30例杜氏肌营养不良家系临床表型及基因型分析

doi:10.3969/j.issn.1000-3606.2018.04.001
通信作者：刘艳　电子信箱：lyan 3022@
30例杜氏肌营养不良家系临床表型及基因型分析
杨　莹1,2　侯　凌1　刘　艳1
1.华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科（湖北武汉　430030）；
2.厦门市妇幼保健院儿科
（福建厦门　361000）
摘要：　目的　探讨杜氏肌营养不良（DMD ）的临床特点及基因突变类型和分布。

方法　回顾分析2015年8月至2017年4月收治的30例DMD 患儿家系的临床及基因检测资料。

结果　30例DMD 先证者均为男性；起病时的中位年龄4岁（0.17~9.5岁），确诊中位年龄5.2岁（0.25~10岁）；4例（13.3%）有家族史，7例（23.3%）曾被误诊。

所有患儿均起病隐匿；肌酸激酶显著升高，为正常上限的18.6~230.0倍。

9例行肌电图检查，均提示肌源性损害；1例行肌活检，病理符合DMD 改变。

30例患儿均行DMD 基因检测，异常检出率100%；其中17例（56.7%）为基因缺失突变，9例（30.0%）点突变，4例（13.3%）重复突变；缺失突变以48、49、50号外显子最常见；5例点突变未见文献报道；重复突变均为外显子大片段重复，重复区域包括7~19个外显子不等。

30例DMD 先证者家系中的49例家庭成员DMD 基因检测结果显示，5例基因检测结果与先证者完全相同，也为DMD 患者，包括有外公1例，哥哥1例，弟弟3例；21例家庭成员携带与先证者相同的突变基因，为携带者，包括母亲19例和姐姐2例。

结论　对不明原因肌酶谱升高的男性患儿，应高度警惕DMD ，及早行肌电图、肌活检、基因检测确诊。

关键词：　杜氏肌营养不良；　肌酸激酶；　基因检测；　外显子
Analysis of clinical phenotypes and genotypes of Duchenne muscular dystrophy stemma in 30 cases YANG Ying 1,2, HOU Ling 1, LIU Yan 1 (1. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei , China; 2. Department of Pediatrics, Maternal and Child Health Hospital, Xiamen 361000, Fujian, China)
Abstract:　Objective To explore the clinical characteristics, types , and distribution of gene mutation in Duchenne muscular dystrophy (DMD). Method The clinical and gene testing data of DMD in 30 children from August 2015 to April 2017 were retrospectively analyzed. Results 30 cases of DMD precursor were all male, and the median age at the onset was 4 years (0.17~9.5 years), and the median age at diagnosis was 5.2 years (0.25~10 years). Among them, 4 cases (13.3%) had family history, and 7 cases (23.3%) had been misdiagnosed. All the children had insidious onset and markedly elevated creatine kinase (18.6~230.0 times the upper limit of normal). Electromyography was performed in 9 cases, suggesting myogenic damage. Muscle biopsy was performed in one case, and the pathological changes were consistent with DMD. DMD gene was detected in all 30 cases, and the rate of abnormal detection was 100%. Gene deletion mutations were found in 17 cases (56.7%), point mutations in 9 cases (30%), and duplications in 4 cases (13.3%). Deletion mutations were most common in exons 48, 49, and 50. The point mutations in 5 cases have not been reported in literature. Duplications were seen in large fragment of exon, including 7~19 exons. DMD gene detection was also performed in 49 family members. Among them, 1 grandfather, 1 elder brother and 3 younger brothers had the same results as propositus who were confirmed DMD. Furthermore, 21 family members carried the same mutation gene as the propositus, including 19 mothers and 2 sisters. Conclusion For the male children with unexplained significantly elevation of muscle enzymes, clinicians should be highly vigilant about possibility of DMD, and electromyography, muscle biopsy and gene diagnosis should be detected early.
Key words:　duchenne muscular dystrophy;　creatine kinase;　gene test;　exon
Duchenne 型肌营养不良
（Duchenne muscular dystrophy ，DMD ）是由编码抗肌萎缩蛋白
（dystrophy ）基因突变所致的X-连锁隐性遗传病，主要表现为进行性对称性骨骼肌无力和萎缩，通常男性发病。

全世
主诉各异，肢体乏力、上下楼困难17例（56.7%），呼吸道感染4例（13.3%），肝功能不良5例（16.7%），无症状性肌酸激酶（CK ）增高4例（13.3%）。

体格检查时发现腓肠肌肥大22例（73.3%），腓肠肌萎缩2例（6.7%）；Gower 征阳性20例（66.7%）、阴性2例，8例因年龄小不能配合检查；腱反射减弱14例（46.7%），腱反射未引出7例（23.3%），正常9例
（30.0%）。

所有患儿的CK 均显著升高，大部分患儿谷氨酸氨基转移酶（ALT ）、天冬氨酸氨基转移酶（AST ）、乳酸脱氢酶（LDH ）、羟丁酸脱氢酶（HBDH ）、肌酸激酶同工酶（CK-MB ）亦不同程度升高。

其中，CK 升高最明显，其次为CK-MB 、AST 、ALT 、LDH 及HBDH 升高则不显著。

见表1。

表1　30例DMD 患儿肌酶谱检测结果 （U·L －1）
项目正常值范围例数最低值最高值CK 3~19030 3 53543 695CK-MB 0~252433997ALT 4~413037596AST 4~403023 1 044LDH 120~3003074 2 120HBDH
95~200
19
135
1043
9例患儿行肌电图检查，均表现为肌源性损害，即受损神经运动感觉传导正常、受损肌肉运动单元时限偏高或偏窄。

1例患儿行腓肠肌活检，病理送检片，镜下可见散在肌纤维萎缩，肌束间可见出血、散在脂肪浸润及小血管增生，肌间小血管壁增厚伴少许淋巴细胞浸润。

30例先证者DMD 基因检测结果为：基因缺失突变17例（56.7%），点突变9例（30.0%），重复突变4例（13.3%）；基因缺失的外显子缺失热区为48、49、50，占46.2%，见表2。

点突变中，文献已报道的4例（44.4%），文献未报道的5例（55.6%），参考数据库OMIM 、HGMD 及PubMed ，数据更新至2017年7月，见表3。

重复突变均为大片段，7~19个外显子不等，分别为外显子54-60、12-26、45-47及49-62、30-48重复。

另外，30例先证者所在家系的49例成员（包括29例母亲、6例父亲、4例姐姐、2例妹妹、1例哥哥、6例弟弟、1例外公）DMD 基因检测中异常者26例（表4）。

1例先证者母亲因离异未行基因检测，另29例母亲中19例携带突变基因，9例缺失突变、4例重复突变、6例点突变，携带基因与先证者相同，故有52.9%基因缺失先证者的母亲为携带者，100%基因重复突变先证者的母亲为携带者。

49例家庭成员中患者5例，基因
界新生男婴的发病率约1/3 600[1]。

出生时常无症状，3~5岁前隐匿发病[2]，
进展迅速；10岁时多需坐轮椅，20~30岁时多因心肺衰竭死亡[1]。

鉴于儿童DMD 起病隐匿，临床表现各异，容易误诊为其他疾病，故分析总结误诊原因，实现早期诊断、早期干预具有重要临床意义。

现对30例DMD 患儿的临床表现、起病和确诊年龄、家族史、误诊疾病、肌酶谱、肌电图、肌活检病理、基因检测结果进行回顾和分析。

1　临床资料
2015年8月至2017年4月，华中科技大学附属同济医院确诊30例DMD 家系（家庭编号为1~30，家庭间无血缘关系）。

DMD 患儿的诊断参照
《诸福棠实用儿科学》
[3]
，且均经基因检测确诊。

经医院伦理委员会批准，以及患儿或家属的知情同意，患儿、患儿父母及其他家系成员共79例行基因检测。

基因检测采用多重连接探针扩增法（MLPA ）。

取外周静脉血2 mL ，EDTA 抗凝，对DMD 基因79个外显子缺失/重复等突变进行筛查。

若MLPA 未发现大片段缺失/重复突变，则采用二代测序法检测点突变。

二代测序具体方法：提取基因组DNA ，构建基因组文库，然后通过探针杂交捕获DMD 基因外显子及相邻内含子区域（10 bp ），并进行富集，富集的目的基因片段通过下一代高通量测序仪（Illumina ）进行测序。

测序数据运用NextGene V 2.3.4软件与UCSC 数据库提供的人类hg19参考序列进行比对，并对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估。

依据严格的筛选标准对变异进行过滤，并添加HGMD 数据库，蛋白功能预测软件的相关注释信息。

对明确或可能与受检者临床表型相关的基因变异，采用Sanger 测序进行验证。

30例DMD 先证者均为男性患儿，均无血缘关系，父母非近亲结婚，起病时的中位年龄4岁（0.17~9.5岁），确诊中位年龄5.2岁（0.25~10岁），中位病程4个月（1周~6年），4例有家族史（1例先证者的双胞胎哥哥，2例先证者的弟弟，1例先证者的弟弟和外公均确诊为DMD 患者），9例行肌电图检查，1例行肌活检病理检查，30例均行DMD 基因检测及家系基因分析。

30例患儿中，7例（23.3%）有误诊史。

其中误诊肝功能损害或肝炎5例（16.7%），心肌损害或心肌炎2例（6.7%），其中1例误诊为肝功能损害并行相关治疗10个月。

30例患儿均起病隐匿，28例尚存在行走能力；1例为2月龄婴儿，需继续随访观察运动发育情况；另1例10岁患儿，就诊时已丧失行走能力。

患儿就诊时
带者21例，除19例母亲外，还有2例姐姐，亦携带与先证者相同的突变基因。

2　讨论
本组DMD 家系的临床特征：①基本为散发病例，主诉各异，均为男性发病，女性携带，部分有家族史；②起病隐匿，多数患儿就诊时还具有独立行走能力，部分患儿无明显腓肠肌肥大、Gower 征阳性、腱反射减弱或消失等体征，除CK 外的其他肌酶谱增高也不明显，故易误诊；③虽肌电图及肌活检率不高，但所有患儿早期均有CK 显著增高，基因检出率高。

本组患儿的误诊率为23.3%，被误诊为肝炎和心肌炎居多，其原因如下：①因DMD 患儿肌无力的最初表现可能是走路延迟，约60%患儿能独立行走的平均
年龄在17个月
（13~23个月）[4]
，故在学步阶段家长及医务人员需留意是否存在走路延迟、步态异常，才能早期发现。

②部分患儿因呼吸道感染就诊或健康检查时发现肝功能异常，进而诊断肝功能损害或肝炎行保肝治疗，还有部分因CK 增高诊断心肌损害或心肌炎而误诊。

当骨骼肌纤维坏死时可释放大量CK 入血，导致血清CK 显著升高，高于正常上限的1.5倍时为肌酸激酶血症，最常见于DMD ，可在升高后1.6个月（0~4个月）内确诊[4-6]。

研究表明，DMD 患儿CK 值中位数为6 320 U/L ，高出正常上限30倍，且年幼儿童CK 值明显高于年长儿[7]。

本组资料显示，患儿CK 是正常上限的18.6~230.0倍。

故发现肝功能异常时应加查肌酶谱尤其是CK ，当其显著升高时，无论患儿有无临床表现，均需尽早、重点排除DMD 。

对于疑似患儿，应尽早行肌电图检查，有条件的进一步行肌活检及基因检测，检查手段受限的基层医院应及时转诊。

本研究
表2　30例先证者外显子缺失分布情况
外显子号3456745464748495051525468697086缺失例数
1
1
1
1
1
4
4
4
8
8
8
4
2
1
1
1
1
1
表3　9例先证者点突变情况
外显子核苷酸变化氨基酸变化突变类型是否报道母亲携带8 c.814C ＞T p.Gln 272Ter
无义否否16 c.1924-1G ＞C －
剪切否是16 c.2032-2033del p.Gln 678AspfsTer 41
移码否否19 c.2368C>T p.Gln 790Ter 无义是否22 c.2866C>T p.Arg 2680Ter 无义是是35 c.4996C>T p.Arg 1666* 无义是是45 c.6540delT p.Leu 2181TyrfsTer 8移码否是48 c.6955C>T p.Gln 2319Ter
无义是是58
c.8668+1G>T
－
剪切
否
是
表4　先证者家系中26名成员的阳性基因检测结果 家庭编号性别年龄/岁与先证者关系突变
类型突变基因携带/患者1男8双胞胎哥哥缺失
Del 46-52患者2女34母亲缺失Del 68-70携带者男5弟弟缺失Del 68-70患者3女48母亲重复Dup 30-48携带者4女33母亲重复Dup 12-26 携带者5女26母亲重复Dup45-47,49-62携带者
6女24母亲缺失Del 48-50 携带者7女35母亲缺失Del 51携带者8女23母亲缺失Del 54携带者9女39母亲缺失Del 45携带者男2弟弟缺失Del 45患者10女25母亲缺失Del 46-50携带者11女38母亲缺失Del 48-50携带者女7姐姐缺失Del 48-50携带者12女38母亲缺失Del 51携带者女7姐姐缺失Del 51携带者13
女41母亲缺失Del 45携带者男2弟弟缺失Del 45患者男67外公缺失Del 45患者14女35母亲重复Dup 54-60携带者15女32母亲点突变 c.2866C>T 携带者16女40母亲点突变 c.6955C>T 携带者17女31母亲点突变 c.4996C>T 携带者18女36母亲点突变
c.6540delT
携带者19女22母亲点突变 c.8668+1G>T 携带者20
女
30
母亲
点突变c.1924-1G ＞C
携带者
注： Del.基因缺失突变 Dup.基因重复突变
检测结果与先证者完全相同（1例外公、1例哥哥，3例弟弟），上述成员均有DMD 不同程度的临床表现；携
中患儿主诉各异，首次就诊于儿童保健科、呼吸科、消化科、心内科等不同科室，需临床各科室医师共同协作进而早发现、早诊断、早干预。

本研究通过家系基因分析确诊患者5例，母亲携带者19例。

建立完善的遗传咨询和产前诊断平台，可以尽可能地减少因DMD 患儿出生所带来的家庭和社会负担。

DMD的分子遗传学基础是dystrophy基因，该基因定位在Xp21.2，共编码79个外显子，全长约2.5 Mb，是目前人类最大的基因之一，其突变频率高、形式多样[8]。

MLPA技术可检测几乎所有的缺失和重复突变，二代测序则可快速有效检测点突变。

搜索国内外大样本DMD文献数据：国外报道缺失突变占55%~65%，重复突变占5%~15%，点突变占35%，两个缺失热区分别为外显子45-53的中央区和外显子2-20的5’端[9]。

国内报道缺失突变占54.3%，重复突变10.6%，缺失外显子热区45-54[10]；也有报道缺失和重复突变所占比例分别为59.35%、11.21%[11]。

本研究运用MLPA技术和二代测序技术检测30个DMD家系共79例的dystrophy基因，30例先证者中，缺失突变56.7%，重复突变13.3%，点突变30%，缺失热点为外显子48、49、50，与上述国内外报道结论基本相符，提示DMD基因突变类型及分布规律并无明显种族差异。

家系成员49例中，患者占10.2%，均为男性，携带基因与先证者相同；有52.9%基因缺失先证者的母亲为携带者，100%基因重复突变先证者的母亲为携带者，基因重复突变者的母亲携带率高于缺失突变者的母亲携带率，与国外报道相符[12-13]。

30例先证者中，1例3岁患儿同时存在两个区域的外显子重复，即dup45-47和dup49-62，其母亲为携带者，这种基因重排较为复杂罕见，但国外亦曾有类似病例报道[14]。

本研究中虽34.5%的母亲基因检测未见异常，但有研究者认为存在种系镶嵌现象，既往生过DMD患儿的非携带者母亲，再生育DMD患儿风险约14%[15-16]。

故非携带者母亲再生育时也建议行遗传咨询、产前诊断。

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（收稿日期：2017-09-21）
（本文编辑：梁　华）。