白介素1受体_mRNA在小鼠子宫蜕膜中的转录

白介素1受体ⅡmRNA 在小鼠子宫蜕膜中的转
录
于永生,罗晓彤,金海国
吉林省农业科学院畜牧分院,公主岭136100
摘　要:采用实时定量PCR 方法检测白介素1受体Ⅱ基因在小鼠子宫蜕膜组织或细胞中的转录。

获取正常的小鼠子宫蜕膜组织和人工诱导蜕膜化组织,同时利用酶消化分离小鼠子宫内膜基质细胞,进行体外诱导蜕膜化,以未诱导的子宫内膜基质细胞为对照。

结果表明:白介素1受体Ⅱ在正常子宫蜕膜组织、人工诱导蜕膜化组织、小鼠子宫内膜蜕膜化基质细胞中表达水平均显著高于对照,说明白介素1受体Ⅱ可能参与子宫内膜蜕膜化过程。

关键词:白介素1受体Ⅱ;子宫内膜;蜕膜化
中图分类号:Q954.4 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2013)01-0072-04网络出版地址:http ://www .cnki .net /kcms /detail /22.1100.S .20120830.0902.002.html
引文格式:于永生,罗晓彤,金海国.白介素1受体ⅡmRNA 在小鼠子宫蜕膜中的转录[J ].吉林农业大学学
报,2013,35(1):72-75,82.
Transcription of Receptor Type Ⅱof Interleukin 1in Endometrial Decid -ua
YU Yong -sheng ,LU O Xiao -tong ,JIN Hai -guo
Branch of Animal Husbandry ,Jilin A cade my of Agricultural Sc iences ,G ongzhuling 136100,China Abstract :The aim of this study was to detect the transcription of receptor type Ⅱ(IL1R2)of interleukin 1in endometrial decidua .Normal decidual tissue and artificial decidual tissue of mice were collected ,and endometrial str omal cells (ESCs )of mice were obtained from endometrium by enzymatic dissociation ,
and were induced to decidualize in vitro .The transcription of IL1R2in those tissues or cells were mea -sured by Real time PCR .Compared to the control ,the levels of IL1R2increased significantly in normal decidual tissue ,artificial decidual tissue ,and endometrial decidual cellinduced in vitro ,indicating that IL1R2may be involved in endometrial decidualization .The study lays foundation for researches on decid -ualizaiton mechanism
Key words :receptor type Ⅱof interleukin 1;endometrium ;decidualization 妊娠建立的最显著标志之一是蜕膜化过程(Decidualization ),在该过程中子宫内膜基质细胞肥大及增殖,并开始贮存糖原及脂质等营养物质,为妊娠进行物质准备。

目前蜕膜化发生机制仍不
清楚,研究结果表明激素、细胞因子、非编码RNA 等多种因素均与蜕膜化相关[1-3]。

白介素1(Inter -leukin 1,IL1)具有广泛的免疫调节作用,并有致热和介导炎症的作用,它的生物学功能是通过与
通讯作者
基金项目:国家“973”计划项目(2006CB504005),吉林省博士后科研启动基金项目(00220),引进人才基金项目(00109)
作者简介:于永生,男,副研究员,主要从事动物生物技术研究。

收稿日期:2011-11-28 网络出版时间:2012-08-3009:02
吉林农业大学学报　2013,35(1):72～75,82http ://xue bao .jlau .edu .cn Journal of Jilin A gricultural University E -mail :jlndxb @vip .sina .com
DOI :10.13327/j .j jla u .2013.01.026
相应高亲和力受体结合而介导的[4]。

利用芯片技术检测小鼠第8天正常蜕膜组织和子宫内膜对照组织中基因表达的差异,发现IL-1受体Ⅱ(inter-leukin1receptor,typeⅡ,IL1R2)在小鼠蜕膜化组织中高表达[5],推测IL1R2在小鼠蜕膜化过程中可能具有重要作用。

本试验分别利用实时定量PCR对体内(正常的小鼠子宫蜕膜组织和人工诱导蜕膜化组织)和体外(小鼠子宫内膜蜕膜化基质细胞)蜕膜化组织或细胞中的IL1R2转录水平进行检测,为了解蜕膜化机制奠定基础。

1　材料与方法
1.1　试验材料
8～12周中国昆明白小鼠,购自吉林大学实验动物中心,为近交繁育后代。

总R NA提取试剂盒、DL2000购自Tiangen Biotech,One Step SYBR·PrimeScript·RT-PCR Kit购自Takara公司,细胞培养液DME M、胎牛血清购自Gbico公司。

1.2　方法
1.2.1　体内正常蜕膜化　将成年雌鼠与成年健康雄鼠合笼,次日检查阴道栓,判断是否交配,以见栓当日为妊娠第1天,在妊娠第8天收集蜕膜化子宫,挤取蜕膜化组织,提取RNA,反转录成cDNA,以假孕第8天的子宫内膜为对照,重复3次试验。

1.2.2　人工诱导蜕膜化　将成年雌鼠与输精管结扎雄鼠合笼,次日检查阴道栓以判断是否交配,以见栓当日为妊娠第1天,在妊娠第4天9:00手术,一侧子宫角内注射25μL芝麻油,另一测作为对照。

在妊娠第8天收集人工诱导蜕膜化子宫角,挤取蜕膜化组织,同时收集对照侧子宫,挤取子宫内膜,提取RNA,将RNA调整至相同的浓度,反转录等量R NA。

利用半定量PCR方法检测小鼠子宫内膜蜕膜化标志分子蜕膜/滋养层催乳素相关蛋白(Decidual/trophoblast prolactin-r elated pro-tein,DTPRP)的表达,重复收集3只小鼠注油侧和对照侧子宫内膜,分别进行检测。

PCR反应体系25μL:10倍Buffer2.5μL,dNTP Mixture1μL,模板cDNA0.5μL,Taq DNA Polymerase0.5μL,引物mDTPRP-1和mDTPRP-2(10μmol/L)各0.5μL, ddH2O19.5μL。

PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸45s,27个循环;最后72℃延伸10min。

内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate de-hydrogenase,GAPDH)PCR体系和反应条件同上,所用引物分别为m GAPDH-1和mGAPDH-2。

引物序列及扩增片段长度见表1。

利用real-time PCR检测DTPRP的相对定量。

real-time PCR体系20μL:SYBR·Premix Ex Taq TM 10μL,引物mDTPRP-3和mDTPRP-4(5μmol/L)各0.8μL,反转录产物1μL,dH2O7.4μL。

反应条件:95℃预变性10s;95℃,5s,60℃,34s,40个循环。

内参GAPDH Real-time PCR体系和条件同上,所用引物分别为mGAPDH-3和m GAPDH-4(表1)。

1.2.3　小鼠子宫内膜基质细胞的体外蜕膜化　将8～10只小鼠颈椎脱臼法处死,采集子宫,剔净脂肪和系膜,纵向剖开,参考Dimitriadis等报道的胶原酶消化法分离获得子宫内膜基质细胞[6],将细胞平均接种到8个35mm细胞培养皿中,37℃培养过夜,培养液中添加的血清为去除激素的血清。

24h后,试验组4个培养皿的培养液换为添加10nmol/L雌激素和100nmol/L孕酮的培养液进行体外蜕膜化,每2d换液1次,第5天收集细胞,提取R NA,将R NA调整至相同的浓度,反转录等量RNA,以未激素处理的细胞为对照。

利用半定量PCR检测DTPRP的表达。

利用Real-time PCR检测DTPRP的相对定量。

反应条件与体系同本文“1.2.2”。

重复3次。

表1　PCR扩增所用引物序列
Table1.Primer sequence used for PCR am plification
引物Pri mer
序列
Prime s equence
片段长/bp
Size of the fragment
参照序列
Reference s equence
mGAPDH-1ACCACAGTCCATGCCA TCAC
452N M-008084 mGAPDH-2TCCACCACCCTGTTGCTGTA
mDTPR P-1GCTGCCATTGA GTCAACCTCACTTC
655BC061150 mDTPR P-2ATCAACGCGTAG GCAGT GAGAAA GG 73
于永生等:白介素1受体ⅡmRNA在小鼠子宫蜕膜中的转录吉林农业大学学报Journal of Jilin Agricultural University
续表1
引物
Pri mer 序列
Prime s equence 片段长/bp Size of the fragment
参照序列Reference s equence mGAPDH -3GCCTTCCGT GTTCCTACCC 102
N M -008084
mGAPDH -4TGCCTGCTTCA CCACCTTC mDTPR P -3AGCCA GAAATCACT GCCACT 119
BC061150
mDTPR P -4TGATCCAT GCACCCATAAAA mIL1R2-1CAAGGAT GTGGGTGAA GGGTA 101
N M -010555
mIL1R2-2
CTCACAGTG GGATGCGTTTCT
1.2.4　IL1R2的表达　利用Real -time PCR 分别检测小鼠体内蜕膜组织、小鼠体外蜕膜化组织、小鼠人工诱导蜕膜化细胞中IL1R2mR NA 的表达水平。

所用引物为mIL1R2-1和mIL1R2-2(表1),反应体系和反应条件同本文“1.2.2”。

1.3　统计分析
Real -time PCR 以GAPDH 为内参,采用Schmittgen 等建立的2-ΔΔCT 法进行实时定量[7];试验组与对照组显著性检测采用SPEE 软件T 检验。

2　结果与分析
2.1　小鼠体内诱导蜕膜化
对假孕第4天的小鼠子宫进行“外源”刺激(子宫角内注射芝麻油),人工体内诱导蜕膜化,注油侧子宫出现明显的膨大(图1),分别用半定量PCR 和Real -time PCR 检测假孕第8天小鼠子宫内膜中蜕膜化标志分子DTPRP mR NA 水平,半定量PCR 结果显示,注油侧子宫DTPRP mRNA 水平极显著高于对照(P <0.01)(图2)。

实时定量PCR 结果表明,注油侧子宫DTPRP 相对mR NA 水平达到515.15±65.9467,极显著高于未注油的对照(1.7367±0.6396)。

图1　人工诱导小鼠子宫体内发生蜕膜化Fig .1.Artificial decidulization in vivo
2.2　小鼠体外诱导蜕膜化
利用酶消化法体外分离小鼠的子宫内膜细胞,模拟体内条件用雌激素和孕酮联合处理,进行细胞的体外诱导蜕膜化,分别收集处理第5天的细胞和对照细胞,提取RNA ,用半定量PCR 和Re -al -time PCR 检测小鼠子宫内膜蜕膜化标志分子DTPRP mR NA 水平。

半定量PCR 结果显示激素联合处理的子宫内膜细胞DTPRP mR NA 水平极显著高于对照未处理组(P <0.01),见图3。

实时定量PCR 结果表明处理组细胞内DTPRP 相对mR -NA 水平达到131.1492±28.2169,极显著高于未处理细胞(1.2253±0.4308)。

1～3.对照Control ;4～6.体内诱导蜕膜化组织Decidual tiss ue induced in viv o
图2　半定量RT -PCR 检测体内诱导蜕膜中的
DTPRP
Fig .2.Detection DTPRP in decidual tissue induced in
vivo by semi -quantitative RT -
PCR
1,3,5,7.对照Control ;2,4,6,8.体外诱导蜕膜化细胞Decidu -al cell induced in vitr o
图3　半定量RT -PCR 检测体外诱导蜕膜化细胞中
的DTPRP
Fig .3.Detection DTPRP in decidual cell induced in
vitro by semi -quantitative RT -PCR
2.3　IL1R2在小鼠体内蜕膜组织中的表达
分别提取正常蜕膜组织、人工诱导蜕膜化组织、对照组R NA ,利用Real -time PCR 检测IL1R274
吉林农业大学学报　2013年2月Journal of Jilin Agricultural University 2013,February
mR NA的表达,结果表明,无论是正常蜕膜化组织(545.5667±44.5099)还是人工诱导的蜕膜化组织(638.1333±45.0706)中,IL1R2的表达水平极显著高于对照组(4.4667±2.7047)(P<0.01)。

2.4　IL1R2在小鼠体外蜕膜化基质细胞中的表
达
分离小鼠的子宫内膜基质细胞,进行体外诱导蜕膜化,提取RNA后,检测IL1R2mRNA水平的变化。

结果显示IL1R2的变化趋势与体内蜕膜化一致,体外诱导蜕膜化细胞中IL1R2mRNA水平(4.3700±0.4518)极显著高于对照未处理的基质细胞(0.8900±0.1054),但上升幅度较体内蜕膜组织极显著下降,说明体外诱导蜕膜化与体内蜕膜化对基因表达水平的影响有一定的差异。

3　讨　论
妊娠需要子宫组织发生广泛的重建,子宫内膜细胞生长和分化。

蜕膜化除了内源雌激素和孕酮的水平外,还需要外源性“触发”,如胚泡与子宫内膜的接触或对子宫角腔表面的人工刺激。

小鼠蜕膜化的子宫内膜基质细胞形态发生改变(由成纤维样细胞变为大而圆的细胞),细胞核显著增大,明显表达蜕膜化的分子标志DTPRP mRNA,因此通过DTPRP mRNA是否显著高水平表达可有效判断是否发生蜕膜化[8]。

基于此项研究结果,在没有胚胎存在的前提下,向激素预处理的小鼠子宫内注射芝麻油刺激,可有效诱导蜕膜化的发生(检测到蜕膜化标志分子),这为体内验证蜕膜相关分子奠定了基础。

本试验收集了小鼠第8天正常蜕膜组织和子宫内膜对照组织,利用高通量芯片检测了蜕膜化后基因表达的差异,发现了一大批在正常蜕膜组织与对照有显著差异的目标基因。

在表达量变化超过5倍的蜕膜化芯片数据中选择了IL1R2作为目标,利用实时定量PCR在小鼠第8天正常蜕膜组织、人工油滴蜕膜化组织和第8天子宫内膜对照组织进行验证,结果显示变化趋势和芯片数据一致,说明了芯片数据的可靠性。

Kimura等[9-11]研究结果表明,灵长类和啮齿类子宫内膜基质细胞可由激素和生长因子诱导体外蜕膜化。

本试验参考上述研究方法,对体外分离的小鼠子宫内膜基质细胞进行体外诱导蜕膜化,通过检测标志分子显示,基质细胞都发生了蜕膜化。

在小鼠体外诱导蜕膜化的子宫内膜基质细胞中,IL1R2的变化趋势与体内蜕膜化一致,但变化的幅度(上升不足5倍)显著低于体内蜕膜组织(上升超过500倍),这表明尽管在体外经过诱导基质细胞出现了类似蜕膜化,但与体内相比还存在基因表达量的差异,需要进一步优化蜕膜化体系。

IL1R2是白介素1受体家族成员,主要分布于细胞膜,可与白介素1α、白介素1β和白介素1Ⅰ型受体结合,作为诱骗受体抑制其配体的活性。

而白介素1α主要参与局部炎症和细胞内事件的调节[12],白介素1β是一个非常重要的前炎症细胞因子,在炎症免疫损伤机制中起着主要的调节作用[13],同时白介素1β也可以激活多重信号通路,调节胰岛素样生长因子结合蛋白1在蜕膜中的表达[14],还通过激活金属蛋白酶2和7的活性,增加瘦素的分泌,从而有利于细胞外基质的重塑[15]。

因此蜕膜化组织中IL1R2的高表达可以使子宫内膜发生局部炎症反应,有利于胚胎侵入子宫内膜,建立妊娠。

本试验对IL1R2小鼠子宫内膜组织、小鼠体外诱导蜕膜化细胞中的表达进行了检测,发现蜕膜化发生后IL1R2表达量显著上升,并从基因功能方面推测了对子宫接受性的影响,为IL1R2参与蜕膜化这一过程初步奠定了研究基础。

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(下转第82页)
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于永生等:白介素1受体ⅡmRNA在小鼠子宫蜕膜中的转录吉林农业大学学报Journal of Jilin Agricultural University
菌作用[12-14],因此侵入菌不能大量繁殖,由此推断胚胎阶段胃肠道中存在的细菌可能直接来源于母体。

通过对胚胎胃肠道微生物进行准确鉴定,能及时了解胚胎各个时期肠道菌群的组成及变化,为深入研究胚胎时期实施免疫预防和开发微生态制剂提供新途经。

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