抗凝血杀鼠药的分析研究进展

抗凝血杀鼠药的分析研究进展
严慧
【摘要】Anticoagulant rodenticides are chronic toxicants that are widely used in rodent control. They are highly effective rodenticides that kill rats and mice with high palatability and no resistance comparing with acute rodenticides such as tetramine. With the advancement of constant research on anticoagulant rodenticides and the use of new technology, progress achieves in the analysis of anticoagulant rodenticides, especially in biological samples. We summarized the progress on the analysis of anticoagulant rodenticides in order to provide references for analytical toxicologist.%抗凝血杀鼠药是目前广泛使用的一类慢性杀鼠药，与急性杀鼠药如毒鼠强相比，该类鼠药具有适口性好、不易被鼠拒食等特点，杀鼠效果显著。

随着对该类药物研究的不断深入和新分析技术的使用，抗凝血杀鼠药的分析，尤其是难度较大的生物体内该类鼠药的分析研究取得了较大进展。

本文就抗凝血杀鼠药分析的研究进展，结合各种研究成果做一综述，为法医毒物分析工作者提供参考。

【期刊名称】《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(038)004
【总页数】6页(P361-366)
【关键词】抗凝血；鼠药；分析；华法林
【作者】严慧
【作者单位】司法部司法鉴定科学技术研究所法医毒物化学研究室-上海市法医学
重点实验室,上海200063
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.2
杀鼠药(rodenticides)分为急性和慢性两类。

急性杀鼠剂由于容易引起鼠类拒食和产生耐药性,长远灭鼠效果差,对人和禽畜不安全,且会引起二次中毒,许多药物如氟乙酰胺、氟乙酸钠、毒鼠强和甘氟等无特效的解毒药,国家早已明令禁止使用和生产。

目前毒饵灭鼠主要使用慢性抗凝血杀鼠药,人畜一旦误食中毒,维生素 K1为特效解
毒药。

为给法医毒物分析工作者提供资料参考,我们将该类药物的分析研究进展进
行了综述。

抗凝血杀鼠药概况抗凝血杀鼠药是以4-羟基香豆素(溴敌隆、大隆、杀鼠迷、氯灭鼠灵、鼠得克、氟鼠灵和华法林)或茚二酮(敌鼠、氯鼠酮)母体结构衍生而来的一
类杀鼠药。

第一个市场化的产品(华法林)同时被用作杀鼠药和预防性治疗血栓栓塞疾病的药物,华法林的大量使用导致一些啮齿动物产生耐药性,随后活性更强、更新
的杀鼠药问世。

第一代抗凝血杀鼠药(华法林、杀鼠迷、氯灭鼠灵、敌鼠、氯鼠酮、杀鼠酮)在啮齿动物食用数天后起作用,但是第二代抗凝血药物(溴敌隆、大隆、杀它仗、硫敌隆)单次服用后就起作用,同时药物对啮齿动物增强的功效也是与增加的毒性相关联,大隆对大鼠的急性口服LD50值(0.27mg/kg)仅为杀鼠迷的1/60,值得注意的是该类药物体内代谢较慢,如氟鼠灵的半衰期长达220天[1]。

随着此类杀鼠药的广泛使用,家畜、野生动物、人中毒情况也时有报道。

抗凝血化合物会破坏维生
素 K循环,人或动物接触抗凝血杀鼠药后,可能会出现以下中毒症状:鼻出血,牙龈出血,尿液和粪便中带血,血管破裂引起淤伤和皮肤损害。

抗凝血杀鼠药的检测抗凝血杀鼠药的检测可以为中毒判断提供依据,还能提供一些关于这个化合物的信息,例如可能的中毒源(药物、植物和灭鼠剂),为中毒案件的应
急处置以及预防提供技术支持。

另外,对生物样品中抗凝血杀鼠药的监测对于治疗
过程(涉及到抗凝血药物通常是1～5周)、治疗成本都是至关重要的。

目前国内外对体内抗凝血药物的检测主要有分光光度测定法、气相色谱法(GC)、
薄层色谱法(TLC)[2]、高效液相色谱法(HPLC)[3-6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[7]、液相色谱-电喷雾质谱法(LC-ESI-MS)[8]、淋洗液在线发生免试剂离子色谱-电喷雾质谱法(RFIC-ESI-MS)[9]、液相色谱-大气压化学电离质谱法(LC-APCI-MS)[10-11]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)[12]。

在这些检测方法中,分光光度法检测灵敏度较差,气相色谱法前处理耗时长,复杂的衍生化过程会对定量过程造成影响。

高效液相色谱法可以准确检测μg/mL、μg/g浓度级别的样品,在抗凝血杀鼠药的
检测中广泛应用,但色谱保留时间作为唯一定性指标缺乏足够的选择性,可能会导致
假阳性结果。

LC-MS法结合色谱分离与质谱结构确证的优点,无需耗时的衍生化过程,定性和定量分析的准确性与灵敏度都比其他方法要高。

表1为以往中毒案例中
抗凝血杀鼠药阳性检测数据及相应的检测方法。

由表可知体内抗凝血杀鼠药含量极低,对检测方法和前处理方法都有很高的要求,氯鼠酮和溴敌隆是欧盟国家引起动物
中毒的最常遇到的抗凝血药物[13],而结合系列案例报道和本所日常检案发现我国
引起动物或人中毒最常遇到的抗凝血杀鼠药为大隆和溴敌隆。

Fourel等[13]对79个可疑的药物中毒案例进行了测定。

55只接触过抗凝血药物
的动物中53只血浆中检出抗凝血杀鼠药,24例未接触过抗凝血药物的动物血浆中
均未检出抗凝血杀鼠药。

试验的灵敏度(96.3%)高、特异度(100%)好,没有假阳性
结果。

有两只狗意外摄入含杀鼠药饵料但血浆中未检测到药物,可能因为它们接受
了兽医治疗,即在误食2h后催吐,所以只有有限的抗凝血药物被口服吸收。

而另一
只狗在催吐并经过维生素 K治疗后,仍从其血浆中检测到很低浓度的噻鼠酮。

药物代谢动力学研究 Vandenbroucke等[23]对小鼠单次口服抗凝血杀鼠药进行了药物代谢动力学研究,单次口服鼠得克0.4mg/kg后1周内小鼠血浆中药物浓度快
速下降,直到第21天仍能检出(最低检出限0.45ng/mL)。

另有其他学者对抗凝血杀鼠药进行了一系列动物实验:母鸡单次口服华法林10 mg/kg后,收集其服药后2周生产的鸡蛋,分别测定蛋白和蛋黄的华法林浓度,发现蛋白中华法林浓度从第1天至第3天降低,4天后低于检测限;蛋黄中华法林浓度先升高,第5天达到峰值,然后一直下降至第14天的16ng/g[24]。

实验家兔2只,体重为2.5kg,分别灌服杀鼠迷或华法林0.5g后肝脏中杀鼠迷含量为11.2μg/g,华法林含量为9.7μg/g[25]。

实验兔
2只,体重分别为2.0和2.7kg,分别灌服杀鼠迷和华法林 0.5g,于 3、6、12、24、36h 后取血测定 ,测定值分别为 98.6、182.3、60.2、15.2、5.4μg/mL(杀鼠迷)和90.6、140.0、40.3、11.0、3.4 μg/mL(华法林),48h后兔血杀鼠剂含量在检出限
以下(杀鼠迷及华法林的最低检出限分别为15μg/mL及12μg/mL)。

封世珍等[26]取2.5kg正常家兔,连续2天将华法林分多次拌入食物中,以自然进食方式投毒,共拌入药物2.5g(96%),未见家兔有中毒症状出现。

家兔第一次服药后48h时打空气针处死。

4日后,解剖取胃内容、胃组织、肝组织和血液,测得华法林含量分别为76.1、203.2、35.7μg/g和12.3μg/mL。

大鼠口服50μg敌鼠,3.5h血液中敌鼠浓度
(n=6)为(320±51)ng/mL[11]。

大鼠(n=5)口服敌鼠1.0mg3h后,血液中敌鼠浓度
为(7.8±2.6)μg/mL[6]。

体重25g左右小鼠5只,溴敌隆0.2mg灌胃,2天后全部处死,测得其血和肝内平均含量分别为0.28μg/mL和0.79 μg/g,肝中含量明显高于
血中含量[27]。

与实际中毒案例数据相比,许多实验中动物体内抗凝血杀鼠药浓度
明显偏高,可能过去的研究受到检测方法灵敏度的制约,动物实验摄入药物剂量与实
际中毒案例相比明显偏高。

华法林是第一代抗凝血杀鼠药,同时也是最常用的一种预防静脉和动脉血栓栓塞药。

虽然华法林使用是两种立体异构体(S和R)消旋混合物,S型是造成抗凝血作用的主
要原因,且S型比R型半衰期更短,两者之间的关系可以给上次给药时间提供线索。

该药抗凝血作用的监测主要是通过分析凝血酶原复合物(国际标准化比值,INR)得到。

INR值在2和3之间的30个患者血浆中S-华法林稳态血浆浓度为
(360±157)ng/mL,R-华法林稳态血浆浓度为(765±224)ng/mL,S型/R型平均比值为0.47±0.14[28]。

表1 中毒检材中抗凝血杀鼠药检出品种、浓度及检测方法Tab1 Concentration
of anticoagulant rodenticides in biological specimen and detection method+:Detected;-:Nodata;LLE:Liquid-liquid extraction;SPE:Solid phase extraction.Drug Subject Specimen Concentration(ng/mLorng/g) Sample preparation Detection method Limit of quantification(ng/mLorng/g) Reference Brodi facoum Animal Liver 15 SPE(Methanol,Dichloro methane) IC-FL 5 [14]Brodifacoum Dog Blood 14 LLE[5%
(V/V)ethanolinethylacetate],SPE[acidicdichloromethane(0.5%glacialaceticac id),acidicmethanol(1%glacialaceticacid)]HPLC-FL 1 [15]Brodifacoum Human Plasma 860 -- - [16]Bromadiolone Human Blood 1.2-51
LLE(ethylacetate) LC-MS-MS 0.5 [12]Bromadiolone Human Gastriccontents + SPE(ethylacetate) LC-MS - [17]Bromadiolone Animal Plasma 10-296(n=32) LLE(30%-40%methylenechloride,10%-
20%heptaneand30%-40%zincchloridee) LC-MS-MS 25
[13]Chlorophacinone Coyote Serum 40 LLE[5%
(V/V)ethanolinethylacetate],SPE[acidicdichloromethane(0.5%glacialaceticac id),acidicmethanol(1%glacialaceticacid)]HPLC-DAD 25
[15]Chlorophacinone Human Blood,urine,gastriccontents 9400,6800,4800 LLE[diethylether-etheracetate(50/50,V/V)] HPLC 50 [18]Chlorophacinone
Cow Blood 2800 LLE(dichloromethane) HPLC-UV -
[19]Chlorophacinone Lamb Blood 140 LLE(dichloromethane) HPLC-UV - [19]Chlorophacinone Animal Plasma 10-667(n=17) LLE(30%-
40%methylenechloride,10%-20%heptaneand30%-40%zincchloride) LC-MS-MS 10 [13]Coumatetralyl Human Urine
33.0±3.0,19.0±1.2,10.0±0.7,6.5±0.6,15.0±0.9 SPE[methanol-methyltert-butylether(10/90)] HPLC-DAD 5 [20]Dicoumarol Animal Plasma 48 LLE(30%-40%dichloromethane,10%-20%heptaneand30%-40%zincchloride) LC-MS-MS - [13]Difenacoum Animal Plasma 55 LLE(30%-
40%methylenechloride,10%-20%heptaneand30%-40%zincchloridee) LC-MS-MS 10 [13]Difethialone Animal Plasma ＜10 LLE(30%-
40%methylenechloride,10%-20%heptaneand30%-40%zincchloridee) LC-MS-MS 20 [13]Diphacinone Dog Liver 15.1 LLE[methanol-acetonitrile(10/90,V/V)]andSPE(methanol,dichloromethane) IC-MS 0.3 [9]Diphacinone Duck Liver 10.3 LLE[methanol-
acetonitrile(10/90,V/V)]andSPE(methanol,dichloromethane) IC-MS 0.3 [9]Diphacinone Human Serum 412 SPE(methanol) IC-MS-MS 0.2 [21]Fluindione Human Plasma 1643 LLE(30%-
40%methylenechloride,10%-20%heptaneand30%-40%zincchloride) LC-MS-MS 20 [13]Pindone Human Serum 143 SPE(methanol) IC-MS-MS 0.2 [21]Valone Duck Liver 1.8 LLE[methanol-
acetonitrile(10/90,V/V)]andSPE(methanol,Dichloromethane) IC-MS 0.3 [9]Valone Human Serum 14.7,401.3 SPE(dichloromethane) IC-MS-MS 0.5 [22]
药物与环境相互作用为提高消灭鼠害的效率,尽量避免对人畜的伤害,许多学者对抗凝血鼠药的累积效应、施放方案以及对动物、人和环境的影响等进行了研究。

因为抗凝血杀鼠药适口性好,没有强烈的中毒症状,一般不会引起鼠拒食,老鼠通常会连续食用饵料1周甚至更长的时间。

杀鼠药在野外环境下可能会受到天气因素(光线、温度、降雨)发生降解,经过操作、使用或自动灌溉而损失。

Ramey等[29]对实验室和野外条件下粉碎的氯鼠酮燕麦鼠饵的耐候性进行研究,考察了美国加利福尼亚州北部用于控制地松鼠的现场放药的耐候性,使用的是一种已登记的饵料,粉碎的燕麦中包含0.01%氯鼠酮。

作为对照,实验室测试在一个洞穴环境中进行,模拟一些观察到的气候情况。

野外测试在紫花苜蓿地的3种环境下进行,每一种都放置了混有杀鼠药的饵料,与对照组作相同处理,试验区域用绳网保护起来,保护饵料不被鸟或哺乳动物吃掉。

一号饵料置于在湿环境中,1周后氯鼠酮损失71%,二号置于更干燥的条件下,氯鼠酮损失57%,三号置于非常湿的环境中,紫花苜蓿地被高处的洒水车灌溉24h后,氯鼠酮损失92%。

这说明饵料不宜放置在自动喷洒路线上。

实验室测试中对照环境条件下氯鼠酮损失约50%(光线为16h白天和8h黑夜,平均相对湿度为98%,温度11.1～27.88℃)。

水重校正后环境洞穴中氯鼠酮数量更少(第7天37%),饵料中氯鼠酮账面漏失(apparentloss)的增加可能是由于光降解作用或表层氯鼠酮的掉落。

鉴于气候等因素对抗凝血杀鼠药的影响,每次放出小量饵料,增加投放次数,尽量让饵料避免紫外线光照、风吹雨打或其他环境降解因素可以提高灭鼠效率。

抗凝血杀鼠药在食物链的转移以及对非目标种属如鸟、食虫动物、哺乳动物相应的风险与不同生态环境中化合物的天性密切相关。

除了气候因素,野鼠对饵料的储存也是一个重要因素。

溴敌隆在高浓度饵料(如12mg/kg)可以保持80天以上[30]。

野鼠可能会食用储存的饵料,掠食者的风险也有一个延迟效应。

杀鼠药的累积和反复使用可能会引起本地土壤有机物状态的改变,尤其是其中的生物学和化学反应成分——腐殖质。

腐殖质是最重要的土壤组成成分,影响农药在土
壤-水-有机体系统行为和表现。

腐植酸(HA)与土壤中农药相互作用的多种途径中,
吸附是最相关的,吸附过程中结合机制主要是取决于地下水和相互作用的种属化学、结构、功能性质。

André等[31]利用色谱方法分析了抗凝血杀鼠药和腐植酸的吸附机制,发现腐植酸可以吸附在C18固定相,而杀鼠药都可以吸附在吸附于C18固定
相的腐植酸上,且腐植酸加入介质后,杀鼠药对人角化细胞的毒性有不寻常的增加。

其后的研究则表明杀鼠药的毒性与介质中游离杀鼠药(如未与腐植酸结合的杀鼠剂)之间相关联,腐植酸可以保护人肝癌细胞系 HepG2抵抗灭鼠剂的细胞毒性。

他们
用迎头法分析抗凝血杀鼠药与土腐植酸的结合常数,同时测定了未与 HA结合的杀
鼠药浓度。

结合常数由大到小排列顺序如下:溴敌隆＞大隆＞鼠得克＞氯鼠酮＞敌鼠,实验表明敌鼠对HepG2细胞产生巨大毒性而预定浓度的大隆没有改变细胞的
生存能力[32]。

药物与机体相互作用华法林是最常用的一种预防静脉和动脉血栓栓塞药,但其治疗窗非常狭窄,治疗过程中必须反复监测INR值,因为达到理想的INR值所需要剂量
差异很大,患者间周剂量的差异可以达到20倍。

Osman等[33]研究了141名华法林治疗患者的 INR值与华法林浓度之间关系,发现INR和S-华法林浓度之间相关
性很低,与之前的研究结果一致[34]。

大部分的个体差异都是由于药物的肝代谢、
伴随的药物治疗、随食物摄入的维生素 K的差异造成的。

少数情况下,维生素 K拮抗剂的耐受是由于维生素 K环氧化物还原酶复合物(VKORC1)发生突变引起的。

如果华法林浓度很高仍未到达治疗INR值,很可能是由于VKORC1突变造成的。

华法林与其他药物同时使用时,其药效学和药代动力学可能受到其他药物的影响,必
须关注个体凝血功能,严格控制药物剂量。

例如一种活血祛瘀药(Kangen-
Karyu,KGK)常与华法林一起产生协同抗凝血作用,但过量的 KGK会抑制华法林的
代谢和消除,延长凝血时间[35]。

卡马西平与华法林同时使用时,血浆中华法林代谢
物显著升高,华法林的清除率也升高[36]。

R,S-华法林通过CYP-450酶系代谢为对映选择性和区域选择性代谢物,药理活性强的S-华法林主要通过CYP-4502C9代谢为S-7-羟基华法林,R,S-华法林可以当作
许多CYP亚型的代谢探针。

而CYP异型的遗传性多态可能与一些重要治疗药物(如氨磺)的肝代谢变化有关联。

Szutowski等[37]应用体内华法林模型来评估5-和8-甲氧基补骨脂素(MOP)对大鼠CYP亚型活性的抑制。

大鼠摄入30mg/kg外消
旋华法林后,计算从0至5h血清中R-和S-华法林及其代谢物浓度-时间曲线下面
积(AUC),每只大鼠R-和S-华法林代谢动力学测量3次:7天抑制疗程的前一周,给
予最后一次抑制剂后3h,抑制剂停用后3～7天。

实验也证实了西咪替丁对
CYP2C11和CYP 2C6的抑制作用,且被用作阳性对照。

代谢物/华法林对映异构体AUC比值的显著降低证明了5-和8-MOP对CYP2C6有抑制作用,停止使用抑制
剂后,5-和8-MOP处理过的大鼠体内CYP2C6活性增强。

西咪替丁抑制CYPs活性,同时通过R-和S-对映异构体的AUC值总和的降低能看出西咪替丁也抑制R-
,S-华法林的吸收。

5-MOP可以改变血清中R-和S-华法林比例,AUCS-华法林选择性增加了,且这个作用不会通过 P-糖蛋白(P-gp)中和,因为 P-gp抑制剂奎纳定(剂
量15mg/kg)没有影响任何一种对映异构体的AUC值。

Muszkat[38]研究了在严重并存疾病情况下CYP2C9遗传多态性对患者华法林剂
量需求的影响,以及同时使用的药物与华法林可能的相互作用。

实验对象为 119名妇女,平均65.8岁,平均体重74.9kg。

结果发现,CYP2C9＊1/＊3基因型患者[(0.045±0.006)mg/kg]比 CYP2C9＊1/＊1基因型[(0.067±0.004)mg/kg]平均所需的华法林剂量要低33%,CYP2C9＊1/＊2基因型[(0.062±0.008)mg/kg]位于中间。

尽管 CYP2C9＊1/＊3基因型患者所需药物剂量更低,其 INF值(3.29,n=18)显著高于CYP2C9＊1/＊1基因型(2.52,n=64)(P=0.029)。

除了基因型,更长的年纪、充血性心力衰竭和抗生素的使用都与更低的华法林剂量相关。

治疗中使用了药物代谢诱导剂需要更高剂量的华法林。

此外,CYP2C9＊1/＊3基因型患者体内 S-华法
林与R-华法林浓度比值显著高于 CYP2C9＊1/＊1基因型。

综上,华法林治疗剂量个体差异很大,受到CYP2C9遗传多态性、年龄、体重和药物间相互作用的影响。

由于华法林主要通过CYP2C9代谢为7-羟基华法林,代谢具有对映选择性和区域选择性,R,S-华法林可以当作许多CYP亚型的代谢探针。

展望随着抗凝血杀鼠药的广泛应用,近年来人或动物抗凝血杀鼠药中毒现象逐渐增加。

目前对抗凝血杀鼠药的研究大都局限在开发检测方法和案例报道上,对抗凝血杀鼠药的毒理学方面研究还不够。

抗凝血杀鼠药的耐候性,与机体相互作用,与凝血酶原时间的关系,代谢与遗传基因型的关系,其毒性和治疗过程的个体差异等都有待进一步的研究。

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