紫外-可见分光光度法测定可溶微针贴片中罗丹明B的含量

[收稿日期]2020-02-21　[修回日期]2020-03-26[基金项目]国家级大学生创新创业训练计划(201810367014,
201910367033)
[作者单位]蚌埠医学院药学院,安徽蚌埠233030[作者简介]刘春艳(1998-),女,2016级本科生.
[通信作者]马　涛,硕士研究生导师,教授.E⁃mail:matao1992@
[文章编号]1000⁃2200(2020)11⁃1158⁃03
㊃大学生科技园地㊃
紫外-可见分光光度法测定可溶微针贴片中罗丹明B 的含量
刘春艳,柏沫含,徐雨靓,万天妍,陈佳琪,王清清,马　涛
[摘要]目的:建立可溶微针贴片中罗丹明B 的含量测定方法㊂方法:采用紫外-可见分光光度法,配制一系列浓度的罗丹明B 溶液,在554nm 处测定其相应的吸光度,采用最小二乘法绘制标准曲线㊂考察方法的专属性㊁线性㊁精密度㊁加样回收率㊁检测限㊁重复性及稳定性㊂结果:罗丹明B 浓度在1.04~10.40μg /mL 范围内,与其吸光度呈良好的线性关系(r =0.9995);该方法的专属性㊁线性㊁精密度㊁加样回收率㊁检测限㊁重复性及稳定性均符合要求㊂结论:紫外-可见分光光度法可用来测定可溶微针贴片中罗丹明B 的含量,且方法简单㊁准确㊁可靠㊂[关键词]罗丹明B;可溶微针贴片;紫外-可见分光光度法
[中图法分类号]R 927.2 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2020.11.027
Determination of rhodamine B in dissolving microneedle patch
by ultraviolet⁃visible spectrophotometry
LIU Chun⁃yan,BAI Mo⁃han,XU Yu⁃liang,WAN Tian⁃yan,CHEN Jia⁃qi,WANG Qing⁃qing,MA Tao
(School of Pharmacy ,Bengbu Medical College ,Bengbu Anhui 233030,China )
[Abstract ]Objective :To establish a method for the determination of rhodamine B in dissolving microneedle patch.Methods :Ultraviolet⁃visible spectrophotometry was used to determine the content of rhodamine B in dissolving microneedles.A series concentration of rhodamine B solutions were prepared,the absorbance was measured at 554nm and the least square method was used to draw the standard curve.The specificity,linearity,precision,sample recovery,limit of detection,repeatability and stability of the method
were investigated.Results :Rodamine B solution at the concentration of 1.04-10.40μg /mL showed good linearity with its absorbance (r =0.9995).The specificity,linearity,precision,sample recovery,limit of detection,repeatability and stability of the method all met the requirement.Conclusions :The ultraviolet⁃visible spectrophotometry is simple,accurate and reliable,and can be used to determine the content of rhodamine B in dissolving microneedle patch.
[Key words ]rhodamine B;dissolving microneedle patch;ultraviolet⁃visible spectrophotometry
可溶微针作为新型经皮给药制剂,可以有效突破皮肤角质层屏障,解决经皮递药系统递药效率低的瓶颈问题,实现近似于注射给药的治疗效果[1-2];同时可完全溶解的微米级的针部又使其具有无痛㊁微创㊁便于病人自主给药㊁无废弃针头二次危害等诸
多优点[3]㊂因此,近年来,可溶微针成为新型递药系统研究的主要方向之一,具有极大的临床应用前景㊂但是,该种给药方式药物在体内的分布㊁代谢㊁消除情况及其与皮下注射的区别等尚缺乏相应的研究㊂
本课题组以透明质酸(hyaluronic acid,HA)和聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K90)作为制针辅料,包载可溶性药物,用两步注模干燥法制备出可溶微针贴片,进行大鼠体内给药研究㊂为了更深入地研究可溶微针经皮给药的药物体内过程,直观㊁实时㊁动态地比较皮下注射与可溶微针两种方式给药后,药物在动物体内的分布情况,
具有实
[16]　JIN X,ZHANG ZH,SUN E,et al .A novel drug⁃phospholipid
complex loaded micelle for baohuoside I enhanced oral
absorption:in vivo and in vivo evaluations [J].Drug Dev Ind Pharm,2013,39(9):1421.
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(本文编辑　赵素容)
8
551J Bengbu Med Coll ,November 2020,Vol.45,No.11
时观测记录荧光染料体内分布的小动物活体成像实验是优选的方法㊂罗丹明B 是一类人工合成的以氧杂蒽作为母体的荧光染料,可溶于水,并具有良好的光学稳定性和较高的量子产率,广泛应用于信息科学㊁激光染料㊁环境化学㊁生物医药科学和分析化学等领域[4-5],符合可溶微针的载药特点,可作为本
研究的模型药物进行在体给药和活体成像实验㊂为了保证实验结果的准确,需要建立一种快速㊁便捷㊁准确的检测方法,不仅能排除可溶微针辅料的干扰,还能够准确检测出可溶微针中罗丹明B 的载药量㊂本研究旨在采用紫外-可见分光光度法建立一种准确可靠的可溶微针贴片中罗丹明B 的含量分析方法㊂1　材料与方法
1.1　仪器　TU⁃1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);FA2204N 型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);Advantage A10纯水仪(Milli⁃Q 公司)㊂
1.2　试药　可溶微针贴片(自制);罗丹明B(上海圻明生物科技有限公司);HA (华熙福瑞达生物医药有限公司,批号:1806151);PVP K90(德国BASF,批号:L96014768E0);水为超纯水㊂1.3　溶液的配制　
1.3.1　罗丹明B 贮备液的配制　精密称取罗丹明B 固体粉末0.0052g,置于100mL 容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度线,配制浓度为52μg /mL 的罗丹明B 贮备液㊂
1.3.2　制针辅料溶液的配制　分别精密称取HA㊁PVP K90各0.0250g,置于50mL 容量瓶中,用超纯水溶解并定容至刻度线,配制浓度为0.5mg /mL 的制针辅料贮备液㊂
1.3.3　可溶微针贴片水溶液的制备　用手术刀片对已制备好的可溶微针贴片进行针部与基层分离,
取针部溶解于1mL 超纯水中即得[6]㊂
1.4　检测波长与专属性试验　取1.3项下的罗丹明B㊁HA㊁PVP K90贮备液以及可溶微针贴片水溶
液,以超纯水为空白试剂分别稀释成适宜浓度水溶液,并于200~800nm 波长范围内扫描,得到其紫外光谱图㊂
1.5　标准曲线　取1.3.1项下罗丹明B 贮备液稀释成浓度为10.4μg /mL 的水溶液,再精密量取1.0㊁
2.0㊁
3.0㊁
4.0㊁
5.0㊁
6.0㊁
7.0㊁
8.0㊁
9.0㊁10.0mL 分别置于10mL 容量瓶中,以超纯水定容,得到浓度为1.04㊁2.08㊁3.12㊁4.16㊁5.20㊁6.24㊁7.28㊁8.32㊁9.36㊁10.4μg /mL 的罗丹明B 系列标准溶液㊂分别测量其在554nm 处的吸光度,以吸光度(Y )对罗丹明B 浓度(X )进行线性回归,绘制标准曲线㊂
1.6　精密度试验　取1.3.1项下罗丹明B 贮备液稀释到浓度为5.20μg /mL 罗丹明B 溶液,在
554nm 处连续测定6次,计算日内精密度,3d 内每天同法测定,计算日间精密度㊂
1.7　重复性试验　取实验室自制的同一批可溶微针贴片6片,分别用手术刀片将针部与基层分离,取针部分别置于1mL 超纯水中,振摇时其完全溶解,测量其在554nm 处的吸光度,计算每片可溶微针贴片针部的罗丹明B 含量㊂
1.8　加样回收率试验　精密称取0.0050g 罗丹明B 于100mL 容量瓶中得到浓度为50μg /mL 的罗丹明B 溶液,取1.3.2项下的制针辅料溶液,按照罗丹明B 与混合辅料的浓度比为1∶40㊁1∶20㊁1∶10配制药物辅料混合溶液㊂其中混合辅料浓度保持不变,总浓度为100μg /mL,各辅料均为50μg /mL㊂罗丹明B 浓度分别为
2.5㊁5.0㊁10.0μg /mL㊂将混合溶液在544nm 处测量吸光度,并通过线性方程计算相应的浓度㊂
1.9　稳定性试验　取可溶微针贴片溶液,分别于0㊁0.5㊁1㊁2㊁4㊁6㊁12㊁24h 进行测定㊂2　结果
2.1　检测波长与专属性试验　罗丹明B 在259㊁284㊁355㊁400㊁554nm 处均有吸收,其中,在554nm 处吸收最大,且空白试剂无干扰,而各制针辅料在
554nm 处没有吸收,表明制针辅料对罗丹明B 含量测定无干扰㊂选择554nm 作为罗丹明B 的检测波长,结果见图
1㊂
9
551蚌埠医学院学报2020年11月第45卷第11期
2.2　标准曲线　以吸光度(Y)对罗丹明B浓度(X)进行线性回归,线性回归方程为Y=0.0649X+ 0.0033(r=0.9995),罗丹明B浓度在1.04~ 10.40μg/mL范围内,与其吸光度呈良好的线性关系㊂2.3　精密度试验　在554nm测定5.20μg/mL罗丹明B溶液,日内精密度为1.04%(见表1),日间精密度为1.51%(见表2)㊂
2.4　加样回收率试验　2.5㊁5.0㊁10.0μg/mL的罗丹明B回收率分别为95.96%㊁97.13%㊁97.87%, RSD分别为0.32%㊁0.16%㊁0.21%(见表3)㊂2.5　重复性试验　6片可溶微针贴片中罗丹明B 含量为8
3.8㊁81.0㊁81.3㊁83.4㊁82.2㊁83.6mg,RSD 为1.48%㊂
　表1　紫外-可见分光光度法测定罗丹明B日内精密度结果(n=3)
浓度/(μg/mL)吸光度平均吸光度RSD/%
0.144
2.080.1430.1440.40
0.144
0.342
5.200.3350.338 1.04
0.689
10.40.6860.6850.59
0.681
　表2　紫外-可见分光光度法测定罗丹明B日间精密度结果(n=3)
浓度/(μg/mL)吸光度平均吸光度RSD/%
0.144
2.080.1460.146 1.720
0.149
0.338
5200.3340.333 1.510
0.328
0.685
10.040.6900.6850.658
0.681
2.6　稳定性试验　24h内测定罗丹明B吸光度的RSD值为2.13%(n=8)㊂
3　讨论
罗丹明B在水溶液中具有强烈的荧光,本研究前期采用荧光分光光度法检测罗丹明B的含量,但发现具有强烈的荧光淬灭现象,罗丹明B浓度愈高,则淬灭愈严重,这可能是因为高浓度罗丹明B 体系中存在自熄灭作用,引起淬灭的因素较多,这可能会导致微针贴片中罗丹明B的含量测定不准确㊂此外,采用荧光分光光度法测定罗丹明B系列标准溶液时,发现随着罗丹明B浓度增大,发射波长出现红移现象㊂基于以上原因,本研究最终未采用荧光分光光度法,选择紫外-可见分光光度法测量可溶微针贴片中罗丹明B的含量㊂
表3　紫外-可见分光光度法测定罗丹明B加样回收率结果加入浓度/
(μg/mL)
实测浓度/
(μg/mL)回收率/%
平均
回收率/%
RSD/%
2.3995.7
2.5 2.4096.095.960.3211
2.4196.3
4.8697.1
5.0 4.8697.397.130.1586
4.8597.0
9.7697.6
10.09.809.8097.870.2083
9.809.80
目前罗丹明B的测定方法多采用高效液相色谱法,而紫外可见分光光度法相对高效液相色谱法测定罗丹明B具有简便快捷的优势㊂罗丹明B是一种荧光物质,可以通过小动物成像系统进行实时检测,为了探讨可溶微针制剂是否具有缓释作用,我们以罗丹明B溶液作为对照组,罗丹明B可溶微针作为实验组,建立紫外-可见分光光度法对可溶微针中罗丹明B进行定量,从而保证两个组别的罗丹明B含量相等,进而进行后续的实验研究㊂
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(本文编辑　赵素容)
0651J Bengbu Med Coll,November2020,Vol.45,No.11。