荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测
●原则
荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。

检测步骤如下：
1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。

2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。

3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。

4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。

●特点
◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶
◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng
◆确切的检测限依检测仪器而定。

◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶
基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。

不适用于对细菌荧光素酶进行检测。

●器材和试剂
◆器材
在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。

当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。

◆试剂
1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些
试剂可以启动酶反应。

这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-
15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。

避免反复冻融。

应避光保存，因为荧光素在
光照下会发生氧化。

2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。

●基本操作步骤
下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。

提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。

不要反复冻融以避免酶活性的降低。

1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。

2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子）
小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。

10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO4
14.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。

3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂
解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。

用橡皮刮将细胞刮离培养皿。

将裂解物转移到微量离
心管中。

Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%（v/v）Triton X-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（p
H7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，1mmol/L DTT（临用前加入）
4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。

将上清转移到另
一个微量离心管中，置于冰上以备分析。

5)在开始化学发光反应之前，将100 μl的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测
器皿中（我们建议用96孔板）。

加入360 μl荧光素酶分析缓冲液。

荧光素酶分析缓冲液：25m
mol/L甘氨酰甘氨酸（pH 7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，2mmol/L ATP，1mmol/
L DTT（临用前加入）
6)用25mmol/L（pH7.8）的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素至200μmol/L。

荧光素贮液：1mmol/L D-
荧光素（合成晶体蛋白，Sigma），25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH 7.8），10mmol/L DTT。

（分
成1ml小份，-70℃保存在避光盒中几个月）
7)样品中加入200 μl稀释的荧光素液。

荧光素在光照下迅速发生氧化，因此丢弃未用完的荧光
素稀释液。

在562nm条件下进行检测。

注意事项：
1)荧光素酶检测试剂需在15-25℃的条件预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手
动检测。

当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。

.加入荧光素酶检测试剂
0.5-10秒内开始检测发射光1-5秒，持续发光20秒后，产生光强度降低，其半衰期为5分钟。

2)如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5个小时，在-70℃可
保存数月。

3)利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。

4)在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出），可用裂解液将样品进行
稀释。

5)我们建议不要储存稀释过的样品。

如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.
5mg/mL，这样可以保持样品的稳定性。

6)如果样品中的荧光素酶的活性较高，应尽可能减少所用来检测的样品的体积。

在这种情况下，
按照标准操作，可以相应减少所使用的荧光素酶检测试剂（荧光素酶试剂体积/样品体积=100μl
/20-50μl），这样对检测结果没有影响。

7)一些荧光仪在进行检测前需要1-2秒的稳定，因此，我们建议在开机后过一段时间再进行检测
操作。

8)有一些荧光仪需要在不改变样品体积的条件下加入更多的检测试剂（如300μl）,这与所给定的
标准的操作（50-100μl）有所不同。

9)如果用液闪计数仪，要逐个加入检测试剂后逐个立即检测。

荧光素酶报告基因检测结果需要用β-gal进行校正，既荧光素酶报告基因检测结果。