氨基胍对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的保护作用

氨基胍对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的保护作用
目的：观察诱导型一氧化氮合酶（iNOS）特异性抑制剂氨基胍（AG）对帕金森病模型小鼠黑质内多巴胺（DA）能神经元的影响。

方法：采用Lau法制作PD小鼠模型，通过行为学观察和免疫印迹法，观察PD小鼠模型的行为学表现，及腹侧中脑(包括VTA和SN)iNOS、酪氨酸羟化酶（TH）表达水平的变化。

并观察给予iNOS抑制剂AG后对上述变化的影响。

结果：与对照小鼠相比，PD 小鼠出现PD典型的行为学表现，腹侧中脑TH含量下降约77%,同时iNOS含量大幅度升高。

经iNOS抑制剂AG处理的PD小鼠行为表现明显减轻，腹侧中脑TH含量仅下降约41%，腹侧中脑iNOS含量也较模型组明显为低。

结论：iNOS 的表达与PD模型小鼠黑质内DA能神经元的丢失有关；AG可能对PD模型小鼠黑质内DA能神经元有保护作用。

标签：氨基胍；诱导型一氧化氮合酶；多巴胺；帕金森病；酪氨酸羟化酶
帕金森病(Parkinson＇s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）能神经元进行性变性丢失为主要神经病理学特征，但PD的病因和发病机制仍不清楚。

尸检标本发现，PD患者黑质致密部诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide, iNOS）高度活化，其神经毒性产物——一氧化氮（nitric oxide，NO）大量表达[1]，提示iNOS在PD发病过程中可能起重要作用。

由于iNOS表达能够为氨基胍（aminogunidine, AG）特异性抑制[2]，故AG可能对PD患者黑质中的DA能神经元起保护作用。

我们采用Lau法[3]制作PD小鼠模型，观察模型动物中脑iNOS表达，DA能神经元数量的改变，及给予iNOS特异性抑制剂AG后对上述改变的影响，探讨iNOS和AG在PD发病中的可能作用，为今后探讨PD的防治策略提供线索。

1 材料与方法
1.1实验试剂
MPTP（Sigma，USA），Probenecid（Sigma，USA），Aminogunidine (Sigma，USA），兔抗iNOS单克隆抗体(Neomarkers，CAN)，兔抗TH单克隆抗体(Sigma，USA)，生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(迈新生物生物技术公司)。

1.2动物分组和模型制备
健康雄性C57BL/6N 小鼠30只，6～8周龄，体质量18～23 g，由华北煤炭医学院实验动物中心提供，自由进食饮水，室温（25±2）℃，单笼喂养，自然光照。

将大鼠随机分为3组，每组10只。

模型组(PD组)：给予MPTP（25 mg/kg，生理盐水溶解，皮下注射）和Probenecid（250 mg/kg，二甲亚砜溶解，腹腔注射）10次，2次/周，共5周；iNOS抑制剂组（AG组）：除给予PD组相同的MPTP 和Probenecid处理外，从实验第一天起每天给予AG 1 次（50 mg/kg，盐水溶解，腹腔注射）直至处死；对照组（control组）：注射与PD组等体积盐水+ DMSO。

上述动物分别于实验开始后8周处死。

1.3免疫印迹(Western-blot)
按《分子克隆实验指南》[4]操作，取8周鼠脑检测iNOS蛋白和DA能神经元标志性蛋白——酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）。

将小鼠麻醉后，取脑，切取腹侧中脑部分，置于细胞裂解液中，低温匀浆，静置10 min 后加入90 μl 100 g/L NP-40，剧烈震荡30 s ，4℃13 000 g 离心15 min ，取上清，分装，-80 ℃保存备用。

蛋白定量后加入4倍样本缓冲液，95℃变性5 min 。

取30 μg 样品在100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转至硝酸纤维素(NC)膜，切取相应条带分别加兔抗COX-2单克隆抗体(1∶400)和兔抗TH单克隆抗体(1∶1 500)，4℃过夜，TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔IgG抗血清（1∶100）室温下振荡孵育1.5 h，TBST洗涤后，与卵白素-辣根过氧化物酶复合物室温下孵育2 h，DAB显色。

将NC膜用扫描仪进行扫描，在同一条件下应用CMIAS 真彩医学图像分析系统（北京航空航天大学研制）测定条带平均灰度值。

1.4 统计分析
实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，并输入计算机使用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。

分别采用单因素方差分析、q检验。

P＜0.01，差异有显著性。

2 结果
2.1行为观察
所有接受MPTP注射的小鼠从第2次注射开始，出现急性中毒症状，如竖毛、动作减少、倦卧、尾僵直、细小震颤等，上述症状持续大约5 h后开始减轻，8 h后上述急性症状基本消失。

AG组小鼠的行为表现较PD组小鼠明显为轻，且急性症状的持续时间较短；对照组未见小鼠有上述表现。

2.2 Western-blot检测结果
在预染蛋白标准Mr 130 000和56 000处，可见iNOS和TH特异性蛋白两组棕色条带。

灰度分析发现，PD组与对照组相比，TH的表达下降约77%，iNOS 表达较其他组差异显著（P＜0.01）。

AG组与对照组相比，TH表达量约下降41%，iNOS表达与对照组差异无统计学意义。

对照组仅有微量iNOS蛋白表达（图1，表1)。

3 讨论
PD是一种以静止震颤、动作减少、强直等为主要临床表现并以中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性丢失为主要神经病理学特征的神经系统变性疾病[5]。

本研究复制的PD小鼠模型具有PD典型的行为学表现；Western blot结果显示腹侧中脑TH蛋白的表达下降，这提示本实验PD动物模型存在DA能神经元大量
丢失，说明本实验建立的动物模型符合实验要求。

有大量资料表明，PD发病过程中黑质DA能神经元的变性丢失与iNOS表达关系密切[2]。

Knott等[1]发现PD患者黑质致密部iNOS高度活化；在对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和MPTP制备的PD动物模型进行研究的结果均表明，DA能神经元变性的早期即出现iNOS高表达，其神经毒性产物NO大量产生[2]。

采用NOS基因敲除小鼠进行研究，发现缺乏iNOS的小鼠可明显对抗造模物质的毒性，DA能神经元的丢失显著减少[2]。

这提示在PD发病过程中，iNOS可能是导致黑质DA能神经元变性死亡的重要介质。

本实验采用Lau法制作的PD模型进行研究，发现PD 组小鼠中脑黑质iNOS高表达，同时DA能神经元数量急剧下降；抑制iNOS表达后，DA能神经元丢失减少。

这提示iNOS的表达可能与DA能神经元的丢失有关。

对缺血性脑损伤、糖尿病等iNOS相关性疾病的研究结果证明，AG能选择性抑制iNOS，具有保护效应，并被应用于这些疾病的实验性治疗[6]。

Shibata等[5]用AG处理体外培养的PD小鼠中脑切片，发现其DA能神经元的存活率显著提高。

本实验观察结果发现，用AG处理PD模型动物后，其iNOS的表达较模型组显著减少，DA能神经元丢失情况也明显减轻，提示AG可能主要是通过抑制iNOS的表达，对抗造模物质毒性，减少DA能神经元丢失，起到神经保护效应。

AG对PD小鼠DA能神经元保护效应的确切机制尚未阐明，据有关研究报道可能与下列因素有关：①AG抑制iNOS表达，减少iNOS活化后产物NO的生成，避免NO诱发线粒体损伤、氧化应激、兴奋性细胞毒等[2]；②AG可减少炎症介质前列腺素、白三烯等的产生，减轻神经炎症[7]；③AG还可以抑制二胺氧化酶，减轻氧化损伤[7]。

本实验结果可提示，抑制iNOS活性的药物可减轻PD病多巴胺能神经元的进行性变性，有望成为防治PD的新途径。

[参考文献]
[1]Knott C, Stern G, Wilkin GP, et al.Inflammatory regulators in Parkinson′s disease: iNOS, lipocortin-1,and cyclooxygenases-1 and-2 [J]. Mol Cell Neurosci, 2000, 16(6): 724-739.
[2]任士卿,王彦永,王铭维. 一氧化氮和帕金森病[J]. 临床荟萃, 2005, 20(11): 649-652.
[3]Novikova L, Garris BL, Garris DR, et al.Early signs of neuronal apoptosis in the substantia nigra pars compacta of the progressive neurodegenerative mouse 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine/probenecid model of Parkinson’s disease [J]. Neuroscience, 2006, 140(1): 67-76.
[4]萨姬布鲁克. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京: 科学出版社,
1999.873-897.
[5]Shibata H, Katsuki H, Nishiwaki M, et al. Lipopolysaccharide-induced dopaminergic cell death in rat midbrain slice cultures:role of inducible nitric oxide synthase and protection by indomethacin [J]. J Neurochem, 2003, 86(5): 1201-1212.
[6]Zhang HX, Zhang JX, Li LF, et al. Mechanism of protective effect of aminoguanidine on experimental cerebral ischemic injury in rats[J]. Chin J Pharmacol Toxical, 2006, 20(4): 281-287.
[7]吴立克, 陈琛, 王晓娟. 一氧化氮合酶抑制剂氨基胍对大鼠脑缺血的保护作用[J]. 中华临床医学研究杂志, 2006, 12(11): 1433-1435.
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