6: 出现很粗的横条纹的原因:蛋白疏水性强,在裂解液中没有充分溶解。
应改进裂解液的配方,适当增加去污剂浓度,采用兼性去污剂与非离子型去污剂结合使用以提高蛋白质的溶解效率。
蛋白裂解和水化不充分,聚焦效果差,应调整水化液配方加强裂解和水化,并调整聚焦程序。
有纵条纹的原因:平衡不充分,蛋白质没有被十二烷基磺酸钠(sodiu m dodecy l sulfa te,SDS)充分包裹。
调整平衡液中二硫苏糖醇(DL d it h i o t hre ito,l DTT)的用量,充分破坏一向电泳后蛋白质的空间构象,以便SDS充分结合蛋白质。
第二向SDS PAGE(sodiu m dodecy l s u lfate polyacry la m i de gel e l ec trophe resis,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)胶中有杂质,应采用进口试剂或胶灌制前过滤除去杂质。
第二向的玻璃板未清洗干净,应在灌胶前检查玻璃板是否清洁。
样品预处理时残留的试剂影响了裂解液和水化液的作用,应冻干处理后的样品以去掉残留的试剂。
2.7 图七: 平衡不充分,应调整DTT、I AA的用量及平衡时间。
样品蛋白质上样量大,应适当减少上样量。
2.8 图八:样品水化效果差,聚焦效果不好。
应充分去掉样品中杂质,加强样品水化,调整聚焦程序。
3
实验条件优化后的图谱 图9 乳腺癌患者血清 图10 健康人血清
通过优化双向电泳中蛋白质的水化、等点聚焦、胶条的平衡、凝胶的染色等关键步骤,建立了稳定性好、重复性高的双向电泳技术体系,得到了重复性高、稳定性好的凝胶图谱[6]。
双向凝胶电泳是一个实验步骤多、影响因素多、操作要求高的实验,要得到重复性好、稳定性高的双向凝胶电泳图像就必须做好样品的裂解、蛋白质的提取、样品的去杂、蛋白质的裂解和水化、胶条的泡涨、蛋白质等电聚胶、胶条的平衡及转移、第二向SDS PAGE电泳、凝胶的染色等步骤。
本文分析了研究中出现的一些失误图谱,探讨了失误的可能原因并给出了相应的解决办法,可为血清双向电泳实验技术的建立及条件的优化提供参考。
参考文献:
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[3] BIO-RA D公司的双向电泳培训资料.
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[6] 向明钧,叶金花,余敏,等.血清样本双向电泳操作条件
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(收稿日期:2010-04-28)
300
赣南医学院学报 2011年。