高迁移率族蛋白B1在Ⅱ型糖尿病伴牙周病牙龈组织中的表达

高迁移率族蛋白B1在Ⅱ型糖尿病伴牙周病牙龈组织中的表达
目的研究高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在2型糖尿病伴牙周病牙龈组织中表达。

方法研究对象30例均方便选取于2014年3月—2015年1月间大连大学附属新华医院口腔科，分为实验组：2型糖尿病伴牙周病A组10例、慢性牙周炎B组10例及对照组：健康C组10名。

收集牙龈组织，分别通过免疫组织化学染色检测牙龈组织中HMGB1的表达并运用Image-Pro Plus （6.0）图像分析系统进行定量分析。

结果糖尿病伴牙周病组牙龈组织中HMGB1的平均光密度表达量（0.031 2±0.009 9）高于单纯牙周病组（0.022 6±0.009 4）和正常对照组（0.014 5±0.006 6）（P＜0.05）。

结论HMGB1可能与糖尿病伴牙周病的发生发展有关。

[Abstract] Objective To research the expression of high mobility group protein B1 in type II diabetes with periodontitis gingival tissue. Methods 30 cases of patients from March 2014 to January 2015 were conveniently selected as the research objects and divided into three groups with 10 cases in each，the group A were the patients with diabetes combined with periodontal disease，the group B were the patients with chronic periodontitis，and the group C were the healthy people，and the expression of HMGB1 in the gingival tissues was tested by the immunohistochemistry staining，and the Image-Pro Plus （6.0）imaging analysis system was for quantitative analysis. Results The average optical density expression of HMGB1 of patients with diabetes with periodontitis gingival tissue was higher than that of simple periodontitis gingival tissue and normal control group[（0.031 2 ± 0.009 9）vs （0.022 6±0.009 4），（0.014 5±0.006 6）]（P＜0.05）. Conclusion The HMGB1 may be related to the occurrence and development of diabetes with periodontitis gingival tissue.
[Key words] High mobility group protein B1；Diabetes with periodontitis gingival tissue；Periodontitis；IPP
牙周病与糖尿病作为威胁人类健康的慢性感染性口腔疾病和内分泌代谢性疾病，两者之间的关联越来越受到国内外学者的关注。

研究发现，两者之间相互影响、互为因果[1]。

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）是一种参与多种细胞核生命活动的重要核内蛋白，但在胞外环境中可发挥炎性细胞因子的作用，激活涉及免疫或炎症反应的各类细胞[2]。

因其独特的生物学活性和致炎机制，HMGB1受到各个领域学者的关注。

随着研究的不断深入，有学者發现HMGB1在严重牙周病患者牙周组织中的表达水平显著升高；HMGB1受体糖基化终末产物受体（receptor of advance glycation end products，RAGE）在2型糖尿病伴牙周病患者牙龈组织中的表达显著高于单纯牙周病患者[3]，认为HMGB1在糖尿病合并牙周病的发生发展过程中可能起到了重要的作用，但相关领域的报道相对较少。

该实验于2014年3月—2015年1月间收集30例人牙龈组织，通过免疫组织化学染色和图像定量分析研究HMGB1在糖尿病伴牙周病牙龈组织中的表达情况，探讨HMGB1在糖尿病伴牙周病的发生发展过程中可能发挥的作用。

1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
HMGB1多克隆抗体（兔来源）和两步法免疫组化检测试剂盒，BX51型生物显微镜及IX41型荧光倒置显微镜（含摄像系统），图像分析软件Image-Pro Plus 6.0。

1.2 样本收集
30例样本均方便选取于大连大学附属新华医院就诊的患者。

该研究对2型糖尿病的诊断符合WHO糖尿病专家委员会提出的诊断标准[4] ；牙周病的诊断符合第二版《临床牙周病学》中对慢性牙周炎的诊断标准[5]。

所有参与者均无身体其他部位的炎症及系统性疾病且至少半年内未接受任何牙周治疗，1个月内未服用任何的抗生素、非甾体抗炎药。

糖尿病伴牙周病（A）组（男、女各5例，47～65岁）及单纯牙周病（B）组（男、女各5例；年龄46～64岁），样本取自牙龈翻瓣手术过程中切取的病变牙龈组织；正常对照（C）组（男、女各5名；年龄17～35岁）为健康人群，样本取自阻生齿拔除术过程中切取的正常牙龈组织。

所有参与者都被告知研究目的及手术取样情况并同意，且经该院伦理委员会批准。

1.3 免疫组织化学染色
切取的30例牙龈组织常规固定石蜡包埋，沿牙龈颊舌向纵行切连续片3 μm，摊片。

组织切片经脱蜡和水化后，分别进行高压抗原修复、非特异性封闭、非特异性蛋白封闭。

后加入抗HMGB1抗体（1/100）室温（27℃）下孵育1 h，滴加聚合HRP标记抗兔IgG，室温（27℃）下孵育30 min，反复冲洗后经显色、复染分化反蓝、脫水透明后封片，镜下观察。

1.4 图像采集及分析
在相同实验条件下，将30例免疫组化染色的切片，置于100倍光镜下观察。

对每张切片随机选取3个视野进行图像采集（共90张）。

为减少主观性所带来的误差，将3组图片顺序打乱，用Image-Pro Plus（6.0）图像分析系统，双盲分析测量图像中阳性细胞染色的积分光密度（IOD）及所测量区域的面积（Area），并计算HMGB1表达的平均光密度（Density Mean，平均光密度=积分光密度/所测区域面积）。

1.5 统计方法
通过SPSS 17.0统计学软件对3组计算所得HMGB1的平均光密度进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOV A）及多重比较，以α=0.05为检验基准。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
糖尿病伴牙周病组、单纯牙周病组和健康对照组牙龈组织中HMGB1的平均光密度分别为（0.031 2±0.009 9）、（0.022 6±0.009 4）和（0.014 5±0.006 6）。

3组差异有统计学意义（P＜0.05），糖尿病伴牙周病组明显高于单纯牙周病组和健康对照组。

3 讨论
HMGB1作为一种晚期炎症调节因子，可在巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞、树突细胞受到如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等外源性细菌内毒素或肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha ，TNF-α）等内源性促炎细胞因子的刺激后以主动分泌或被动释放的方式分布到胞外环境中[6]。

释放到胞外的HMGB1与存在于多种细胞表面的RAGE、TLR2、TLR4等受体结合从而激活固有免疫细胞，与RAGE结合激活ERK-1/2和NF-κB信号传导通路，与TLR2、TLR4结合激活NF-κB通路。

炎症信号通路的激活可进一步的释放TNF-α、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（IL-6）等促炎细胞因子，从而导致局部的炎症反应进一步加重[7]。

正是由于HMGB1与促炎细胞因子之间的这种相互作用机制，形成了一条炎性细胞因子的正反馈调节通路，从而使得HMGB1在炎症反应的发生进展中起到了维持、延长甚至纵向恶化的作用，也解释了该实验中慢性牙周病患者牙龈组织中HMGB1表达的量（0.022 6 ±0.009 4）明显高于正常对照组（0.014 5±0.006 6）的结果。

同时，该实验结果也与ZHaoH等[8]发现牙周炎组龈沟液中HMGB1的表达量（39.8±1.1）ng明显高于健康对照组（32.1±3.5）ng相对应。

随着牙周病与糖尿病关系研究的深入，如TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子在两者关系中起到了重要作用。

同时，由于HMGB1与炎性细胞因子形成的正反馈调节通路，HMGB1在牙周病、糖尿病伴牙周病的发生发展过程中可能发挥了作用[7，9]。

Luo L等[10]通过实时定量PCR检测到牙周病患者牙龈组织中HMGB1的基因表达水平升高；通过Western blotting、ELISA检测到牙周病患者龈沟液中HMGB1的蛋白水平升高并伴随IL-1β、IL-6等促炎细胞因子浓度的相应增加。

此外，Katz J等[11]通过实时定量PCR检测发现2型糖尿病伴牙周病患者牙龈组织中RAGE的基因水平明显升高，认为该受体参与糖尿病患者的牙周破坏。

研究表明[3]，在高浓度葡萄糖培养基中培养的牙龈上皮细胞可以释放更多的HMGB1。

这些与该实验通过免疫组织化学染色和IPP图像分析发现糖尿病伴牙周病患者牙龈组织中HMGB1表达的量升高相对应，该结果可能是由于糖尿病伴牙周病患者牙龈组织中高表达的HMGB1和RAGE相互结合产生强烈的炎症信号，进一步产生更多的炎症细胞因子，从而进一步促进了HMGB1的表达。

综上所述，与单纯牙周病患者和健康者相比，糖尿病伴牙周病患者牙龈组织中HMGB1表达的量明显升高。

高表达的HMGB1可能与糖尿病伴牙周病的发生和进展有关，从而为探寻糖尿病伴牙周病的病因和治疗提供新的思路。

[参考文献]
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[10] Luo L，Xie P，Gong P，et al. Expression of HMGB1 and HMGN2 in gingival tissues，GCF and PICF of periodontitis patients and peri-implantitis[J].Arch Oral Biol，2011，56（10）：1106-1011.
[11] Katz J，Bhattacharyya I，Farkhondeh-Kish F，et al. Expression of the receptor of advanced glycation end products in gingival tissues of type 2 diabetes patients with chronic periodontal disease：a study utilizing immunohi- stochemistry and RT-PCR[J]. J Clin Periodontol，2005，32（1）：40-44.。