苏云金芽孢杆菌液体发酵的研究
苏云金杆菌的研究
2、样本和数据采集
考虑到苏云金杆菌的应用范围广泛，我们从农业领域相关的研究论文、专利 和书籍中搜集了关于苏云金杆菌的样本和数据。数据采集包括苏云金杆菌的菌种、 施用方法、防治对象、防治效果等方面的信息。
3、数据分析
对搜集到的样本和数据进行筛选、整理和分析。采用定量和定性相结合的方 法，对苏云金杆菌的耐药性、应用效果等方面进行深入研究。并运用表格、图表 等形式展示相关数据和结果。
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苏云金杆菌的研究
01 引言
03 研究方法
目录
02 研究现状 04 研究成果
引言
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌， 广泛应用于农业中作为生物防治手段，对多种害虫具有高效的防治效果。本次演 示将探讨苏云金杆菌的研究现状和应用，首先概述苏云金杆菌的分类和特征，然 后介绍苏云金杆菌在农业中的应用及研究现状，并探讨相关研究方法。最后，将 总结苏云金杆菌的研究成果和发现，指出研究的不足之处，并展望未来的研究方 向。
研究成果
1、苏云金杆菌对农业的影响
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中具有广泛的应用。其对农业的 主要影响表现在以下几个方面：
（1）高效防治害虫：苏云金杆菌对多种农业害虫具有高效的防治效果，特 别是对鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等害虫有很好的防治效果。
（2）减少化学农药的使用：施用苏云金杆菌可有效减少化学农药的使用量， 降低环境污染。
3、苏云金杆菌在农业中的应用 及研究现状
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中广泛应用于防治各种鳞翅目、 膜翅目和鞘翅目等害虫。目前，针对苏云金杆菌在农业中的应用研究主要集中于 以下几个方面：
（1）优化施用方法：研究苏云金杆菌的最佳施用时间和方法，以提高其对 害虫的防治效果和减少对非靶标生物的影响。
苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基的优化
第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化运用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，以最陡爬坡实验得到的中心点对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验确定的３个显著性影响因子各取３水平．设计了３因素３水平共１５个实验点进行响应面分析．１．５芽孢量测定用石碳酸复红对待测菌液进行染色，芽孢未被染色，在显微镜下观察，血球计数板进行计数．２结果与分析２．１单因子实验２．１．１碳源单因子实验分别以玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养，结果表明５种碳源都能促进该菌的生长并产生芽孢．其中以玉米淀粉为碳源的培养基芽孢产量最多，结果见图１．从培养基原料的来源、价格和对芽孢产量的影响等方面考虑，确定以玉米粉、玉米淀粉作为发酵培养基的碳源．２．１．２氮源单因子实验以玉米淀粉作为碳源，分别以黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉作为初始氮源，进行单因子实验．在培养过程中苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９生长良好，各种培养基组合都有芽孢产生，但在芽孢产量上有所差别，结果如图２所示．可见酵母粉对芽孢的产量影响最大，本实验确定以酵母粉、黄豆饼粉作为培养基的氮源．２．２Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选培养基巾影响发酵液芽孢产量的重要因子通过碳源和氮源单因子实验，结合其他召ｚ发酵实验过程中发酵培养基的组成以及碳氮源比例，确定初始发酵培养基为：玉米粉１０．０ｇ／Ｌ，玉米淀粉１５．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２０．０ｇ／Ｌ，酵母粉３．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。
·７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ。
０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ。
０．２ｇ／Ｌ．将初始发酵培养基巾的８个组分作为影响因素进行全面考察，选择８因子２水平的实图１不同碳源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响图２不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响验设计，以ｘ。
、咒、ｘ。
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分别代表玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、Ｋ：ＨＰＯ。
苏云金芽孢杆菌的研究——综述
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
苏云金芽孢杆菌研究回顾与展望
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意 事项
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意事项
虽然Bt及其产品具有高效、安全、环保等优点，但在使用时仍需注意以下几 点：
1、选择适当的Bt产品：针对不同的害虫种类和作物种类，应选择相应的Bt产 品。
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意事项
2、正确使用方法：严格按照产品说明书的要求使用Bt，包括使用时间、剂量 和方式等。
三、未来展趋势
3、系统生物学研究：随着系统生物学研究的深入，对苏云金芽孢杆菌的全基 因组表达调控、代谢途径等方面的研究将更加深入。这将有助于从整体角度理解 其生物学特性，为优化其应用提供理论支持。
三、未来发展趋势
4、多学科交叉研究：未来的研究将更加注重多学科交叉，如物理学、化学、 材料科学等。通过不同学科的融合，可以开发出更具有创新性的应用领域和产品。 例如，将苏云金芽孢杆菌与纳米技术相结合，可以开发出新型的纳米生物农药或 纳米生物材料等。
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
苏云金芽孢杆菌作为一种重要的微生物资源，在多个领域具有广泛的应用： 1、生物农药：苏云金芽孢杆菌作为一种环保型的杀虫剂，被广泛应用于农业、 林业等领域。其产生的毒素蛋白对多种害虫具有特异性杀灭作用，且对人类和其 他动物无害，因此备受青睐。
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
苏云金芽孢杆菌是一种具有重要应用价值的微生物，自1911年被发现以来， 一直受到广泛。其研究历程可分为以下几个阶段：
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
1、基础生物学阶段：早期的研究主要集中在苏云金芽孢杆菌的生物学特性、 生长条件、芽孢形成等方面。这些研究为后续的应用提供了重要的理论基础。
苏云金芽孢杆菌的杀虫机制以及其生物杀虫制剂研究概况
苏云金芽孢杆菌的杀虫机制以及其生物杀虫制剂研究概况前言化学杀虫剂的长期使用对生态环境产生了严重的破坏，而害虫种群的抗药性也日益提高，因此生物杀虫剂因为其“绿色环保”的特点日益引起人们的广泛关注。
其中以自1901年日本学者从家蚕体内分离到以来的被广泛应用到植物病虫害的生物防治的苏云金芽孢杆菌最为有名。
苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。
其形成的蛋白晶毒素能够对鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、食毛目、直翅目等9个目500多种害虫具有毒杀作用，同时还对线虫、瞒虫、原生动物等害虫有特异的杀虫活性。
并且科学家关于苏云金芽孢杆菌的科学研究已经有很长的历史，自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年。
1 苏云金芽孢杆菌杀虫剂历史研究以及其应用苏云金芽孢杆菌最初是日本人石渡繁胤于1901年首次从有病的家蚕虫体内分离，并且证明其对一些鳞翅目的昆虫具有杀虫活性。
1911年，德国人恩斯特·贝尔林纳从德国苏云金省的地中海粉螟虫体内又重新分离出一种高效杀虫的细菌，并正式定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thutingiensis n.sp.)。
[5]至今为止，苏云金芽孢杆菌杀虫剂是世界上应用最成功的生物杀虫剂。
并且，科学家对于苏云金芽孢杆菌的研究已经有100a的历史。
自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年。
而且以苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白为活性的生物杀虫剂年销售额占全球生物杀虫剂的95%以上。
但是因为其推广力度以及人们的农药使用意识的传统观念，目前生物农药仅占全部农药市场5%～8%，从此可看出，苏云金芽孢杆菌杀虫剂任然有具有较大的发展潜力。
同时，苏云金芽孢杆菌被认为是对环境安全友好的生物杀虫剂，生产过程符合环境安全保护的要求，喷撒杀虫剂后在野--外残留少。
苏云金芽孢杆菌农药生产成本较低，主要原料为淀粉、蛋白胨和豆粕粉等。
生产和使用苏云金芽孢杆菌杀虫剂具有如下优点：(1)大罐液体发酵生产，生产工艺简单，设备投资少，生产成本低；(2)原材料来源广泛，均为农、副产品，价格比较便宜；(3)建厂周期短；(4)产品杀虫谱广，对鳞翅目的200多种害虫均有毒杀作用；(5)使用Bt杀虫剂对环境和水源无污染，对人畜无害。
苏云金芽孢杆菌发酵上清中增效物质生成的相关研究
苏云金芽孢杆菌发酵上清中增效物质生成的相关研究陈振民1,2 李 青2 刘华梅2 谢天键2 曹军卫13(武汉大学生命科学院 武汉 430072)1 (武汉科诺生物农药有限公司 武汉 430074)2摘要:利用BI OST AT 2C L15L 全自动发酵罐和210t 不锈钢发酵罐,对苏云金芽孢杆菌不同菌株(G C 291,MP342,H D 21)发酵上清液中增效物质的生成进行了研究,发现增效物质于对数生长期前期开始产生并积累,至对数生长期末期达到高峰,并保持稳定;不同菌株的发酵上清中增效物质生成量不同,其中G C 291最强(增效倍数f =610),MP342次之(f =317),H D 21最弱(f =115);G C 291菌株上清液中增效物质生成曲线与晶体含量,效价代谢曲线相似,说明三者之间有显著的正相关。
溶氧对G C 291上清增效物质生成有明显影响,供氧充足,增效物质合成量较高(f =6),供氧不足合成量较低(f =4)。
关键词:苏云金芽孢杆菌,上清液增效物质,生成中图分类号:S476111 文献标识码:A 文章编号:025322654(2004)0120022204 3联系人 收稿日期:2002212209,修回日期:2003202224STU DY ON THE GR OWTH OF SYNERGIER IN THE SUPERNATANT OFBACILLUS THURINGI ENSISCHE N Zhen 2M in 1,2 LI Qing 2 LI U Hua 2Mei 2 XIE T ian 2Jian 2 C AO Jun 2Wei 1(College o f Life Sciences ,Wuhan Univer sity ,Wuhan 430072)1(Wuhan kernel biopesticide company ,Wuhan 430074)2Abstract :The growth curves of synergier in the supernatant from strains of Bacillus thuringiensis G C 2911MP 2342and H D 21were studied .The results showed that the production and accumulation of synergier began in the beginning of the logarithm ic growth phase ,and reached the top in the end of the logarithm ic growth phase ,and kept stable during the stable phase.Synergier in the supernatant from different Bacillus thuringiensis strains grew differently ,strain G C 291(whose synergistic fold was 6)grew better than strain MP 2342(whose synergistic fold was 314),strain H D 21grew badly (whose synergistic fold was only 118);There was much sim ilarity am ong the synergistic growth curve ,crystal growth curve and bioaasay potency curve ,which indicated that the relations am ong synergier ,crystal and bioaasay potency was remarkably positive correlation.Diss olved oxygen had s ome degree in fluence on the synergier growth ,abundant provision oxygen was contributed to the synergistic growth .K ey w ords :Bacillus thuringiensis ,Synergier in superuatant ,G row以往的研究认为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,以下简称Bt )的毒力来源于伴孢晶体和芽孢,但近10年来,有研究报道Bt 发酵上清液中含有一种分子量为1,000D ,结构与抗生素Z wittermicinA 相似的增效物质,对Bt 的毒力有着显著影响。
生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展----朱玮
2004 年 6 月 The Chinese Journal of Process Engineering June 2004生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展 朱 玮， 赵 兵， 王晓东， 王玉春 (中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080)摘要：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)制剂是目前应用广泛而有效的一种微生物杀虫剂.本文介绍了苏云金芽孢杆菌的菌种优选、发酵过程及剂型研究进展，具体阐述了发酵过程中培养基和发酵条件的优化、各种发酵方式和发酵设备等. 指出了目前发酵生产苏云金芽孢杆菌中存在的问题，提出了解决问题的建议并展望了其发展前景.关键词：苏云金芽孢杆菌；杀虫晶体蛋白；微生物杀虫剂中图分类号：S476+.11 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)03−0282−07 １ 前 言 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein)，对敏感昆虫有特异性的防治作用. 1956年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养苏云金杆菌并用于防治菜青虫的报道，从而揭开了苏云金杆菌大规模培养的序幕. 中国从上世纪60年代也开始了规模化生产. 同苏云金杆菌有关的研究，特别是有关分子生物学方面的研究正在持续展开，但在发酵工艺方面还需进一步加强.随着人们的环保意识不断增强，生物农药正在引起越来越多的关注. 苏云金杆菌制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在生物杀虫剂市场中所占份额也日益增加[1−3].２ 苏云金杆菌的优选 近30年来已从世界各地的土壤、昆虫及其接触物中分离出大量苏云金杆菌的菌种. 现在大约已知有69个血清型，82个血清亚种[4]. 大多数生产厂家主要使用血清III型、V型、VII型菌株,包括HD−1, Bt−K, 8010等. 在连续的人工转接和生产中，苏云金杆菌会出现芽孢和晶体变小和数量减少、生长速度缓慢等退化性状，一般采用虫体复壮的方法重新得到高毒力的菌株.针对苏云金杆菌菌种发酵效价低、杀虫谱窄、见效慢、菌种退化等问题，可以采用诱变的方法筛选高毒力的菌株. 选择合适的诱变剂量，将化学诱变和物理诱变结合能显著提高突变率. 丁学知等[5]将菌株7012C经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，菌株的毒力与原始菌株相比提高了7.5倍.目前许多科学家致力于采用遗传工程的办法，对原有的ICP基因重组改造，构建成杂种基因或工程菌，以提高杀虫效率，扩大杀虫谱，延长有效期或改进制剂效能. 商品化的苏云金杆菌杀虫剂主要源自库斯塔克亚种，如HD−1及类似菌株. 将cry1C基因导入这类菌株后，可扩充其对甜菜收稿日期：2003−07−28，修回日期：2003−10−23作者简介：朱玮(1979−)，女，安徽省芜湖市人，硕士研究生，生化工程专业，Tel: 010−82627059, E-mail: sesamin@.夜蛾等灰翅夜蛾属昆虫的活性，开发出的产品或制剂有美国的Cutlass和我国的WG系列和BtTnY. 国内一些实验也证明，表达后对夜蛾科昆虫有毒效的cry1E、对双翅目昆虫有效的cry11A及对蚊子有毒效的cryt1A等基因，均可在构建菌株中有效表达，为进一步建立广谱的工程菌打下了基础. 除了广谱杀虫工程菌，提高杀虫活性的工程菌、延缓抗性的工程菌、延长持效期的工程菌等也已研制成功[6−8]. 此外，还可以在体外操作ICP基因后插入新载体，其中包括将cry基因转入假单孢菌以增加持效期、转入植物内生菌防治玉米螟、转入蓝细菌以增强水体中防蚊功能、转入杆状病毒杀虫剂以利用病毒的垂直传播的特性等. 与传统育种方法相比，构建的工程菌不仅能提高本身性状，而且可以有目的、定向地增加新的性状. 这些工程菌有的已开发出制剂并投入田间应用，有的还处于研究阶段，它们的应用效果和开发前景还有待实践检验. 虽然大量的苏云金芽孢杆菌基因已进行过序列分析，但毒性受体、作用机制及抗性机制综合研究还很有必要. 苏云金杆菌工程菌建立后，还需考察其基因表达量、遗传稳定性以及生产工艺[9]. ３ 苏云金杆菌的发酵工艺 苏云金芽孢杆菌发酵生产包括液态发酵和固态发酵两种方式.３．１ 液态发酵 液体发酵是目前苏云金杆菌杀虫剂大规模生产中的主要发酵方式，其产品杀虫毒力与其发酵水平有着密切的关系. 发酵过程的研究主要集中在培养基组份和浓度、培养过程的通气量、温度、溶解氧量等因素对芽孢数、伴孢晶体及毒力效价影响的相关性研究上.3.1.1 培养基的优化Yousten等[10], Rogoff等[11], Nickerson等[12]对苏云金杆菌的基本营养需要、代谢途径、伴孢晶体形成和抑制伴孢晶体形成的因素等作了研究，为苏云金杆菌制剂的生产提供了生理学依据[13,14]. 苏云金杆菌对培养基的要求不严，多种因地制宜的农副产品都可被其吸收利用，但对多种不同来源的复合培养基，不同的菌种要实现可行的工业生产需要有针对性地进行培养基优化. Dulmage[15]在研究两种培养基对12个亚种的影响后发现，不同亚种在同一培养基中或同一亚种在不同培养基中，产生的活芽孢数和杀虫活性会相差几倍到几百倍不等. 因此，菌种和培养基组份均对发酵产品的毒力效价有重要影响. 为了获得高效价水平的发酵培养基配方，研究人员相继采用正交设计、快速登高法、优选法或二次正交旋转组织设计等方法进行优化筛选，验证后用于工业生产.在深层液态发酵中，培养基的浓度和碳氮比很重要. 早期研究发现[16]，随培养基营养成份浓度增加，芽孢数和毒蛋白随之增加. Arcas等[17]将培养基中的葡萄糖浓度从8 g/L增加到56 g/L后，毒力水平和芽孢数也分别提高了6和7倍. 但是浓度过高会抑制其生长，不能形成正常的芽孢和毒蛋白. 培养基浓度在一定范围内增加，必需营养元素浓度加大，有利于细胞的生长和芽孢的生成；而当培养基浓度过大，粘度增加，物质交换速度下降，局部代谢产物不能及时排出，氧传递速度降低，苏云金杆菌的生长受到抑制，芽孢数也随之下降.保持合适的碳氮比对高效价产品生产也很关键，不合适的碳氮比会导致pH不能回升而影响最终产量. 在半合成培养基中，苏云金杆菌在对数生长期由于利用葡萄糖产生丙酮酸、醋酸，pH 下降到4.8∼5.0，几小时后这些物质再次被利用，pH回升，芽孢和晶体开始形成. 如果对数生长期后pH不能回升而一直在6.0以下，芽孢和晶体都不能形成. 苏云金杆菌在芽孢形成的初始阶段，菌体合成一种胞外蛋白酶，参与伴孢晶体的蛋白质转化合成过程，而这种酶的合成和酶活性最适pH均为中性，pH在6.5以下或9.1以上该酶活性急剧下降，丧失形成这种酶的能力的变异株既不能形成芽孢也不能形成晶体[14].在培养基优化时要综合考虑碳氮比和营养物浓度这两个因素. 不同的菌种有不同的生理特性和相应的营养需求[18−20]. Farrera等[21]在培养基碳氮比为3∼11和培养基浓度60∼150 g/L条件下分别对苏云金杆菌HD−73实验，发现当碳氮比为7时，不同浓度条件下毒蛋白产量都是最高，而培养基浓度每增加2.5倍，毒蛋白量增加6倍，芽孢数则在碳氮比为4、培养基浓度为150 g/L时最多.一些微量元素对苏云金杆菌的发酵也有明显的作用. 苏云金杆菌生长繁殖过程中，糖的初级异化是通过E−M途径进入TCA循环的，因此KH2PO4是E−M−P途径中磷酸化过程不可缺少的物质；KH2PO4的缓冲作用有利于芽孢和晶体的形成[14]. 矿物质钙元素也是苏云金芽孢杆菌必需的元素. Ca2+在芽孢皮层形成时与DPA结合形成DPA−Ca复合物，促使形成不可逆热稳定芽孢，而且明显影响伴孢晶体的外蛋白酶的合成.苏云金杆菌培养基还可利用碳氮源丰富的工业废水进行生产[22−25]. 例如，味精厂高浓度有机废水本身含有丰富的氮源，酒糟废液中富含未被利用的碳水化合物、脂肪、灰份、氨基酸和多种维生素. 逐渐提高废水浓度和浓缩倍数的方法可使苏云金杆菌适应恶劣的废水培养环境，获得在废水中正常生长且具有高毒力单位的驯化菌株. 在使用废水前进行预处理也很重要，Maria等[26]以7种不同来源的废水交替作为生产苏云金杆菌的培养基，用作培养基的废水包括未经预处理、酸水解处理和水解污泥离心后的上清液，结果发现酸水解处理的培养基毒蛋白产量提高. 这样的发酵过程不仅节约能源，降低了生产成本，而且在治理环境的同时变废为宝.3.1.2 发酵条件目前苏云金杆菌的培养温度多采用(30±1)o C，温度低于28o C发酵的周期会延长，但温度超过37o C时伴孢晶体数量几乎为零. 苏云金杆菌在对数生长期要消耗大量的氧气，并相应释放出大量的热量[27]. 如果中断供氧，细胞停止生长，不能形成芽孢和晶体，最终导致细胞自溶. 通气量与供氧直接相关，增加通气量和搅拌速度可以加速氧传递、代谢物质的交换及热量的释放，具体的数值需根据发酵设备、容量、培养基成份和菌体不同的生长阶段确定.3.1.3 发酵方式液态发酵有分批发酵、补料分批发酵、连续发酵等方式. 分批发酵一次性投料和放罐，产品质量比较稳定，设备和操作技术水平要求不高，目前很多厂家都采用这种方式. 但要达到较高的发酵水平，需要使用高浓度培养基. 在一次性投料时，高浓度培养液容易产生基质和代谢产物的抑制，同时培养基的粘度增加后，由于影响混合和流动而不利于氧的传递. 苏云金杆菌是快速好氧菌，若氧气供应不足生长繁殖就会受到很大影响，因此单纯的分批发酵难以实现细胞的高密度培养. 连续发酵可以解决发酵中存在的这种问题. 由于一级连续发酵芽孢形成率低，研究者尝试使用第一级连续第二级间歇的二级发酵方法以及变温二级发酵. Acras等[17]用梯度连续流加的方法也使芽孢晶体增加1倍多. 但经过较长时间的连续培养后很容易染菌，菌种易发生退化，因此要实现大规模的连续发酵生产仍然存在很多问题，不仅有一定的设备要求，还需要较高的操作技术.补料高密度培养介于分批培养和连续培养之间，兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点. 多组实验表明[28]，在其它条件相同的情况下，补料发酵的细胞密度、晶体含量和毒力效价综合平均值高于分批发酵. 寻求最佳的补料时间和流加速率十分重要，对不同的物料和菌种及生产目的，可有多种方案. 在发酵过程中，淀粉首先被液化酶分解为低分子糖，再被利用. 发酵4∼8 h细胞吸收养份，个体增大并且分裂增殖合成蛋白质核酸，碳源等能源物质消耗较快. 针对葡萄糖的消耗情况，在发酵中可以适时适量地添加葡萄糖，在工业生产中也可以使用淀粉液化液达到同样效果. 补料发酵的需氧高峰相对平缓，在生长旺盛期较易避免溶氧低谷，对生产过程改善溶氧从而确保高密度培养具有实际意义[29,30].3.1.4 发酵设备苏云金杆菌的液态发酵设备主要参照传统的抗生素发酵生产模式建立. 发酵过程中的不同阶段耗氧速率各不相同，发酵过程往往会出现低于临界溶氧值的缺氧期，因此加快溶氧速率是工业生产中需要解决的问题. 使用传统的机械搅拌罐可以变速搅拌，在细胞增殖前期和后期采用低转速搅拌，中期采用高速搅拌，不同时期的最佳转速应根据溶氧曲线的变化进行调整[31]. 但机械搅拌罐受结构限制，罐体高径比小，不能较多地利用无菌空气中的氧气. 最近几年新出现的气升式发酵罐无机械搅拌装置，它利用空气作为搅拌动力，使罐内的不同区域形成密度差和宏观循环流得以混合. 它具有结构简单、无运动部件、无菌操作可靠性高、耗电少、造价低等优点，适合苏云金杆菌的发酵. 李稳宏等[32]将冷模实验中优化选择出的外环流气升式反应器与机械搅拌罐作平行实验，结果表明该工艺不仅操作方便、控温精度高，与普通的机械搅拌发酵罐相比，在规模和培养基等条件相同的情况下，发酵周期由42 h缩短到33 h，细胞密度增加了35%. 杨建州[33]的发酵实验表明，折流元件可改善环流反应器的发酵性能，并将研究结果放大到20 m3的气升式环流反应器中，与工厂同等规模的搅拌式发酵罐相比，在完全省去搅拌功耗又不增加空气用量的条件下，菌体密度在1010 ml−1以上，发酵液的毒力效价高于在机械搅拌式发酵罐内的发酵结果约10%，并且节电30%以上.３．２ 固态发酵 固态发酵起源于我国传统的“制曲”技术，是利用颗粒载体表面所吸附的营养物质来培养微生物. 在相对小的空间内，这种颗粒载体可提供相当大的液气界面，从而满足好气微生物增殖所需要的水份、氧气和营养. Mechalas[34]取得了苏云金杆菌的固体发酵专利权. 简单的固态发酵通常是将含有活芽孢的菌粉或种子液加入培养基，根据自然气候状态在网盘、大池或地坪进行半封闭的发酵，虽然成本低，但是设备简陋，条件粗糙，生产质量低. 随着人们对固态发酵苏云金杆菌特有优势的认识和研究的深入，这项技术逐渐成熟. 研究发现液体种子培养基初始pH值、种龄、发酵温度、固体培养基含水量、微量元素等都是影响芽孢形成和毒力效价的重要因素. 控制含水量可协调发酵过程菌体周围的气液环境，发酵基质中若含水量过大则芽孢、晶体游离晚，发酵周期延长；含水量少则扩散阻力使局部代谢产物积累过多，吸收不到营养物质，物料的高粘度还会影响通风和菌体对氧气的利用，减少了固态发酵液气界面的优势，导致发酵受到抑制. 其它条件如pH值、种龄、发酵温度等可借鉴液态发酵. 杨淑兰等[35]通过苏云金杆菌从实验室实验到百公斤级固体发酵实验，研究了适合苏云金杆菌HD−1固体发酵规模生产的各种条件.能用于苏云金杆菌固态发酵的原材料很广泛，但选择时既要考虑到材料的营养性，也要考虑到它的通气性. 通常可分为有机载体和无机载体. 有机载体如麦麸、米糠、黄豆饼粉、花生饼粉等，这些载体本身就是很好的碳氮源；无机载体如多孔珍珠岩、细沙等，这些则需要另外添加营养成份. 在使用时往往是根据需要结合起来，可以因地制宜地选择一些材料. 张怡等[36]尝试使用废次烟草为主要材料，与麸皮相比，可降低粘度，增加孔隙率. 但考虑到植物叶的挥发性物质对菌种生理生化的影响，还需对烟叶进行浸泡预处理. 啤酒糟作为主要原料也可用于苏云金杆菌发酵[37]. 研究发现不同原料对应的最佳含水量差异也很大.传统浅盘静止发酵存在诸多缺陷，固体物料的非均一性会带来温度、湿度、氧传递等问题. 苏云金杆菌在对数生长期会产生大量的热量，如何使发酵过程中所产热量及时排出，避免料层温度升高而影响菌体的生长和杀虫蛋白晶体等合成，需要设计科学合理的应用于苏云金杆菌的固态发酵设备. 压力脉动发酵[38]、全自动固体发酵系统、转鼓发酵、传送带移动式等发酵设备也在不断的研究和应用中，但目前适于大规模固态发酵的先进设备仍然缺乏，成为限制大规模固态发酵生产苏云金杆菌制剂发展的瓶颈.４ 产品的剂型 苏云金杆菌制剂常用的剂型包括以水为介质的水悬剂、以有机溶剂为介质的油悬剂和以固体填充剂为介质的可湿性粉剂. 近10年来还开发出了水分散性粒剂和胶囊剂等新剂型，已投入使用. 应该根据防治对象和所处生态环境选择方便储存和使用的剂型. 与化学农药相比，苏云金杆菌制剂安全性增强，但产品的稳定性差，残效期短，杀虫速度慢，而且受施用环境影响大. 解决这些问题除了使用合适的剂型外，还可以添加一些辅助剂. 为了增加田间残效，目前使用的辅助剂包括由液态发酵产品制成粉剂所需的吸附剂、使菌剂在表面展着的湿润剂、防止芽孢萌发和其它微生物生长的防腐剂、促进昆虫食欲的引诱剂、防紫外的保护剂，还有粘着剂、乳化剂和增效剂等[2].５ 存在问题及展望 苏云金杆菌制剂作为微生物农药，要取代化学农药，除了依靠人们生态意识的提高，更要从技术上达到高效价、低成本、规模化，从选育菌种、降低培养基成本、提高发酵控制水平、减少后处理过程中毒效损失等各环节优化.在发酵及后处理过程中，液态发酵和固态发酵存在各自的优势和缺点. 液态发酵的流动性好，有利于传质、传热和控制，但液态深层发酵在溶氧技术和设备方面还有改善的潜力，气升式反应器有望用于苏云金杆菌大规模液态深层发酵. 除培养基成本外，发酵液的后处理是制约苏云金杆菌液态发酵生产的重要因素之一. 常用的工艺是吸附−压滤法，加入大量碳酸钙作为吸附助滤的载体，占产品质量的80%∼90%，造成产品效价低、体积大. 还可采用离心、沉淀的方法，但离心工艺需投资高转速的离心设备，且上清液流失了很多有效成份，要求回收. 沉淀法简单，但回收效果差，污染环境. 加强发酵液后处理研究，提高有效成份回收率对液态深层发酵具有重要意义.同液态深层发酵相比，苏云金杆菌固态发酵以麸皮等为载体，发酵后可直接进行干燥、粉碎，步骤简单. 固态发酵在后处理过程中节省了能源，但产品存在湿润性能较差的问题. 国内大部分厂家使用麸皮为主原料，麸皮既是碳源，也是发酵载体，但麸皮粘度大，不利于通风散热，且亲水性差，导致有的产品湿润时间高达十几分钟，达不到三分钟以下的部颁标准. 需要寻找新的、廉价的、营养源丰富、通气好、湿润性能强的原料和载体，或选择合适的表面活性剂处理产品，以使在不影响发酵水平和毒力效价的情况下缩短湿润时间. 苏云金杆菌固态发酵的发酵工艺和设备目前普遍的状况是生产规模小、设备简陋、劳动强度大，由于人工操作造成产品质量不稳定，发酵过程产生的热量不能及时排出而影响了菌体生长和伴孢晶体的形成. 固态发酵正在逐步从浅盘发酵向深层发酵发展，从浅盘式半开放式发酵逐步发展成为全封闭、全自动固态发酵，生产过程逐渐实现计算机在线控制，有效地解决了固态发酵过程中的供氧、散热、湿度调节、防止污染等问题. 在物料准备、蒸料、接种、发酵及干燥等方面，采用连续蒸料、接种，使用洁净封闭式固态发酵设备，发酵、烘干过程在同一设备中顺序完成，形成完整的自动化生产流水线，可以大大改善生产环境，消除人为因素对产品质量的影响，提高产品毒力效价.苏云金芽孢杆菌液态发酵与固态发酵各有优点，应因地制宜地选择生产方式. 预计在今后一定时期内，苏云金杆菌的液态发酵与固态发酵将共存.参考文献：[1] Schnepf E, Crickmore N, V an Rie J, et al. 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苏云金芽孢杆菌发酵液浓缩工艺研究
苏云金芽孢杆菌发酵液浓缩工艺研究作者：周荣华，崔怡宁，饶彝，等来源：《湖北农业科学》 2015年第18期周荣华１，崔怡宁２，饶犇１，廖先清１，刘芳１，陈伟１（１．湖北省农业科学院生物农药工程研究中心，武汉４３００６４；２．武汉中学，武汉４３００６１）摘要：通过对２种不同亚种的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）发酵液进行浓缩工艺的研究，探索了不同温度对浓缩液有效成分的影响程度，比较了不同浓缩方式、不同干燥方式处理下有效成分的回收率。
结果表明，真空薄膜浓缩工艺的回收率要高于离心浓缩工艺２３％～２９％。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；真空薄膜浓缩；离心浓缩中图分类号：Ｑ８１３．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）18－4479-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.18.022ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｒｏｔｈＺＨＯＵＲｏｎｇ－ｈｕａ１，ＣＵＩＹｉ－ｎｉｎｇ２，ＲＡＯＢｅｎ１，ＬＩＡＯＸｉａｎ－ｑｉｎｇ１，ＬＩＵＦａｎｇ１，ＣＨＥＮＷｅｉ１（１．ＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏ－ｐｅｓｔｉｃｉｄｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ；２．ＷｕhａｎＨｉｇｈＳｃｈｏｏｌ，Ｗｕｈａｎ４３００６１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｄｅａｌｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｂｙｕｓｉｎｇｖａｃｕｕｍｔｈｉｎｆｉｌｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ２３％~２９％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｂｙｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；ｖａｃｕｕｍｔｈｉｎｆｉｌｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｂｙｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ收稿日期：２０１５－０６－１５基金项目：湖北省农业科技创新中心项目（２０１３ＮＫＹＪＪ２１）；国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ４０Ｂ０１）作者简介：周荣华（１９７５－），男，湖北武汉人，副研究员，硕士，主要从事发酵工程方面研究，（电话）１８６２７９８６１１６（电子信箱）ｚｈｏｕｒｏｎｇｈｕａ１９７５＠１２６．ｃｏｍ；通信作者，饶犇（１９８３－），男，湖北孝感人，助理研究员，博士，主要从事发酵工程方面研究，（电话）１５６２３０７６９６８（电子信箱）６２３２５３５１２＠ｑｑ．ｃｏｍ。
一种苏云金芽孢杆菌液体发酵培养基及发酵培养方法[发明专利]
![一种苏云金芽孢杆菌液体发酵培养基及发酵培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f4604d34e97101f69e3143323968011ca300f708.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011525927.9(22)申请日 2020.12.22(71)申请人 武汉科诺生物科技股份有限公司地址 430074 湖北省武汉市东湖开发区关南工业园(72)发明人 王猛 胡虓 万俊 黄芳 熊圆圆 夏建荣 张晓明 龚永华 徐广 霍瑞 刘守德 (74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231代理人 徐绍新(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/04(2006.01)C12R 1/07(2006.01)(54)发明名称一种苏云金芽孢杆菌液体发酵培养基及发酵培养方法(57)摘要本发明公开了一种防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌JQ23的液体发酵培养方法，该方法所使用的发酵培养基配方为葡萄糖30‑50g/L，黄豆饼粉25‑35g/L，花生粕5‑15g/L，蛋白胨10‑30g/L，酵母粉2‑5g/L，磷酸二氢钾0.2‑0.5g/L，硫酸铵0.2‑0.5g/L，氯化钙0.1‑0.3g/L，氯化锰0.01‑0.05g/L，其余为无菌水。
本发明培养的苏云金芽孢杆菌芽孢含量可达8.25×109cfu/mL，对2龄韭蛆幼虫3天的校正死亡率可达93％，且杂菌含量低，发酵液制备的悬浮剂常温下放置性能稳定，便于长途运输和长期保存。
权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 112501083 A 2021.03.16C N 112501083A1.一种苏云金芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，该方法包括使用培养基对苏云金芽孢杆菌种子液进行发酵培养的步骤，所述培养基的配方如下：葡萄糖30‑50g/L，黄豆饼粉25‑35g/L，花生粕5‑15g/L，蛋白胨10‑30g/L，酵母粉2‑5g/L，磷酸二氢钾0.2‑0.5g/L，硫酸铵0.2‑0.5g/L，氯化钙0.1‑0.3g/L，氯化锰0.01‑0.05g/L，其余为无菌水。
烟梗废料液态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选
烟梗废料液态发酵生产苏云金芽孢杆菌的适宜条件筛选李超;杜雷;席宇;郭灵燕;朱大恒【摘要】Using waste stems as material, the liquid culture medium formula of Bacillus thuringiensis HD-1 and fermentation conditions were optimized by shaking flask culture with orthogonal experiments.The results showed that the optimum culture medium formula was; basic liquid tobacco stem culture medium adding peptone 1.5％, yeast extract 0.4％ , glucose 0.5％, and di-sodiumhy drogerphosphate 0.1％.The preferable condition for fermentation was: volume of inoculation 1％, pH 7.0, temperature 30 ℃ and shaker speed 180 r/min.The production method of Bacillus thuringiensis insecticide by tobacco stem fermentation is feasible, it opened up a new usage for tobacco waste.%以烟草废料烟梗为原料,采用正交组合设计方法,对苏云金杆菌HD-1菌株(Bacillus thuringiensis HD-1)的液态发酵培养基配方和发酵适宜条件进行摇瓶优化筛选.结果表明,烟梗液态发酵培养基的最佳组合为:烟梗液态基础培养基添加1.5%的蛋白胨,0.4%的酵母膏,0.5%的葡萄糖,0.1%的磷酸二氢钠.发酵适宜条件为:接种量在1%,pH 7,温度30℃,摇床转速180 r/min.烟梗发酵生产苏云金芽孢杆菌杀虫剂的方法是可行的,为烟草废料的循环利用开辟了新途径.【期刊名称】《烟草科技》【年(卷),期】2011(000)003【总页数】4页(P69-71,76)【关键词】烟草废料;烟梗;苏云金芽孢杆菌;正交组合设计;发酵【作者】李超;杜雷;席宇;郭灵燕;朱大恒【作者单位】郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号,450001;郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号,450001;郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号,450001;南阳普康药业有限公司,河南省南阳市工业路143号,473050;郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号,450001【正文语种】中文【中图分类】TS49生物杀虫剂具有原料来源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的重点。
苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)发酵液的浓缩工艺研究
苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)发酵液的浓缩工艺研究陈伟; 廖先清; 刘芳; 饶犇; 周荣华【期刊名称】《《湖北农业科学》》【年(卷),期】2019(058)022【总页数】3页(P111-113)【关键词】苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsP. israelensis); 真空薄膜浓缩; 离心浓缩【作者】陈伟; 廖先清; 刘芳; 饶犇; 周荣华【作者单位】湖北省生物农药工程研究中心武汉 430064【正文语种】中文【中图分类】Q813.1苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp．israelensis，简称Bti）是 Goldberg 和 Margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌。
自发现以来，人们利用Bti制剂为控制蚊媒病的传播进行了大量工作。
目前Bti常规的生产方法是采用相关的芽孢杆菌生产菌种，分批发酵培养，至其大部分或者全部形成芽孢时，采用板框过滤或者离心的方式进行浓缩，添加助剂后烘干或者喷雾干燥得到芽孢杆菌的活菌制剂［1-5］。
这些方法存在着严重的不足，发酵液的浓缩采用的絮凝／板框过滤或者离心技术一般都会产生大量的废水，后续处理成本较高；采用絮凝／板框过滤或者离心技术还会造成发酵液上清里的有效成分丢失，产品质量下降。
而且传统的絮凝／板框过滤或者离心浓缩方法会产生大量生化需氧量（BOD）很高的废水，需要进行复杂的处理才可能达到排放标准。
因此，有必要对芽孢杆菌发酵液后处理的工艺进行研究，以达到提高后处理过程中芽孢及其所产生的活性物质的收率，减少后处理工艺所产生的废水泊BOD［6-12］。
而采用真空薄膜浓缩后，优点在于直接浓缩发酵液，相比于传统的絮凝／板框过滤或者离心浓缩方式，发酵液中可溶性的增效物质、促生物质、抑菌活性物质等得到有效回收。
低温浓缩过程中产生的冷凝水，生化需氧量极低，一般在80以下，达到排放标准。
苏云金芽孢杆菌作业
发酵工艺学作业题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展学院班级学号姓名苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。
本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。
并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。
关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward.Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward前言生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。
生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。
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有效组份的含量 以提高产 品和品质 。
１ 材 料 和 方 法
重， 并观察伴孢晶体 ８ ％脱落时结束培养 ， ０ 取样检测生物效价 和晶体 含量并计培养周期。比较各方案 的差异。
１ ．．补料发酵实验 ． ２３ ４ 配 １Ｌ培养基 ，含 ４ ０ ％葡萄糖 ，％蛋 白胨 ，． ４ ２５ ％酵母水溶
主要 杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白 ，是在菌体形成芽孢的 同 时形成 的 ， 正常情况下一个菌体可产生一个伴孢 晶体蛋 白。 因 此 ， 充分 利用企业 中现有的设备和条件 ， 如何 延长对数 期增 加
菌体量是提高产品产量 和品质 的关键点 。现行的生产 方法主 要是分批液体发酵法生产 ， Ｂ 不 断深入 的研究 和生 产水平 对 ｔ 不断 的提高 ， 分批发酵法生产水平 逐渐达到 了极 限， 实验通 本 过对培养基及发 酵＿艺 的改进在保持单位效 价不变 ，降低非 丁
１１苏云金 芽孢杆菌 ： Ｃ ９ 或 ＨＤ １ ． Ｇ 一１ 一
１ ． 养基 ： ％葡萄糖 ，％蛋 白胨 ，． ２培 ４ ４ ２５ ％酵母水 溶性浸 出物 ， ０５ ．％无机盐混合 １ ． ３实验仪 器 ：Ｄ — Ａ Ｅ凝胶 系统 、 ＳＳＰ Ｇ 定氮仪 、 分析 天平 、 高速
离心机 、 旋转摇床 、 微型全 自动发酵罐
表 １ 试 验 因 子 不 平 数 据
２ ｈ时的菌体湿重 ， 伴孢 晶体 ８ ％脱落时结束培养 ， ４ 在 ０ 取样检 测生物效价 、 还原糖和晶体含量。比较其差异 。
１ ． 发酵罐发酵实验 ．３ ４ 配 １Ｌ培养基 ，含 ４ ０ ％葡萄糖 ，％蛋白胨 ，． ４ ２５ ％酵母水 溶
性浸 出物 ，．％无机盐 混合液在微 型全 自动 发酵罐 中 １０Ｃ ０５ ２ ￣
发酵周期 中使用恒搅 拌转速培养 ，在对数 中后期溶解氧 有两三个小时的时间处于极低状态 ，此时分别通过调节搅拌 速度使溶解氧最低值 控制在 １ ％、．％、．％三个浓度水平 ， ． ３０ ４５ ５
１ｈ取样测菌体湿重 ，４ 取样测定生物效价和晶体含量 。 ８ ３ｈ １ ．２培养温度影响实验 ．２ ４． 方案 Ａ 控制培养 温度 ２ ￣ 恒温培养 ； ７Ｃ， 方案 Ｂ 控制 培 养温度 ３ ￣ 恒 温培养 ； ０Ｃ， 方案 Ｃ 控制培 养 １２ ｈ温度 ３ ￣ －０ ０Ｃ， ２ ｈ ３ ￣培养 ，从 ８ ０ 后 ３Ｃ ｈ至 ２ ｈ每两 个小 时取样测 量菌体湿 ６
１． ．７伴孢晶体含量测定［ ４ ４ １ 性浸 出物取 ４个水平 ， 进行发酵 ， 研究 Ｂ 生产 的适 宜培养配 ｔ 方（ 见表 １ ｏ摇瓶培养发酵 ， 在培养 ２ ｈ和 ３ ｈ取样涂片观察 ４ ８
收 稿 日期 ：０６ １— １ ２０ — ２ １
实罐来灭菌 ３ ｍ ｎ 按一定接种量将种子接入培养基 中 ， ０ ｉ， 在一 定 的温度下进行培养 ， ０ ｒ ｎ 培养时间 ３ ｈ ３０／ ， ｍｉ ５。
１ ． ｐ 的测 定 １ ．４ Ｈ ４ ２ ］
１． ．５生理形态观察方法 ：６ ０倍光学显微镜 观察 ４ １０
１ ． 生 物 效 价 测 定 ．６ ４
苏云金芽孢杆 菌液体发 酵的研 究
廖湘萍 － 易华蓉 － ， ， 杨翠垆
（． １ Leabharlann 北轻 工职业技术学 院 ４ ０ ７ ； ． 中科技大学武 昌分校 ４ ０ ７ ） ３ ０ ０２ 华 ３００ 、
摘 要： 对苏云金 芽孢 杆菌发酵清液进行 了工 艺条件优化研 究 ， 通过试 验确定其适 宜发 酵工艺条件为 ： 溶解氧
１ ． ４实验 方 法
性 浸出物 ，．％无 机盐混合 液在微型全 自动发酵 罐 中 １０Ｃ ０５ ２ ￣ 实罐来灭 菌 ３ｒｉ，０Ｃ ０ ｎ ３ ￣恒温培养 ， ａ 控制搅拌转速使 溶解 氧水
平 不低于 ３０ ． ％。在 １ｈ时补加 ２ ３ ％和 ４ ％的葡萄糖液 ，测量
１ ． 发酵培养基优化实验 ．１ ４ 通过预试验 、 因子试验 ， 单 确定 葡萄糖 、 白胨 、 蛋 酵母 水 溶性浸 出物 ３个 因子 ， 葡萄糖 、 白胨取 ６个水平 ， 蛋 酵母水 溶
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第３卷 第３ ４ 期
２ ００ ７ 年 ５ 月
酿
酒
Ｖｏ ．４ № ． １３ ． ３ Ｍ ａ ， ２０ ７ ｙ ０
ＩＩ ＮＧ ＬＱ ＯＲ Ｍ Ａ （ ＩＵ
文章编号：０ ２ ８ （０ ７ ０ — ０ ３ ０ １０ — １０ ２ ０ ）３ ０ ５ — ３ １