荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究
CFSE原理和CFSE配制
细胞增殖检测：CFSE原理和CFSE配制分类：资料整理2011-08-08 10:08 阅读(27)评论(0)一、原理荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当CFSE 以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。
因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。
这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
二、CFSE配制用DMSO溶解成5 mmol/L的储存液，于- 20 ℃避光保存。
使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。
CFSE试剂盒内有一小瓶CFSE（A 试剂）标明500ug ，另有一小瓶DMSO（B试剂），500ugCFSE溶解于180ulDMSO 即是5mMstock solution。
三、CFSE标记细胞制作细胞悬液，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10 min，用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min。
CFSE增殖实验
CFSE增殖实验-江英骙PBMC增殖染色分2天第一天1.分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁；2.CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。
第二天1.收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。
先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）；2.CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管）3.细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）；4.37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）；5.直接离心，1800rpm，10min；6.加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min；7.离心，1800rpm，10min；8.再洗一遍，重复步骤79.R10+双抗重悬，计数；10.调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul11.每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热）12.放入大细胞房培养7天，收细胞；13.可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
1. 1 主要试剂和仪器 CFSE 购自 Molecular Probes 公司; 植物血凝素( PHA) 购自 Sigma 公司; CD3 mAb ( OK3) 为美国宾夕法尼亚大学 Carding 博士惠赠; 结 核杆 菌低 分 子 多 肽 抗原 ( Mtb Ag ) 由 本 室 根 据 文 献[ 3, 4] 自制。RPMI 1640 培养液( GIBCO 公司) 补充 2 mmol/ L L 谷氨酰胺、50 mol/ L 二巯基乙醇( 2 ME) 、 1 mmol/ L丙酮酸钠、50 mg/ L 庆大霉 素 和 100 mL/ L 新生 小 牛血 清( NBS, 杭 州 四季 青公 司) 后 为 完 全
[ Key words] Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Proliferation; T cell subpopulations; Flow cytometry
检测淋巴细胞激活后的增殖反应是免疫学实验 研究中的基本技术, 传统方法有同位素( 3H TdR) 掺 入法和形态学方法, 也有用 MTT 法, 以及 BrdU 标记 法等技术。这些检测方法均不能反映不同淋巴细胞 亚群的增殖状态。1990 年, Weston 等用活细胞染料 羧基 荧光 素 乙 酰乙 酸 琥 珀酰 亚 胺 酯 ( Carboxyfluo rescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE ) , 也 常 简称为 CFSE, 标记淋巴细胞研究迁移活动[ 1] 。随后 Lyons 等[ 2] 用其检测淋巴细胞的增殖反应。CFSE 是 非极性分子, 可自由扩散进入细胞, 在胞内酯酶水解 后产生具有荧光特性的 CFSE, 并与胞内蛋白的赖氨 酸等胺基发生不可逆偶联, 形成稳定的大分子荧光
FlowJo分析细胞增殖
注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。
CFSE
货号：C375 CAS NO：150347-59-4活细胞染色-Cellstain- CFSE化学名：5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacetylfluorescein 别名：CFSE结构式：分子式：C29H19NO11分子量：557.46价格：性质：外观：白色或浅黄色粉末纯度：>95.0% (HPLC)产品描述CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。
CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。
因此，CFSE 常被用来做活细胞检测试验和用荧光电镜观察细胞长期活动的试验。
CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm。
染色过程：1. 用DMSO制备1mM 的CFSE溶液。
用PBS或适当的缓冲液将其稀释成10-50 μM的CFSE溶液。
2. 将1/10细胞培养基体积的CFSE溶液加入到细胞培养基中。
3. 在37℃培养细胞15-30分钟。
4. 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。
5. 用490 nm激发波长，530 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
常见问题:储存条件：-20℃参考文献：细胞增殖检测：CFSE点击次数：1195 作者：佚名发表于：2008-07-28 12:43转载请注明来自丁香园来源：丁香园一、原理荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacet ate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。
cfse计算公式
cfse计算公式CFSE（Compound Fluorescence Spectral Energy）是一种用于测量细胞活性的技术，它可以用来评估细胞的增殖状态。
CFSE是一种染料，它可以结合到细胞膜上，并且可以被细胞内的酶分解，从而产生荧光信号。
CFSE的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。
CFSE技术可以用来评估细胞的增殖状态，因为它可以检测细胞分裂前后的荧光强度变化。
CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。
此外，CFSE技术可以用来检测细胞的活性，从而更好地了解细胞的增殖状态。
CFSE技术可以用来评估细胞的增殖状态，它可以检测细胞分裂前后的荧光强度变化，从而更好地了解细胞的增殖状态。
CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。
CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。
CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，它可以用来评估细胞的增殖状态，从而更好地了解细胞的增殖状态。
CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。
CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。
总之，CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，它可以用来评估细胞的增殖状态，从而更好地了解细胞的增殖状态。
CFSE技术的计算公式是：CFSE = (F1-F2)/F1，其中F1是细胞分裂前的荧光强度，F2是细胞分裂后的荧光强度。
CFSE技术的优点是它可以检测细胞的增殖状态，而不会影响细胞的生长和发育。
因此，CFSE技术是一种有效的细胞活性检测技术，可以用来评估细胞的增殖状态。
CFSE增殖实验
CFSE增殖实验-江英骙PBMC增殖染色分2天第一天1.分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁；2.CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。
第二天1.收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。
先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）；2.CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管）3.细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）；4.37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）；5.直接离心，1800rpm，10min；6.加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min；7.离心，1800rpm，10min；8.再洗一遍，重复步骤79.R10+双抗重悬，计数；10.调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul11.每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热）12.放入大细胞房培养7天，收细胞；13.可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。
荧光染料CFDA
单位代码10183 学号2003731001 吉林大学博士学位论文段秀梅分类号R392.12 密级 公开荧光染料CFDA-SE标记在检测淋巴细胞增殖及细胞介导的细胞毒活性中的应用研究Study on fluorescence dye CFDA-SE labeling for assay of lymphocytes proliferation and cell-mediated cytotoxicity 段秀梅指导教师姓名 谭岩职称 教授单位 吉林大学第一医院专业名称 免疫学论文答辩日期 授予学位日期 答辩委员会主席 论文评阅人 2007年4月长春未经本论文作者的书面授权依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用但纯学术性使用不在此限。
否则应承担侵权的法律责任。
吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明 所呈交的博士学位论文 是本人在指导教师的指导下 独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外 本文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式表明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名 日期 年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院 本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容 愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊 光盘版 电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿 希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版 并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用 同意按章程规定享受相关权益。
论文级别 □硕士■博士学科专业 免疫学论文题目 作者签名指导老师签名 2007年月日作者联系地址 邮编 吉林大学第一医院中心实验室130021 作者联系电话 130****0990 0431-********提要羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯 CFDA-SE 是一种膜通透性的荧光素染料 CFDA-SE标记细胞后转变成CFSE形式 随细胞分裂被平均分配到两个子代细胞中其荧光强度是亲代细胞的一半。
CFSE淋巴细胞染色
淋巴细胞CFSE染色
CFSE（carboxy fluorescein diacetate, succinimidyl ester 羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯）被动扩散进入细胞，其本身是无色无荧光的，被细胞内的酯酶分解后产生高强度的荧光。
该荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。
未结合的试剂与副产物扩散至胞外基质中，被洗去。
传代或胎胚分裂分析，CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，细胞分裂时被平均分配至子代细胞，荧光强度降到母代细胞的一半。
适合于胞内示踪，在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中，并不会被转移至邻近的细胞。
在小鼠淋巴细胞迁移实验中，CFSE注射进入小鼠体内后，标记的淋巴细胞的检测可长达8周。
肝内注射荧光显微镜定位检测可长达20天。
使用浓度：一般说来，长时间染色（超过3天）或快速分裂为5~10uM,活力分析等短时间分析为0.5~5uM，荧光显微镜为25uM.优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
单细胞悬液（T）的CFSE染色步骤：
1.重悬细胞于0.1% FBS 的1640培养基，浓度为1×106/ml；
2.每ml细胞中加入2ul CFSE贮存液后再加入2ml稀释液；
3.37℃孵育30min；
4.加入5倍体积的冷培养基，终止染色；
5.37℃孵育继续孵育5min（有说冰上孵育5min）；
6.1500rpm，5min离心沉淀细胞；
7.新鲜培养基洗3次；
8.细胞置于新鲜的1640培养基中，培养。
9.收集细胞，进行其他染色；
10.流式488nm激发光检测。
利用荧光染料CFSE分选衰老细胞的探究
［文章编号］㊀１６７４⁃８６０３（２０２０）０２⁃００８１⁃０５利用荧光染料ＣＦＳＥ分选衰老细胞的探究胡钦朝，姜徕博，彭建敏，吴桐，程斌，夏娟∗（中山大学光华口腔医学院㊃附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室，广东广州５１００５５）［摘要］㊀目的：探究利用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（ＣＦＳＥ）进行衰老细胞分选的可行性㊂方法：利用ＣＤＫ４／６抑制剂ＬＹ２８３５２１９诱导人口腔鳞癌细胞Ｃａｌ２７衰老，在ＬＹ２８３５２１９撤药后立即进行ＣＦＳＥ染色，避光培养，并在撤药后第０㊁２㊁４㊁６㊁８天进行衰老相关β⁃半乳糖苷酶（ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ）染色㊂通过流式细胞仪分选ＣＦＳＥ荧光强度高的细胞，进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色㊂结果：ＣＦＳＥ荧光标记的细胞与ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色阳性的细胞相一致㊂撤药后第４㊁６天利用ＣＦＳＥ荧光进行流式分选，ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ组的细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率显著高于未分选组（Ｐ＜０．０５）㊂结论：利用ＣＦＳＥ分选衰老细胞具有可行性，可获得活的衰老细胞㊂［关键词］㊀衰老细胞；羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯；衰老相关β⁃半乳糖苷酶［中图分类号］㊀Ｒ７８０．２㊀㊀［文献标识码］㊀Ａ㊀㊀［ｄｏｉ］㊀１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４⁃８６０３．２０２０．０２．００４ＳｔｕｄｙｏｎｓｏｒｔｉｎｇｓｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓｂｙＣＦＳＥＨＵＱｉｎｃｈａｏ，ＪＩＡＮＧＬａｉｂｏ，ＰＥＮＧＪｉａｎｍｉｎ，ＷＵＴｏｎｇ，ＣＨＥＮＧＢｉｎ，ＸＩＡＪｕａｎ．（ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｕｎＹａｔ⁃ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００５５，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＸＩＡＪｕａｎ，Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｊｕａｎ＠ｍａｉｌ．ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｕｓｉｎｇｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌａｍｉｎｏｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）ｔｏｓｏｒｔｓｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＳｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅＣＤＫ４／６ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＬＹ２８３５２１９ｏｎＣａｌ２７．ＣＦＳＥｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅ⁃ｌｙａｆｔｅｒｗｉｔｈｄｒａｗａｌｏｆＬＹ２８３５２１９，ａｎｄｔｈｅｎｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｄａｒｋ．ＴｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＳＡ⁃β⁃ｇａｌｏｎｄａｙｓ０，２，４，６ａｎｄ８ａｆｔｅｒｗｉｔｈｄｒａｗａｌ．ＴｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｈｉｇｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆＣＦＳＥｗｅｒｅｓｏｒｔｅｄｂｙａｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒａｔａｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ４８８ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣｅｌｌｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＣＦＳＥｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈＳＡ⁃β⁃ｇａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｒａｔｅｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｏｆＳＡ⁃β⁃ｇａｌｉｎｔｈｅＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈｇｒｏｕｐｓｏｒｔｅｄｂｙＣＦＳＥｏｎｔｈｅ４ｔｈａｎｄ６ｔｈｄａｙｓａｆｔｅｒｗｉｔｈｄｒａｗａｌｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｕｎｓｏｒｔｅｄｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎ⁃ｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＵｓｉｎｇＣＦＳＥｔｏｓｏｒｔｓｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓｉｓｆｅａｓｉｂｌｅ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｏｂｔａｉｎｌｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］㊀ｓｅｎｅｓｃｅｎｔｃｅｌｌ；ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌａｍｉｎｏｅｓｔｅ；ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄβ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基金项目：国家自然科学基金（８１６３００２５，８１６７１０００，８１８７０７６９）；广东省自然科学基金（２０１７Ａ０３０３１１０３３）；广州市科技计划（２０１７０４０２００６３）∗通信作者：夏娟，Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｊｕａｎ＠ｍａｉｌ．ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ㊀㊀ 细胞衰老是细胞应激所导致的一种不可逆的生长停滞现象，其最显著的特征是细胞周期阻滞，即细胞失去了对有丝分裂原的反应能力和合成ＤＮＡ的能力，不能进入Ｓ期，停止增殖［１］㊂衰老细胞虽然失去了增殖能力，但仍然保持着高度活跃的代谢状态，分泌一系列的细胞因子，包括促炎因子㊁趋化因子㊁生长因子和蛋白酶类等，这被称为衰老相关分泌表型（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ＳＡＳＰ），是衰老细胞最重要的特征之一［２⁃５］㊂在肿瘤治疗中，传统放疗㊁化疗除了诱导肿瘤细胞凋亡之外，也在不同程度上诱导细胞衰老的产生，即产生了治疗介导性衰老（ｔｈｅｒａｐｙ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＴＩＳ）㊂衰老细胞通过分泌ＳＡＳＰ，在肿瘤治疗中发挥双刃剑的作用［６⁃７］㊂一方面，衰老细胞通过自分泌或旁分泌ＳＡＳＰ因子维持和／或促进衰老细胞的产生，发挥持续抗肿瘤作用，同时激活机体的免疫监控和免疫清除能力，促进免疫系统对肿瘤细胞的清除㊂但另一方面，某些ＳＡＳＰ因子可促进肿瘤细胞增殖㊁迁移侵袭㊁干性增强㊁血管生成等恶性表型，发挥促肿瘤作用㊂由此可见，深入探究衰老细胞在肿瘤治疗中的作用具有重要的临床意义，有望为抗肿瘤治疗提供新的思路㊂目前，衰老细胞的检测标志物主要有β⁃半乳糖苷酶（β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，β⁃ｇａｌ）㊁端粒和端粒酶㊁衰老相关的异染色质灶（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎｆｏｃｉ，ＳＡＨＦ）㊁ＳＡＳＰ㊁ｐ５３及ｐ１６通路等［８⁃９］㊂但由于尚未发现衰老细胞的特异性表面标志物，目前尚无公认的分选活的衰老细胞的方法，也使得对衰老细胞的研究受到一定程度的限制㊂因此，探索一种高效率㊁高特异性的活的衰老细胞分选方法迫在眉睫㊂羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕ⁃ｏｒｅｓｃｅｉｎｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌａｍｉｎｏｅｓｔｅｒ，ＣＦＳＥ），是一种可对活细胞进行标记的荧光染料，其基本原理为ＣＦＳＥ能够穿透活细胞的细胞膜与胞内蛋白结合，水解后释放绿色荧光㊂ＣＦＳＥ荧光标记不会影响细胞活性及增殖能力㊂当细胞有丝分裂时，亲代细胞的ＣＦＳＥ被均分到两个子代细胞中，ＣＦＳＥ荧光强度会随着细胞的增殖而逐级递减㊂因此，由于衰老细胞失去了增殖能力，被ＣＦＳＥ标记的衰老细胞其荧光强度不会发生改变，而正常细胞随着分裂增殖，荧光强度会逐级递减［１０⁃１２］㊂因此，存在利用ＣＦＳＥ荧光分选衰老细胞的可能性㊂本研究旨在探讨和验证利用ＣＦＳＥ荧光分选衰老细胞的可行性，以期为衰老细胞在肿瘤治疗过程中的作用与机制研究提供高效可行的分选方法㊂１㊀材料与方法１．１㊀细胞和主要试剂人口腔鳞癌细胞系Ｃａｌ２７来源于美国菌种保藏中心（ＡＴＣＣ）㊂细胞周期蛋白依赖性激酶（ｃｙｃｌｉｎ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ，ＣＤＫ）４／６抑制剂ＬＹ２８３５２１９购自美国ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ公司，细胞衰老β⁃半乳糖苷酶（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄβ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ）染色试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，Ｃｅｌｌ⁃ＴｒａｃｅＴＭＣＳＦＥ试剂盒购自美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司㊂ｐ１６㊁ｐ２１㊁ＧＡＰＤＨ抗体及ＨＲＰ标记羊抗鼠／兔二抗购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司㊂１．２㊀实验方法１．２．１㊀细胞培养㊀于３７ħ㊁５％ＣＯ２条件下，应用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基培养Ｃａｌ２７细胞，根据生长状况每２ ３ｄ换液１次，当细胞长至７０％ ８０％时传代，取处于对数生长期状态良好的细胞用于实验㊂１．２．２㊀细胞衰老诱导㊀ＬＹ２８３５２１９是目前被美国食品及药物管理局批准用于临床应用的３个ＣＤＫ４／６抑制剂之一，本研究利用ＬＹ２８３５２１９作为诱导细胞衰老的手段㊂将Ｃａｌ２７细胞分为实验组和对照组，取生长状态良好的细胞接板培养，待细胞生长密度约３０％时，进行药物干预：实验组加入１．２５μｍｏｌ／ＬＬＹ２８３５２１９，对照组加入相同体积的ＰＢＳ，继续培养４８ｈ㊂之后使用ＰＢＳ洗涤细胞３次，更换为常规培养基，分别在撤药后第０㊁２㊁４㊁６㊁８天收集细胞，进行后续实验㊂１．２．３㊀ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色㊀取处理后各时间点的实验组和对照组Ｃａｌ２７细胞，吸除孔板内细胞培养液，用ＰＢＳ洗涤３次，加入１ｍＬＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色固定液，室温固定１５ｍｉｎ；吸除细胞固定液，用ＰＢＳ洗涤细胞３次，每次３ｍｉｎ；吸除ＰＢＳ，每孔加入１ｍＬ染色工作液（１０μＬＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色液Ａ，１０μＬＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色液Ｂ，９３０μＬＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色液Ｃ，５０μＬＸ⁃ｇａｌ溶液）；用石蜡封口膜封住孔板防止蒸发，３７ħ孵育过夜；普通光学显微镜下观察，计算阳性细胞率㊂１．２．４㊀ＣＦＳＥ荧光染色㊀在ＬＹ２８３５２１９撤药后，立即对实验组及对照组Ｃａｌ２７细胞进行ＣＳＦＥ荧光标记㊂按照说明书，向试剂盒提供的ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ粉剂中添加１８μＬ的二甲基亚砜，并充分混合，制备为５ｍｍｏｌ／ＬＣＦＳＥ储备溶液；取１μＬＣＦＳＥ储备液，加入１ｍＬ３７ħ预热的ＰＢＳ缓冲液中，即可稀释为５μｍｏｌ／Ｌ的工作浓度，成为ＣＦＳＥ工作液㊂将上述处理完的细胞使用ＰＢＳ洗涤３次后，加入１ｍＬＣＦＳＥ工作液，３７ħ避光孵育２０ｍｉｎ；去除染液，加入含有１％胎牛血清的培养基终止染色，洗去多余染料；加入完全培养基，将细胞放回培养箱，继续常规培养，在特定时间点取出细胞进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色或者流式分析㊂１．２．５㊀ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ与ＣＦＳＥ双染㊀ＬＹ２８３５２１９撤药后立即对Ｃａｌ２７细胞行ＣＦＳＥ染色，避光培养；同时在撤药后第０㊁２㊁４㊁６㊁８天进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色，荧光显微镜下观察并记录双染情况㊂１．２．６㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ㊀取经过处理的细胞，应用ＲＩＰＡ蛋白裂解液提取总蛋白，加入蛋白酶抑制剂，置于冰上进行裂解㊂用ＢＣＡ法测定蛋白浓度，然后进行凝胶电泳，转膜，室温封闭１ｈ，滴加ｐ１６㊁ｐ２１一抗，４ħ孵育过夜；ＰＢＳＴ洗膜３次后，滴加二抗，室温孵育１ｈ；电化学发光法发光，显影，定影，拍照㊂１．２．７㊀流式细胞分析及分选㊀在ＬＹ２８３５２１９撤药后立即进行ＣＦＳＥ染色，在第０㊁２㊁４㊁６㊁８天对实验组和对照组的细胞进行流式分析，比较荧光强度㊂对实验组中第４㊁６天的细胞进行分选：将实验组中高于对照组荧光强度的部分定义为ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ组，将实验组中荧光强度最低的１％部分定义为ＣＦＳＥ⁃ｌｏｗ组㊂分选获得细胞后，于六孔板内静置贴壁，之后进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色㊂ＣＦＳＥ荧光的激发和发射峰分别为４９２ｎｍ和５１７ｎｍ，通过流式细胞仪４８８ｎｍ波长段进行分析和分选㊂１．３㊀统计分析采用ＳＰＳＳ２３．０统计学软件进行数据分析，组间的差异比较采用方差分析，Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义㊂２㊀结㊀果２．１㊀ＬＹ２８３５２１９成功诱导Ｃａｌ２７细胞衰老ＬＹ２８３５２１９作用于Ｃａｌ２７细胞４８ｈ后，分别对实验组和对照组进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色，结果（图１Ａ㊁Ｂ）显示：对照组的阳性率为（３．８４ʃ０．６９）％，而实验组的阳性率显著升高，为（７３．７３ʃ１．０４）％，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）㊂Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果（图１Ｃ）显示，ＬＹ２８３５２１９作用后，衰老相关蛋白ｐ１６㊁ｐ２１的表达水平显著升高㊂结果提示，ＬＹ２８３５２１９可成功诱导Ｃａｌ２７细胞发生衰老㊂Ａ㊁Ｂ：分别为对照组和实验组ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色结果，其中阳性细胞胞浆呈蓝绿色；Ｄ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ电泳条带图１㊀ＬＹ２８３５２１９诱导Ｃａｌ２７细胞衰老Ｆｉｇ．１㊀Ｃａｌ２７ｃｅｌｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＹ２８３５２１９２．２㊀ＣＦＳＥ荧光与ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色的一致性ＬＹ２８３５２１９作用于Ｃａｌ２７细胞４８ｈ后，撤去药物，在不同时间点进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色，结果显示：对照组ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率为（３．８４ʃ０．７９）％，在培养过程中阳性率未发生明显改变；实验组ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率在第０天时最高，为（７２．６６ʃ０．７５）％，随着时间的推移，阳性率不断减少，第８天时阳性率与对照组无显著差异（图２）㊂提示随着非衰老细胞的分裂增殖，衰老细胞的比例越来越少㊂不同时间点ＣＦＳＥ荧光检测结果显示：对照组细胞在培养过程中，ＣＦＳＥ荧光强度不断减弱，第８天时荧光强度接近未染色的基线水平；实验组细胞的荧光强度在培养过程中同样不断减弱，但在同一时间点，实验组细胞的荧光强度明显比对照组强（图３）㊂说明由于衰老细胞的存在，荧光衰减速度变慢㊂为了进一步明确ＣＦＳＥ荧光对衰老细胞的标记情况，对撤药后的细胞先进行ＣＦＳＥ荧光染色，再在不同时间点进行ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色㊂双染实验结果显示，高ＣＦＳＥ荧光强度的细胞与ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性细胞相对应（图４）㊂以上结果提示了利用ＣＦＳＥ荧光对衰老细胞进行分选的可能性㊂２．３㊀利用ＣＦＳＥ分选衰老细胞考虑到第２天时衰老细胞ＣＦＳＥ荧光与非衰老细胞ＣＦＳＥ荧光的差别尚未明显，而第８天时荧光强度已接近基线水平，因此，我们选择ＬＹ２８３５２１９ＧＡ：对照组ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色结果；Ｂ Ｆ：依次为实验组撤药后第０㊁２㊁４㊁６㊁８天ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色结果；Ｇ：各时间点ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性细胞比例，∗：与对照组相比，Ｐ＜０．０５图２㊀ＬＹ２８３５２１９撤药后各时间点ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色Ｆｉｇ．２㊀ＳＡ⁃β⁃ｇａｌｓｔａｉｎｉｎｇａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓａｆｔｅｒＬＹ２８３５２１９ｒｅｍｏｖｅｄ图３㊀ＬＹ２８３５２１９撤药后各时间点ＣＦＳＥ荧光强度Ｆｉｇ．３㊀ＣＦＳＥｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｆｔｅｒＬＹ２８３５２１９ｒｅｍｏｖｅｄ撤药后第４㊁６天两个时点进行流式分选㊂结果显示，撤药后第４天，未分选时细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率为（８．２３ʃ１．８２）％，而分选后ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ组的细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率为（２５．０７ʃ３．３６）％，显著高于未分选组（Ｐ＜０．０５）㊂同样的，撤药后第６天，未分选时细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率为（５．０７ʃ０．８０）％，而ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ组的细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率为（１８．９２ʃ２．７２）％，显著高于未分选组（Ｐ＜０．０５，图５）㊂Ａ：对照组第２天；Ｂ Ｄ：依次为实验组第２㊁４㊁６天图４㊀各时间点ＣＦＳＥ与ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ共染情况Ｆｉｇ．４㊀ＣＦＳＥｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＳＡ⁃β⁃ｇａｌｓｔａｉｎｉｎｇａｔｅａｃｈｔｉｍｅｐｏｉｎｔ３㊀讨㊀论细胞衰老是肿瘤治疗过程中的常见结局之一㊂鉴于衰老细胞在肿瘤治疗中的双面性，增强衰老细胞的肿瘤抑制作用，而抑制其肿瘤促进作用，是目前的研究热点之一［１３］㊂而对衰老细胞的深入研究，必然离不开衰老细胞的分选㊂由于尚未发现衰老细胞的特异性表面标志物，目前尚无公认的分选衰老细胞的方法㊂对于衰老细胞的分选，目前主要是根据β⁃ｇａｌ染色进行，但在进行β⁃ｇａｌ染色时，会改变细胞膜的通透性，从而导致细胞的死亡［１４］㊂分选出来的细胞是死亡的衰老细胞，除细胞计数外，很多针对衰老细胞的实验无法进一步开展㊂而分选活的衰老细胞的方法目前尚不成熟，有利用细胞大小及脂褐素积累进行分选［１５］，也有利用ＳＡＳＰ进行分选［１６］，但其分选的特异性和效率都不尽如人意㊂因此，需要探究一种高效和高特异性的分选活的衰老细胞的方法㊂本研究中，我们根据衰老细胞失去分裂能力的特点，利用ＣＦＳＥ荧光标记对衰老细胞进行分选，探Ａ Ｃ：依次为第４天实验组未分选㊁ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ㊁ＣＦＳＥ⁃ｌｏｗ组细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色；Ｄ Ｆ：依次为第６天实验组未分选㊁ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ㊁ＣＦＳＥ⁃ｌｏｗ组细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ染色；Ｇ㊁Ｈ：分别为第４㊁６天ＣＦＳＥ荧光强度；Ｉ㊁Ｊ：分别为第４㊁６天各组细胞ＳＡ⁃β⁃ｇａｌ阳性率比较；∗：与未分选组比较，Ｐ＜０．０５；＃：与ＣＦＳＥ⁃ｌｏｗ组比较，Ｐ＜０．０５图５㊀ＬＹ２８３５２１９撤药后第４、６天ＣＦＳＥ分选结果Ｆｉｇ．５㊀Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｏｒｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｎｔｈｅ４ｔｈａｎｄｔｈｅ６ｔｈｄａｙｓａｆｔｅｒＬＹ２８３５２１９ｒｅｍｏｖｅｄ讨其可行性㊂实验结果提示，利用ＣＦＳＥ流式分选能够在一定程度上对衰老细胞进行富集㊂而且，ＣＦＳＥ是一种可对活细胞进行荧光标记的染料，分选出的衰老细胞为活细胞，能够进一步进行细胞培养及分析㊂利用ＣＦＳＥ荧光分选衰老细胞，需将ＣＦＳＥ标记后的细胞（含衰老细胞）培养数日，根据荧光强度的差异进行细胞分选㊂这是由于衰老细胞不增殖，而非衰老细胞不断进行增殖分裂，导致衰老细胞的荧光强度不变，而非衰老细胞荧光强度降低，从而能够根据荧光的强弱进行区分㊂值得注意的是，我们在实验过程中发现，随着时间的推移，衰老细胞的荧光值虽然较非衰老细胞更强，但相对于染色后的初始荧光值也发生了一定程度的减弱，考虑可能是由于荧光自身不断淬灭而导致其荧光强度下降㊂虽然我们证明了利用ＣＦＳＥ荧光进行衰老细胞的分选具有其可行性，但这种方法也存在一定的局限性㊂其应用需要一定时间的培养，在培养过程中衰老细胞可能发生了一定生物学特性的改变㊂其次，可能出现正常细胞死亡导致荧光强度较高，被误认为衰老细胞的假阳性情况存在㊂而利用ＣＦＳＥ分选出的ＣＦＳＥ⁃ｈｉｇｈ组的细胞中，衰老细胞比例约为２０％ ３０％，虽然具有一定的富集作用，但其分选效率仍然不算高㊂对于细胞死亡引起的假阳性情况，在流式分选时，可以通过划门策略进行初步排除㊂另外，可通过联合其他标记死亡细胞的荧光染料，例如碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）㊁７⁃氨基放线菌素Ｄ（７⁃ａｍｉｎｏ⁃ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ，７⁃ＡＡＤ）㊁Ｚｏｍｂｉｅ染料等，对死亡细胞进行排除后再进行ＣＦＳＥ的分选，从而避免其对结果的干扰㊂对于分选效率仍然不算高的问题，考虑后期可利用衰老细胞的其他特征，如细胞形态变大㊁具有脂褐素自发荧光等特征，联合ＣＦＳＥ荧光进行多种手段的同时应用，以期提高分选的特异性㊂综上所述，利用ＣＦＳＥ荧光分选衰老细胞具有一定的可行性，但仍存在相当的局限之处㊂本研究为衰老细胞在肿瘤治疗中的研究提供一定的方法学基础和实验依据，有助于后续研究的开展，但还需进一步探索更加特异和高效的分选方法㊂［参㊀考㊀文㊀献］［１］㊀ＲａｊｅｎｄｒａｎＰ，ＡｌｚａｈｒａｎｉＡＭ，ＨａｎｉｅｈＨＮ，ｅｔａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｓｅｌｅｃｔｅｄｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，２３４（１２）：２１４８５⁃２１４９２［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｃｐ．２８８９５．［２］㊀ＦａｇｅｔＤＶ，ＲｅｎＱ，ＳｔｅｗａｒｔＳＡ．Ｕｎｍａｓｋｉｎｇｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｃｏｎｔｅｘｔ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆＳＡＳＰｉｎｃａｎｃｅｒ［Ｊ／ＯＬ］．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ，２０１９，１９（８）：４３９⁃４５３［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５６８⁃０１９⁃０１５６⁃２．［３］㊀ＫｕｍａｒＳ，ＳｕｍａｎＳ，ＦｏｒｎａｃｅＡＪ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｃｑｕｉｒｅｐｒｅｍａｔｕｒｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｗｉｔｈｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔＤＮＡｄａｍａｇｅａｆｔｅｒｈｅａｖｙｉｏｎｒａｄｉａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ［Ｊ／ＯＬ］．Ａｇｉｎｇ，２０１９，１１（１２）：４１４５⁃４１５８［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１８６３２／ａｇｉｎｇ．１０２０４３．［４］㊀王璞，陈露萍，李清泉，等．细胞衰老与衰老细胞［Ｊ／ＯＬ］．生物化学与生物物理进展，２０１２，３９（３）：２５７⁃２６３［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔ⁃ｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１２０６．２０１２．０００１３．［５］㊀赵欢，周斌．细胞衰老研究现状［Ｊ］．中国细胞生物学学报，２０１７，３９（６）：６８７⁃６９４．［６］㊀ＨｕｄａＮ，ＬｉｕＧ，ＨｏｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｉｃｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｔｈｅｇｏｏｄａｎｄｔｈｅｂａｄ［Ｊ／ＯＬ］．ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１９，２５（３４）：５０６９⁃５０８１［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２５．ｉ３４．５０６９．［７］㊀ＫｒｅｉｓＮＮ，ＬｏｕｗｅｎＦ，ＹｕａｎＪ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＭｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１／ＣＤＫＮ１Ａ）ｉｎＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＭｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ［Ｊ／ＯＬ］．Ｃａｎｃｅｒｓ，２０１９，１１（９）：Ｅ１２２０［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃａｎｃｅｒｓ１１０９１２２０．［８］㊀ＣａｌｉòＡ，ＺａｍòＡ，ＰｏｎｚｏｎｉＭ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌｕｌａｒＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅＭａｒｋｅｒｓｐ１６ＩＮＫ４ａａｎｄｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦＡｒｅＰｒｅｄｉｃｔｏｒｓｏｆＨｏｄｇｋｉｎＬｙｍｐｈｏ⁃ｍａＯｕｔｃｏｍｅ［Ｊ／ＯＬ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１５，２１（２２）：５１６４⁃５１７２［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／１０７８⁃０４３２．ＣＣＲ⁃１５⁃０５０８．㊀［９］㊀ＺｈａｎｇＭ，ＧｕｏＸ，ＧａｏＹ，ｅｔａｌ．ＴｕｍｏｒＣｅｌｌ⁃ＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄＳｅｎｅｓ⁃ｃｅｎｃｅＩｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＷｉｔｈＤＮＡ⁃ＰＫｃｓＳｔａｔｕｓａｎｄＴｅｌｏｍｅｒｅＤｙｓｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎＩｎｄｕｃｅｄｂｙＲａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＤｏｓｅＲｅｓｐｏｎｓｅ，２０１８，１６（２）：１５５９３２５８１８７７１５２７［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／１５５９３２５８１８７７１５２７．㊀㊀［１０］ＬｉｕＪ，ＬｉｕＭ，ＷａｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｈｒｅｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＡｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｕｍｏｒＡｎｔｉｇｅｎ⁃ＩｎｄｕｃｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＴｒａｎｓｆｏｒ⁃ｍａｔｉｏｎＩｎＶｉｔｒｏ［Ｊ／ＯＬ］．ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１９，３８（１１）：１４０２⁃１４１０［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｄｎａ．２０１９．４８４９．［１１］ＬöｎｎｑｖｉｓｔＳ，ＪｕｎｋｅｒＪＰＥ，ＳｅｄｅｌｌＭ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓａｎｄｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓｕｓｉｎｇｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ［Ｊ／ＯＬ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１９，１４（８）：ｅ０２２１８７８［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２２１８７８．［１２］ＫｉｒｋｌａｎｄＪＬ，ＴｃｈｋｏｎｉａＴ．ＣｅｌｌｕｌａｒＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＡＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ［Ｊ／ＯＬ］．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７，２１（）：２１⁃２８［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｂｉｏｍ．２０１７．０４．０１３．［１３］刘俊平．衰老及相关疾病细胞分子机制研究进展［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２０１４，４１（３）：２１５⁃２３０．［１４］潘静，陈金铃，朱丹丹，等．细胞衰老机制的研究新进展［Ｊ］．中国病原生物学杂志，２０１５，１０（７）：６７２⁃６７５．［１５］阳晶，黄岚珍，黄希仕，等．一种应用流式细胞术快速分选活的衰老细胞的方法［Ｊ］．中国细胞生物学学报，２０１５，３７（１）：７４⁃７８．［１６］ＭａｒｔíｎｅｚＪ，ＴａｒａｌｌｏＤ，Ｍａｒｔíｎｅｚ⁃ＰａｌｍａＬ，ｅｔａｌ．Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎｓｍｏｄｕ⁃ｌａｔｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｅｎｇｔｈ，ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓａｎｄｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅｉｎｔｈｅｒａｐｙ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｎｅｓｃｅｎｔｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２０１９，４７６（１７）：２４６３⁃２４８６［２０１９⁃１１⁃０７］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０４２／ＢＣＪ２０１９０４０５．（收稿日期：２０１９－１１－０７）（本文编辑：曹灵）。
26290955_荧光染料CFSE标记神经细胞的体外研究
收稿日期：2021-3-10 ；修回日期：2021-12-16基金项目：空间辐射对机体神经损伤机理及药物防护研究作者简介：邓逸凡，西北农林科技大学本科毕业，北京理工大学硕士在读。
通信作者：马宏，研究方向：研究方向为肿瘤的基因治疗、空间环境免疫效应分子机制。
E-mail:04656@Abstract: Objective to explore the ideal condition and tracking time of fluorescent dye CFSE labeling neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods SH-SY5Y cells were labeled with 0,1,2,5,10μmol/L CFSE and co cultured with unlabeled U87 MG cells. The positive rate and fluorescence intensity of SH-SY5Y cells were detected by flow cytometry and fluorescence microscope at 24,48,72h, respectively, so as to screen the ideal conditions for labeling SH-SY5Y cells with CFSE, and the effect of CFSE on cell proliferation was detected by MTS method. Results CFSE with 1μmol/L final concentration was an ideal condition for labeling SH-SY5Y cells. Under this condition, the fluorescence intensity of SH-SY5Y cells could still be distinguished from that of unlabeled U87 MG cells after 72h, and CFSE had no effect on the proliferation of SH-SY5Y cells. Conclusion under normal culture conditions in vitro, CFSE with final concentration of 1μmol/L is an ideal condition for labeling SH-SY5Y cells. Under this condition, CFSE can label SH-SY5Y cells for 72 hours.Key w ords ：CFSE, SH-SY5Y , U87 MG, co-culture, flow cytometryIn Vitro Study of Fluorescent Dye CFSE Labeled Nerve CellsDENG Yifan, ZHANG Peng, WANG Ailu, CHEN Yu, DENG Yulin, MA Hong *(Beijing Institute of Technology, Beijing 100081)摘要：目的 探究荧光染料CFSE 对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 标记的理想条件和跟踪时限。
cfos免疫染色原理
cfos免疫染色原理
CFOS（Fos蛋白转录因子）免疫染色是一种常用的技术，用
于检测细胞在特定刺激后启动基因转录的过程。
CFOS蛋白是
一种转录因子，可以与DNA结合并调控基因的转录。
CFOS
的表达可以是非常短暂的，通常只持续几个小时，因此需要使用免疫染色技术来检测其表达。
CFOS免疫染色的原理如下：
1. 固定细胞：首先，需要固定待研究的细胞，通常使用甲醛或乙醛进行固定。
固定细胞有助于保持细胞的形态和保护CFOS
蛋白的完整性。
2. 渗透化：为了使抗体能够穿过细胞膜，细胞需要进行渗透化处理。
一种常用的方法是使用表面活化剂（例如Triton X-100）来破坏细胞膜并提高抗体对CFOS的可及性。
3. 抗体反应：接下来，使用特异性的抗CFOS抗体与待检测的CFOS蛋白结合。
这些抗体通常会与CFOS的特定表位结合，
并形成免疫复合物。
4. 二抗标记：为了检测CFOS的表达，需要使用与第一抗体不同来源的第二抗体来标记CFOS-抗体复合物。
这些第二抗体
通常是被标记有荧光染料或酶的抗兔IgG或抗鼠IgG。
5. 信号检测：根据第二抗体的标记物不同，可以使用不同的方法来检测CFOS信号。
例如，如果使用荧光标记的第二抗体，
可以使用荧光显微镜来观察荧光信号。
如果使用酶标记的第二抗体，可以使用底物染色方法来观察酶的反应产物。
通过CFOS免疫染色技术，可以在细胞或组织水平上检测CFOS转录因子的表达，并了解CFOS的功能及其参与的生物
过程。
这种技术在神经科学、癌症研究等领域中得到广泛应用。
celltrace示踪标记法
celltrace示踪标记法CellTrace示踪标记法是一种用于追踪和标记细胞的方法。
它可以帮助科学家们在细胞实验中更好地理解和研究细胞的生物学特性、功能和相互作用。
CellTrace示踪标记法在细胞生物学和免疫学领域得到广泛应用，下面将详细介绍该方法的原理、步骤和应用。
一、原理：CellTrace示踪标记法基于荧光染料的使用。
这些染料可以在细胞内稳定地标记，并且在细胞分裂时，细胞的后代会继承和传递这些染料。
染料在细胞内发出的荧光信号可以被检测和测量，从而追踪细胞的生长、分裂和迁移过程。
二、步骤：CellTrace示踪标记法的步骤通常包括细胞染色、细胞培养和荧光检测。
以下是详细步骤：1.细胞染色：选取适合的荧光染料，如CellTrace Violet、CellTrace CFSE（Carboxyfluorescein succinimidyl ester）等。
将细胞悬浮液与稀释后的染料混合，使染料与细胞充分接触，使之内摄并稳定。
2.细胞培养：将染色后的细胞培养在适宜的培养基中，并提供合适的生长条件。
细胞会不断分裂，将染料均匀地分配给后代细胞。
3.荧光检测：根据实验目的，选择适当的时间点进行荧光检测。
使用荧光显微镜或流式细胞术等技术，检测细胞的荧光信号强度并记录下来。
三、应用：CellTrace示踪标记法在细胞生物学和免疫学领域有着广泛的应用。
以下是几个主要应用领域：1.细胞增殖研究：通过追踪染色后细胞的分裂，科学家可以研究细胞增殖速率、周期、分裂模式等。
这有助于了解细胞生长调控的机制以及癌细胞增殖的异常现象。
2.免疫细胞迁移研究：将免疫细胞标记后，可以通过追踪其在体内的迁移和定位，了解免疫细胞在免疫应答中的作用和机制。
3.细胞间相互作用研究：将不同类型的细胞分别用不同的荧光染料标记后，可以同时观察并追踪它们之间的相互作用，如细胞融合、细胞-细胞交流等。
4.药物筛选和毒性研究：通过示踪标记方法，可以对药物的毒性和疗效进行评估。
荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究
・论著・文章编号:1007-8738(2004)02-0140-02荧光染料CFSE 作为细胞标记的特性研究陈蕾蕾,陈军浩,孙雪梅3,施广飞(南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心,江苏南京210008)收稿日期:2003-07-11; 修回日期:2003-09-22基金项目:国家人事部留学回国人员科研基金资助(N o.2001233)江苏省卫生厅重点项目基金资助(N o.H200220)作者简介:陈蕾蕾(1979-),女,江苏盐城人,医学学士.T el :(025)3304616210370;Email :leileichen79@3C orresponding author摘要目的:探讨荧光染料CFSE 在作为细胞标记时的特性。
方法:应用激光共聚焦扫描显微术,观察CFSE 在细胞中的准确定位。
利用MTT 比色法测定CFSE 标记的细胞及未标记细胞的增殖情况;通过细胞计数和流式细胞仪(FC M ),测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。
结果:在共聚焦显微镜下,可见CFSE 标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光,以胞核荧光最强。
利用MTT 比色法测定标记及未标记细胞的A 值无显著差异。
连续6d 记录的细胞数与FC M 测定的平均荧光强度呈负相关。
结论:CFSE 可作为细胞的标记物,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究。
关键词:荧光染料;CFSE;细胞标记中图分类号:R392.11 文献标识码:B 荧光染料2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,62car 2boxy fluorescein diacetate succinimidyl ester ,CFSE )是一种可穿过细胞膜的荧光染料,具有与细胞结合特异性的琥珀酰亚胺酯基团与具有非酶促水解作用的羧基荧光素二醋酸盐基团结合在一起可使CFSE 成为一种良好的细胞标记物[1]。
CFSE增殖实验
CFSE增殖实验-江英骙PBMC增殖染色分2天第一天1.分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁；2.CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。
第二天1.收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。
先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）；2.CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管）3.细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）；4.37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）；5.直接离心，1800rpm，10min；6.加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min；7.离心，1800rpm，10min；8.再洗一遍，重复步骤79.R10+双抗重悬，计数；10.调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul11.每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热）12.放入大细胞房培养7天，收细胞；13.可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。
用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性
用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性陈蕾蕾;孙雪梅;施广飞;张荣林;耿东进;顾香芳;韩鹂;张葵【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2006(24)1【摘要】目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性.方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型.用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区.4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况.结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色.在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高.结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究.【总页数】2页(P29-30)【作者】陈蕾蕾;孙雪梅;施广飞;张荣林;耿东进;顾香芳;韩鹂;张葵【作者单位】南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院心脏内科,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院心脏内科,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008;南京大学医学院附属南京鼓楼医院医学检验中心科研部,南京,210008【正文语种】中文【中图分类】R542.2【相关文献】1.荧光染料CFSE检测淋巴细胞增殖的研究 [J], 丘凌;何珊;黄瑞;张雁云2.荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞的体外研究 [J], 李艳菊;邓兰;黄睿;郭坤元3.BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较 [J], 付霞霏;何援利;杨芳;彭冬先;刘木彪4.利用荧光染料CFSE分选衰老细胞的探究 [J], 胡钦朝;姜徕博;彭建敏;吴桐;程斌;夏娟5.荧光染料CFSE在实验性葡萄膜炎T细胞增殖研究中的应用 [J], 雷松;毛咏秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光染料标记法
荧光染料标记法荧光染料标记法是一种在生物学研究领域中广泛应用的实验技术，通过荧光染料标记，可以对生物样品中的特定分子或细胞结构进行可视化观察。
本文将从原理、应用和方法三个方面详细介绍荧光染料标记法，以期为读者提供全面的指导意义。
首先，我们来了解一下荧光染料标记的原理。
荧光染料是一类具有自身荧光特性的化学物质，它们能够在特定的波长下吸收光能并发出特定波长的荧光信号。
而荧光染料标记法就是利用这种特性，将荧光染料与待研究的目标分子或细胞结构结合，从而使其在显微镜下可见。
通过荧光显微镜观察标记的分子或细胞结构，研究者可以了解其在细胞内的定位、数量以及相互作用等信息。
荧光染料标记法的应用非常广泛。
在细胞生物学研究中，它可以用于观察细胞器、细胞骨架、蛋白质、核酸等生物分子的分布情况，以及它们在细胞活动中的角色和功能。
在生物医学研究中，荧光染料标记法被广泛应用于疾病诊断、药物筛选和细胞治疗等领域。
此外，荧光染料标记法还在食品安全检测、环境监测和材料科学等方面发挥着重要作用。
下面我们来介绍一些常用的荧光染料标记方法。
首先是间接标记法。
在间接标记法中，研究者通常先利用特定的抗体与目标分子或细胞结构结合，然后再使用携带荧光染料的二抗与第一抗体结合。
通过这种方法，可以实现对多个目标的同时标记，从而提高实验的灵活性和效率。
其次是直接标记法。
直接标记法是将荧光染料直接与目标分子或细胞结构结合，常见的方法包括化学共价结合、亲和结合和生物素-链霉亲和素结合等。
直接标记法操作简单、灵敏度高，适用于单个目标的标记。
在进行荧光染料标记实验时，需要注意一些关键步骤。
首先是荧光染料的选择。
不同的染料具有不同的荧光特性和适用范围，因此需要根据实验需求选择合适的染料。
其次是标记的条件优化。
标记反应的条件包括荧光染料和目标分子或细胞结构的浓度、反应时间和反应温度等。
这些条件的优化可以提高标记效率和特异性。
最后是标本的处理和显微镜观察。
标本的处理包括固定、脱水和封片等步骤，而显微镜观察则需要选择合适的显微镜和获取荧光图像的参数。
荧光染料标记法
荧光染料标记法荧光染料标记法是一种用于研究生物分子的定位和追踪的技术。
该技术通过在生物分子上结合荧光染料，使其产生荧光信号，从而可以对其进行观察和分析。
荧光染料标记法具有很多优点，包括高灵敏度、高特异性、可视化观察、多重标记等，因此在生命科学领域得到了广泛应用。
荧光染料标记法可以应用于多个领域，如细胞生物学、分子生物学、免疫学等。
在细胞生物学中，荧光染料标记法可以用来研究细胞的结构和功能。
通过将荧光染料标记在特定蛋白质上，可以对细胞内这个蛋白质的位置、数量和分布进行观察。
这对于研究细胞的组织、器官和器官系统的结构和功能具有重要意义。
在分子生物学中，荧光染料标记法可以用来追踪和观察生物分子的运动和相互作用。
例如，在研究DNA的复制过程中，可以将荧光染料标记在DNA的两端，通过观察荧光信号的变化来研究DNA的复制速率和方向。
此外，荧光染料标记法还可以用于研究蛋白质的结构和功能，在蛋白质质量分析、亚细胞定位和蛋白质交互作用等方面有着重要的应用价值。
免疫学中的荧光染料标记法被广泛应用于免疫细胞分析和抗体检测。
通过将荧光染料标记在特定抗体上，可以对免疫细胞的表型和功能进行研究。
例如，可以用荧光染料标记在表面标记物上的抗体，来分析免疫细胞的表达谱和分子互作。
此外，荧光染料标记法还可以用于免疫细胞定位和免疫组织化学。
荧光染料标记法的原理是利用化学染料的发射荧光特性。
常用的荧光染料包括荧光素、酮青素、苯基荧光素和硫苯素等。
这些染料具有吸收特定波长的光能的能力，然后在吸收能量的过程中被激发，发射出特定波长的荧光。
因此，通过将荧光染料标记在生物分子上，可以观察到这些生物分子发出的荧光信号。
荧光染料的标记通常分为两种：直接标记和间接标记。
直接标记是将荧光染料直接与生物分子结合，形成荧光标记物。
间接标记是通过将荧光染料标记在某种中间分子上，然后再与生物分子结合，形成间接的荧光标记物。
此外，荧光染料标记还可以同时标记多个生物分子，实现多重标记，从而可以同时观察多个生物分子的分布和相互作用。