实验一 苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测

做回复突变的对照。
6）往第二支HSA试管中加0.1ml rII 26(1x109/mL),混 合好后倒“26x”平板，其它的噬菌体均以相同的 方式倒好平板。
7）将噬菌体26，28，29分别进行10倍稀释。 8）用接种环或用移液器吸取3-5l各种稀释后的噬菌
体悬液（1x108/ml），小心点到每一平板相应的 位置上。
微生物遗传部分
实验四、T4噬菌体基因组rII 区域不同基因突变的互补
导语
▪ T4是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因 组是双链线性DNA分子，约有1.7x105碱基对，编码的蛋 白质超过135种。T4基因组的两端具有约3～6kb的正向重 复序列，全长比其头部长650倍，意味着T4 DNA是高度 螺旋、紧密折叠地装配在头部中。T4基因组rII区域有2个 基因rIIA和 rIIB，这2个基因突变均表现为快速溶菌，这 种快速溶菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择 性：突变型若感染E.coli C菌株，可以形成大而透明的噬 菌斑，因此将E.coli C菌株称为受纳性寄主；突变型若感 染E.coli K菌株，则不能复制其DNA,因此不能形成噬菌斑， 因此将 E.coli K菌株称为限制性寄主。S.Benzer巧妙地 利用这一特点设计了经典的互补实验，首次证明顺反子 （Cistron即基因）是一个必须保持完整才具有正常生理 功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或一个顺反子 是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个突变型不能 互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们属于不同的 基因突变，影响的不是同一功能。
三、实验材料和用具
▪ 菌种：E.coli C(受纳性寄主)和 E.coli K （限制性菌株）过夜培养物
▪ T4 rII突变型26，28，29：点样浓度为 1x108/ml,倒平板浓度为1x109/ml
▪ HA平板9块（效价测定用5块） ▪ HSA试管 3mL x 9只 ▪ 20l、200l移液器各一支，Tip ▪ 48 oC水浴
（二）裂解液效价测定
▪ 将E.coli C 接种3mL HB中，37℃震荡培养5小时。 ▪ 制备HA平板，待凝固后置50℃ 烘30分钟备用。 ▪ 将T4裂解液依次稀释至10-7 。 ▪ 取一只小试管，加入0.2mL E.coli C，加入T4裂解
液0.1mL（10-6，10-7），每个稀释度两只试管， 再加入2.5mL HAS（50℃左右）， 混合均匀后迅 速倒在HA平板上层，凝固后，37℃倒置培养。 ▪ 培养6小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效 价。 ▪ 检测回复突变，取一只小试管，加入0.2mL E.coli K，加入T4裂解液0.1mL（10-5），再加入2.5mL HAS（50℃左右）， 混合均匀后迅速倒在HA平板 上层，凝固后，37℃倒置培养。
▪ 将一系列表型相同的rII突变型,双双混合感染限制性宿主进行 互补实验，全部 rII突变型可以区分为 rIIA和rIIB两个互补群， 同属于rIIA或rIIB的两个突变型在混合感染中没有互补作用， 任何一个rIIA突变型和任何一个rIIB突变型在混合感染中都有 互补作用，使表型恢复正常。一系列rIIA突变型在染色体上 所占的区域称为顺反子A，一系列rIIB突变型在染色体上所占 的区域称为顺反子B，由于rII突变型均为点突变，故实验中 必须要有检测回复突变的对照。
导语
▪ 自从1917年发明在平板上观察噬菌斑（plaque）的方法后 一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的 多少。100个细菌在平板上会形成100个菌落，若108个细 菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为“lawn”， 为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热的 液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂称 为Top agar或 Soft agar，它会迅速凝固形成一个光滑的表 层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有1个噬菌体 存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放 100～200个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此 延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃 光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为plaque, 因为1个噬菌体形成1个plaque，故噬菌体的浓度便可以计 算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示： PFU/mL。
导语
▪ T4噬菌体是一类专性寄生的原核生物， 只能在寄主细胞内繁殖。噬菌体比细菌繁 殖速度快得多，典型的细菌一般在30min 内由1个变为2个，而1个T4噬菌体在相同 的时间内可以形成将近100个左右的子代 噬菌体，因此2h后当细菌和噬菌体都繁殖 了4代时，细菌的数目是24＝16，而噬菌 体的数目却是1004＝108！
（一）噬菌体T4裂解液的制备
▪ 2．液体法制备裂解液 ▪ （1）将E.coli C 接种3mL HB中， 37℃
震荡培养2~3小时。 ▪ （2）加入1%体积的 T4储存液（或单噬
斑1个），继续震荡培养5小时，一般应测 OD600 值，当OD值下降又回升时停止培 养。
▪ （3）加2~3滴氯仿，震荡半分钟， 4000rpm离心15分钟，取上清液加几滴氯 仿，置4℃冰箱保存备用。
一、实验目的
▪ 通过实验了解基因互补的原理，并确定几 个T4快速溶菌突变是否属同一基因突变。
二、实验原理
▪ 将2个不同的T4 rII突变型共同感染限制性寄主E.coli K菌株, 若2个突变的噬菌体不是影响相同的功能,则可表现互补使其 各自的DNA在E.coli K菌株中得以复制,在复制过程中相互重 组,进而形成了野生型的噬菌体, 野生型的噬菌体经反复感染 和裂解限制性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。
实验注意事项：
▪ 点样时应小心勿将琼脂划破！
▪ 各种噬菌体的点样位点必须有一 定间隔，防止连成片不易分析结 果！
▪ 点完样后不要立即翻动平板，待 所点样品完全干后，再倒置平板 培养！
五．实验报告：
▪ （一）实验结果用+或表示，如点样位置 上有较多的噬菌斑则为 ，无噬菌斑则为 ，但要与对照平板比较，检查每一 rII突 变型单独感染K菌株是否形成噬菌斑，记 录下观察的实验结果。
（三）互补实验
1）取E.coli K，接种于HB培养基，37oC， 180rpm振荡培养过夜。
2）首先制备好4块HA平板，将装有HSA （软琼脂）的试管置于48oC水浴保温。
3）在每一HA平板的底部预先标记好以下内 容： No phage, 26X, 28X, 29X
（三）互补实验
4）在每支HSA试管中加0.2ml E.coli K过夜培养物。 5）将第一支HSA试管倒到“无噬菌体”的平板上，用
▪ （二）分析各T4噬菌体基因组rII突变型的 基因互补关系，依据实验结果确定噬菌体 26、28分别为哪一基因突变。
六．思考题
1）互补实验的意义。 2）两个不同基因突变的T4噬菌
体所发生的互补是基因产物 的互补，为什么发生互补后 会形成野生型的T4噬菌体？
四．实验方法和内容
（一）噬菌体T4裂解液的制备
▪ 1．双层平板法制备裂解液 ▪ （1）将E.coli C接种3mL HB中，37℃ 震荡培养5—6小时。 ▪ （2）制备HA平板，待凝固后置50℃ 烘30分钟备用。 ▪ （3）取小试管一只，加0.5mL菌悬液，加0.2mL浓度为105～
106的 T4储存液，再加入3mL 50℃ 左右的HSA（软琼脂培养 基），混合均匀后倒在HA平板上层，凝固后37℃培养过夜。 ▪ （4）用涂棒 将HA平板上层软琼脂刮入离心管，加入3mL HB， 静置30分钟，加2—3滴氯仿，剧烈震荡半分钟。 ▪ （5）4000 rpm 离心15 min，取出上清液，加几滴氯仿，4℃ 冰箱保存备用。