实验三 孚尔根反应

实验三孚尔根(Feulgen)反应

一、实验目的：

（1）熟悉并掌握孚尔根反应得原理及实验操作方法。

（2）对细胞的免疫组织化学研究方法有一初步的认识。

二、实验原理：

标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子，因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说，DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

三、实验用品：

1、材料：镊子、盖玻片、用carnoy固定液固定的肝脏切片。

2、试剂：（1）schiff试剂1瓶。

（2）亚硫酸水（洗涤剂）3瓶。

（3）1mol/L HCl(水解)1瓶。

（4）1％亮绿1瓶。

（5）30％，50％，70％，85％，95％，100％的酒精各1瓶，100%的酒精2瓶。（6）二甲苯3瓶。

3、器材：显微镜、立式染色缸。

四、实验方法：

1、脱水：依次经过95%酒精两次，每次20-30分钟；100%酒精两次，分别为30分钟、40分钟。

2、制片：二甲苯透明，石蜡包埋，切片6-7μm，动物胶（明胶）贴片，烘干。在贴片时应滴加1-2滴10%甲醛予以固定，否则很容易脱片。

（以上两部实验前已经准备完成）

3、脱蜡：将制片经二甲苯Ⅰ（20分钟）和二甲苯Ⅱ（10分钟）将石蜡脱净。

4、复水：将制片分别放入100％Ⅰ，95％，85％，70％，50％，30％的酒精各5分钟，再放入蒸馏水中10分钟，然后用1mol/L HCl冲洗一下。

5、水解：将制片放入已温浴至60℃的1mol/L HCl溶液水解8分钟（对照不水解），然后用蒸馏水洗3次。

6、染色：用schiff试剂染色1个小时。

7、洗涤：用亚硫酸溶液水洗3次，每次3分钟。

8、水洗：用蒸馏水洗3-5次。

9、复染：用1％亮绿复染数秒（3个制片所用时间依次为20s、30s、50s），然后用蒸馏水洗2次，每次5分钟。

10、脱水及封片：依次用30％，50％，70％，85％，95％，100％Ⅰ，100％Ⅱ

的酒精各脱水3分钟，然后用透明二甲苯Ⅱ及二甲苯Ⅲ各脱水8分钟，最后用中性树胶封片。

五、实验结果：

细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。

六、分析与讨论：

1、孚尔根反应的实验原理是什么：

答：细胞中DNA水解作用后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子，因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说，DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合成紫红色化合物，从而显示出DNA 的分布。

2、在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？

答：由于亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，所以可以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料,使得视野中的染色目标清晰明确，不会和其他部分发生混淆。

3、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

答:（1）在脱蜡过程中，要脱蜡彻底，否则后续染色步骤不能染上。

（2）梯度酒精步骤要严格执行，以使组织形态得到保持。

（3）水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，糖与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，不能呈现颜色反应。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂。

水解步骤中，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗。以防使切片内一切嗜碱性物质皆染色。水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8-12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以

及酸的浓度而定。

（4）亮绿染色时要严格控制时间并且要用蒸馏水洗要彻底，以防染色过度。