双向电泳详细操作过程

蛋白质的双向电泳
一、实验原理：
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：
1. 芽孢杆菌蛋白质的提取
2. 蛋白质样品的纯化
将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。

水化液配置：用dd H20定容
水化液浓度100ml 20ml
尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g
硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04g
CHAPS 4% 4g 0.8g
DTT(154.2) 1% 1g 0.2g
（注：DTT现用现加）
3. Bradford法测蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。

另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

例如：
标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。

a、b通过作图输入数据可知
G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。

使用前滤纸过滤。

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

表-1 五种蛋白质测定方法的比较
3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水,16-18个小时）
3. 蛋白质的水化
蛋白质的上样浓度，选用胶条长度17 cm，PH 3-10：蛋白质上样量为600ug/300ml,
最终体积为300ml，蛋白质含量为600ug 。

若测得蛋白质量：B为12ug/ul (600/12=50)，按每管50ul分装，加250ul水化液体，最
终体积300ul（体积300ul，蛋白质含量600ug）。

IPG胶条蛋白质载样量（考马氏亮蓝R-250）
4. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 3-10），室温中放置30分钟。

而后，
用镊子去除IPG胶条上的保护层。

5.加样：沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

注意：不要产生气泡。

分两次吸取样品，每次300ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽一侧(17cm，pH 3—8 ，蛋白质上样量600ug/300ul)胶条。

6．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡，使水化液浸湿整个胶条，10分钟。

7. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验2ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上，盖上盖子放置在室温，14小时。

（用水平仪调整胶曹的水平）
8．上胶：取出过夜的胶条，正面向上放置在用超纯水润湿的滤纸上吸除矿物油。

取滤纸桥用超纯水润湿，放置在IEF的正负两级上。

从正极到负极将胶条压入槽中，同时加入矿物油，注意把气泡赶出，盖上盖子。

17 cm聚焦盘
9. 对好正、负极，盖上盖子。

将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。

其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦（16-18小时）
IPG运行条件(17cm胶条)
温度20℃
最大电流50uA per IPG strip
胶条水化体积300 (17cm IPG strip)
电压时间
S1 ( 50v , slow，慢速溶胀) 10min
S2 ( 250v, line, 线性除盐) 30min
S3 ( 1000v, rapid, 快速除盐) 50mine
S4 ( 9000v, line, 线性升压) 4.50h
S5 ( 9000v, rapid, 快速聚焦) 65000vh
S6（500v, rapid 快速保持）任意时间
选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。

（50 A/根）
设置等电聚焦时的温度。

（20℃）
高通量聚焦槽
10.IEF主机通电检查，如屏幕显示如下，则为正常
BIO-RAD LABORATORIES
PROTEAN IEF CELL
FIRMWARE VERSION 1.40
SYSTEM INITIALIZATION
之后，屏幕会显示如下
REHYDRATION >
PRESET METHOD >
STORED METHOD >
NEW METHOD >
IPG胶条所需水化液体积
胶条长度(cm) 7 11 13 18 24 每条需水化液体体积(ul) 125 200 250 350 450
不同胶条长度胶条等电聚焦程序设置：
7cm胶条
水化12小时（18℃）主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 500V 快速30分钟除盐
S3 4000V 线性3小时升压
S4 4000V 快速20,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。

（50 A/根）
设置等电聚焦时的温度。

（20℃）
11cm胶条
水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 1000V 快速30分钟除盐
S3 8000V 线性4小时升压
S4 8000V 快速40,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。

（50μA/根）
设置等电聚焦时的温度。

（17℃）
17cm胶条
水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 1000V 快速1小时除盐
S3 10000V 线性5小时升压
S4 10000V 快速60,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
选择所放置的胶条数。

设置每根胶条的极限电流。

（50μA/根）
设置等电聚焦时的温度。

（20℃）
4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配制12.5%的丙烯酰胺凝胶两块
配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS 3ml 称取0.3g 10% APS 3ml 称取0.3g)
(1). dd H20 62.7ml
(2).30% Acr/Bis 83.3ml （购买）
(3).1.5mol/L Tris—HCl PH =8.8 50ml （购买）
(4).10%SDS 2 ml 配置
(5).10%APS 2 ml 配置
(6).TEMED（购买）35- 40 ul 【(5)和(6)使胶凝固】
（注：10%APS 和TEMED最后在灌胶前加，加入后在搅拌时尽量减少气泡）
4.2 灌胶（注意短板的摆放）
将玻璃板洗净后，室温晾干。

然后,将电泳槽平衡好，在两块胶之间放夹层，最后的盖板用钳子拧紧，以免漏胶。

将将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3 ml 左右dd H20压胶，注意不要有气泡产生）。

将做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。

表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
溶液成分
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
5 10 15 20 25 30 40 50
6%
水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8%
水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.3
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03 10%
水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.7
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 12%
水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 20
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 15%
水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%丙烯酰胺溶液 2.5 5 7.5 10 12.5 15 20 25
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3
2.5
3.8 5 6.3 7.5 10 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
1.1配制1
2.5%的丙烯酰胺凝胶：
配胶：（最有胶液的总体积200ml）(10%SDS 3ml 称取0.3g 10% APS 3ml 称取0.3g)
(1). dd H20 62.7ml
(2).30% Acr/Bis 83.3ml （购买）
(3).1.5mol/L Tris—HCl PH =8.8 50ml （购买）
(4).10%SDS 2 ml 配置
(5).10%APS 2 ml 配置
(6).TEMED（购买）35- 40 ul { (5)和(6)使胶凝固｝
（注：10%APS 和TEMED最后在灌胶前加，加入后在搅拌时尽量减少气泡）
1.2电泳液配置：（4L）
甘氨酸SDS Tris dd H
2
57.6g 4g 12.12g 定容4L
2.灌胶：将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃
板底部涂上凡士林以防漏胶，盖板用钳子拧紧，以免漏胶。

将配好的胶倒入注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间超纯水封面，保持胶面平整胶曹（3 ml 左右dd H20压胶，注意不要有气泡产生），做好的胶用保鲜膜盖住，胶放置4小时。

3.平衡液配制（减少电内渗，使被分离的蛋白质与SDS完整结合）
平衡液浓度100ml 50ml
尿素6M 36.04g 18.02g
1.5mol/L Tris-HCl 1.5M 3.34ml 1.67ml
甘油30% 30ml 15ml
SDS 2% 2g 1g
溴酚蓝0.002% 200ul 100ul
ddH20 加至100ml 50ml
10ml 管分装-20°C
4. 配制胶条平衡缓冲液I 。

｛10ml平衡液储液中加DTT 0.1g。

（2根胶条）｝
加DTT使变性的非烷基化蛋白处于还原状态
5 ．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。

将另一份厚
滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。

这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入 5ml 胶条平衡缓
冲液I 。

将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

7. 配制胶条平衡缓冲液II 。

｛10ml平衡液储液中加入碘乙酰胺0.5g。

（2根胶条）｝
加碘乙酰胺使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I 。

并用滤纸
吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

9.用滤纸吸去 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。

将处理好的第二
向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

11.将 10×电泳缓冲液，用量筒稀释 10 倍，成 1×电泳缓冲液。

赶去缓冲液表面的气
泡。

12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II 。

并用滤纸
吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

13.将 IPG 胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电
泳缓冲液中。

然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

其余胶条同样操作。

14.将放有胶条的 SDS-PAGE 凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。

在凝胶
的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（2ml超低熔点琼脂胶）。

15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶
面完全接触。

注意不要在胶条下方产生任何气泡。

在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

16.放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

向电泳缓冲液中加0.5%的琼脂糖
超低熔点琼脂糖50ml
琼脂糖 18.02g
超纯水10ml
溴酚兰 25ul
17．清洗水浴锅，加入适量水，水预锅温度设置16度。

18.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。

将凝胶转移至电泳槽中。

图中选用XL凝胶夹和XL封边垫条
19.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm ）或低电压，待样品在完全走出IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm ），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

20.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶 面） 。

21. 凝胶固定：固定液配置 1 升，每块胶用量 500ml。

ddH20 乙醇 乙酸 400ml 100ml 500ml 量取配制好的固定液 500ml，倒入凝胶固定槽，将胶块在水的张力的作用下置入固 定液中，然后用保鲜膜密封凝胶固定槽，放置在摇床上 3h。

（将蛋白质固定） 22.染色： 染色液的配置：体积 1L 磷酸 硫酸铵 定容至 甲醇（最后加）
G-250
ddH20
100ml
100g
1.2g
200ml
800ml
200ml
染色，用真空泵抽出凝胶固定槽中的凝胶固定液，用超纯水清洗两次，一块凝胶加入 500ml 的染色液，用保鲜膜密封凝胶固定槽，放置在摇床上过夜，12-20 个小时。

23.脱色：脱色液Ⅰ，ddH20 1200ml，加入硫酸铵 75g 溶解后定容 1350ml，脱色前加入 150ml 甲醇，至总体积 1.5L。

量取 1L 脱色液，进行脱色 20min.。

剩余的 500ml 脱色液 加入 500ml 超纯水作为脱色液Ⅱ，每块胶 500ml，过夜脱色。

表 22 进行第二向垂直凝胶电泳的推荐电泳条件 步骤 Hoefer miniVE 或 SE260 1.5mm 厚度凝胶 1.0mm 厚度凝胶 Hoefer SE600 1.5mm 厚度凝胶 1.0mm 厚度凝胶 1 2 1 2 1 2 1 2
电流（MA/块凝胶） 15 30 10 20 15 ② 30 10 ② 20
持续时间 0：15 ① 1：30 0：15 ① 1：30 0：15 ① 1：30 0：15 ① 1：30
表 24 利用 ExcelGel 进行电泳的电泳条件 步骤 电压 （v） Excel Gel SDS，梯度，8-18% Excel Gel XL SDS，梯度， 12-14%
①
电流强度 （mA） 20 50 20 40
功率 （w） 30 30 40 40
持续时间 （h：min） 0：25—0：30 ② 1：10 0：45 ② 2：40
① ①
1 2 1 2
600 600 1000 1000
当溴酚兰染料前沿从 IPG 胶条移出 4—6mm （Excel Gel XL SDS 12—14%） 1—2mm 或 （Excel Gel SDS 8—18%）时，撤掉 IPG 胶条及加样片。

然后将阴极缓冲条移至 IPG 胶条原来覆盖的区域。

调整阴极 电极的位置。

②
当溴酚兰前沿刚到达阳极缓冲条后 5 分钟，停止电泳，撤掉缓冲条。

A．
CHAPS SDS 尿素 硫脲
药品
兼性离子去垢剂 离子型去垢剂 离液剂 离液剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用， 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质 变性并使蛋白失活。

尿素和硫脲联合使用，可 以大大增加蛋白质的溶解性
DTT
还原剂
断裂蛋白质分子中 Cys 残基之间形成的二硫键， 增加
蛋白质的溶解性。

但过分提高 DTT 的浓度，由于它 pKa 在 8 左右，因而会影响 pH 梯度。

DTT 在碱性 pH 下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白 质沉淀 BSA 无水乙醇 磷酸 Tris IPG buffer 覆盖液 丙烯酰胺（Acr） 甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 聚合交联成三维网状结构 溴酚兰 碘乙酰氨（IAA） 甘油 指示剂作用 平衡液 B 中使用，中和 A 液中的 DTT 无机盐的良好溶剂，热稳定性好 考马斯亮兰 G250 有红、蓝两种不同颜色的形 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂， 在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下， Bradford 中制作标准曲线用 和磷酸一起，提供 Bradford 中的环境 提供 Bradford 中的酸性环境 构成缓冲液的成分，可用于抗衡 pH 的变化
考马斯亮兰 G250（Bradford 法用）
式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生 蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在 465~595nm 处有最大的光吸收值，化 合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测 595nm 的光吸收值的大 小计算蛋白的含量 甘氨酸 与 Tris 构成缓冲系统

















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