基于脂肪细胞自噬探讨温胆汤...胖痰湿证炎症状态的作用机制_喻松仁

第40卷第1期
2022年1月中华中
医药学刊
CHINESE
AＲCHIVES OF
TＲADITIONAL CHINESE
MEDICINE
Vol．40No．1Jan．2022
国家项目点击
DOI :10．13193/j．issn．1673-7717．2022．01．004
基于脂肪细胞自噬探讨温胆汤干预肥胖
痰湿证炎症状态的作用机制
喻松仁，张一文，华诗培，姚琦，王河宝，周丽，程绍民，王萍
(江西中医药大学，江西南昌330004)
摘要:目的观察温胆汤对肥胖痰湿证大鼠肾周脂肪组织肿瘤坏死因子－α(TNF －α)、白细胞介素(IL )－6、
IL －1β、单核细胞趋化蛋白－1(monocyte chemotactic protein 1，MCP －1)等相关炎症细胞因子，对自噬活性标志物B 细胞淋巴
瘤2结合蛋白－1(Beclin －1)、
微管相关蛋白轻链(LC3)mＲNA 与蛋白水平表达，以及对脂肪细胞超微结构与自噬状态变化的影响，探讨温胆汤干预肥胖痰湿证炎症状态的作用机制。

方法选用清洁级60g 左右雄性SD 大鼠100只，随机
分成造模组(70只)和空白组(30只)，
空白组采用普通饲料喂养，造模组采用高脂饲料喂养，持续喂养6周，借助文献方法制作肥胖痰湿证大鼠模型。

造模成功后，按照体质量依序淘汰过轻者，共遴选出16只肥胖大鼠，随机分为模型组、温胆汤组(为本课题组前期实验已确定的最佳剂量组)，每组8只;另在空白组中随机选取8只大鼠设为正常组。

药物组
以15g ·kg －1
生药量进行灌胃，模型组和正常组均予等量蒸馏水进行灌胃，1次/d ，共6周。

禁食不禁水12h ，麻醉后进
行样本采集，
检测并计算大鼠体质量、Lee ’s 指数和肥胖率，按试剂盒说明书采用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC )、甘油三酯(TG )、低密度脂蛋白(LDL －C )和高密度脂蛋白(HDL －C )水平;采用酶联免疫吸附测定(ELISA )技术检测SD
大鼠肾周脂肪组织炎症细胞因子TNF －α、
IL －6、IL －1β、MCP －1的表达;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Ｒeal －time PCＲ)法检测肾周脂肪组织Beclin －1、LC3mＲNA 表达;采用蛋白免疫印迹法(Western Blot )检测肾周脂肪组织Bec-lin －1、LC3蛋白表达;采用透射电镜观测腹周脂肪组织脂肪细胞超微结构与自噬体的改变。

结果高脂饲料喂养可成功
复制肥胖痰湿证模型，造模组大鼠肥胖率大于20%，与空白组比较，模型组体质量、
Lee ’s 指数呈显著升高(P ＜0.01，P ＜0.05)。

与正常组比较，模型组大鼠体质量显著升高(P ＜0.01)，血脂水平呈显著改变(P ＜0.01)，肾周脂肪组织炎
症细胞因子TNF －α、IL －6、IL －1β、MCP －1的表达水平显著升高(P ＜0.01)，自噬基因Beclin －1、
LC3mＲNA 与蛋白水平显著升高(P ＜0.01)，
与模型组比较，药物组体质量、Lee ’s 指数显著下降(P ＜0.01，P ＜0.05)，血脂水平显著变化(P ＜0.01)，肾周脂肪组织炎症细胞因子TNF －α、IL －6、IL －1β、MCP －1表达水平显著下降(P ＜0.01)，自噬基因Bec-lin －1、LC3mＲNA 和蛋白表达水平显著下降(P ＜0.01)，透射电镜观察显示，正常组的细胞结构完整，表面突起，细胞核不规则，细胞器较丰富;模型组的细胞表面突起严重，细胞核不规则，细胞器较丰富，线粒体嵴破坏显著，出现碎解和分离现象，胞浆内有空泡，自噬体较多。

药物组的细胞表面稍突起，细胞核不规则，部分线粒体嵴破坏，部分胞浆内有空泡，自噬体减少。

结论温胆汤可有效改善肥胖大鼠痰湿证的炎症状态，其机理可能与调节肾周脂肪细胞自噬活性有关，这为经典治痰名方温胆汤干预肥胖痰湿证提供了实验依据。

关键词:肥胖;痰湿证;温胆汤;炎症细胞因子;自噬;作用机制
中图分类号:Ｒ259．892文献标志码:A 文章编号:1673-
7717(2022)01-0014-06基金项目:国家自然科学基金(81960851);江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ201212)作者简介:喻松仁(1976－)，男，江西九江人，副教授，硕士研究生导师，博士，研究方向:中医证的本质。

通讯作者:王萍(1981－)，男，江西萍乡人，副教授，博士研究生导师，博士，研究方向:中医证的本质。

E-
mail :21674494@qq．com 。

Discussion on Mechanism of Wendan Decoction (温胆汤)on Inflammatory State of
Phlegm Dampness Syndrome of Obesity Based on Autophagy of Adipocytes
YU Songren ，ZHANG Yiwen ，HUA Shipei ，YAO Qi ，WANG Hebao ，ZHOU Li ，CHENG Shaomin ，WANG Ping
(Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine ，Nanchang 330004，Jiangxi ，China )
Abstract :Objective To observe the effect of Wendan Decoction (温胆汤)on tumor necrosis factor －α(TNF －α)，interleu-kin (IL )－6and IL －1β，monocyte chemotactic protein 1(MCP －1)and other related inflammatory cytokines in perirenal adi-pose tissue of obese rats with phlegm －dampness syndrome ，and the effect on autophagy activity markers B －cell Lymphoma 2
binding protein －1(beclin －1)and microtubule associated protein light chain (LC3)．To explore the mechanism of Wendan De-coction on the inflammatory state of obesity of phlegm －dampness syndrome．Methods A total of 100male SD rats were randomly divided into model group (70rats )and blank group (30rats )．The blank group was fed with normal diet ，and the model group was fed with high fat diet and both groups were fed continuously for 6weeks．And then the rat model of phlegm －dampness syn-drome of obesity was established by methods in the literature．After the model was established successfully ，16obese rats were selected after the underweight eliminated according to weight and were randomly divided into model group and Wendan Decoction intervention group (hereinafter referred to as "drug group"，which was the best dose group determined in the previous experiment
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of this research group)with8rats in each group．Eight rats in the blank group were randomly selected as the normal group．In the drug group，15g·kg－1of crude drug was administrated to the stomach．The model group and the normal group were treated with the same amount of distilled water by gavage，once a day totally for six weeks．Three groups fasted without water for12h and the samples were collected after anesthesia．The rats’body weight，Lee＇s index and obesity rate were measured and the levels of TC，TG，LDL－C and HDL－C were measured by using full automatic biochemical analyzer according to the instructions of the kit．The expressions of TNF－α，IL－6，IL－1βand MCP－1in adipose tissue of SD rats were measured by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)technology．The expression of beclin－1，LC3mＲNA in perirenal adipose tissue was detected by Ｒeal time PCＲmethod．The expressions of beclin－1and LC3protein in perirenal adipose tissue were detected by Western blot-ting method．The ultrastructural changes of adipocytes and autophagy were observed by Transmission electron microscope．Ｒesult The obese model of phlegm－dampness syndrome can be successfully reproduced by high fat feed and the body mass and Lee＇s in-dex of the model group were increased significantly(P＜0.01，P＜0.05)compared with those of the blank group．The body weight of rats in the model group was significantly increased(P＜0.01)．The level of blood lipid was significantly changed(P＜0.01)．The expression levels of inflammatory cytokines TNF－α，IL－6，IL－1βand MCP－1in perirenal adipose tissue were significantly increased(P＜0.01)．The levels of beclin－1，LC3mＲNA and protein in autophagy gene were significantly in-creased(P＜0.01)compared with those of the normal group．The body mass and Lee＇s index of the drug group were decreased significantly(P＜0.01，P＜0.05)，and the blood lipid level changed significantly(P＜0.01)．The expression levels of inflam-matory cytokines TNF－α，IL－6，IL－1βand MCP－1in perirenal adipose tissue were decreased significantly(P＜0.01)．The expression levels of autophagy genes Beclin－1，LC3mＲNA and protein were decreased significantly(P＜0.01)compared with those of the model group．It showed that the normal group had complete cell structure，protruding surface，irregular nucleus and abundant organelles by transmission electron microscope．The cell surface was severely protuberant，the nucleus was irregu-lar，organelles were abundant，mitochondrial cristae were significantly damaged，fragmentation and separation occurred，vacuoles were found in cytoplasm，and the autophagy was more common in the model group．The cell surface was slightly protruding，the nucleus was irregular，some mitochondrial cristae were destroyed，some cytoplasm had vacuoles，and autophiles decreased in the drug group．Conclusion Wendan Decoction can effectively improve the inflammatory state of phlegm－dampness syndrome in obese rats，and the mechanism may be related to the regulation of autophagy activity of perirenal adipocytes，which provides the experimental basis for the classical phlegm－treating prescription Wendan Decoction to interfere with phlegm－dampness syn-drome in obesity．
Keywords:obesity;phlegm－dampness syndrome;Wendan Decoction(温胆汤);inflammatory cytokines;autophagy;mecha-nism of action
肥胖是发生心血管疾病、糖尿病等的重要危险因素，对肥胖的早期干预是预防心血管疾病、糖尿病等代谢性相关疾病发生的有效途径。

中医认为“肥人多痰”，痰湿是肥胖等代谢性相关疾病辨证的主要证素［1－3］;因证选方，经典治痰名方温胆汤(姚僧垣《集验方》)随症加减后已广泛运用于此类疾病的防治，且效果显著［4］。

近年来研究发现，肥胖不仅是一种代谢性疾病，更是一种慢性低度炎症性疾病［5］，且其脂肪组织的炎症反应受到自噬的介导和调节，肥胖者脂肪细胞自噬活性的改变可导致炎症细胞因子肿瘤坏死因子－α(TNF－α)、白细胞介素(IL)－6、IL－1β、单核细胞趋化蛋白－1(monocyte chemotac-tic protein1，MCP－1)、IL－10等的差异表达［6－8］。

研究认为高脂饲料诱导的肥胖SD大鼠模型与人类食源性肥胖具有较好的可比性，本课题组在前期实验中借助文献方法已成功建立大鼠肥胖痰湿证模型，并发现温胆汤能有效改善肥胖痰湿证炎症病理状态［9－10］。

鉴于此，本研究将在前期研究的基础上，采用温胆汤进行干预，观察其对肥胖大鼠肾周脂肪组织炎性细胞因子和自噬活性标志物Beclin－1、LC3mＲNA与蛋白表达的影响，从细胞自噬的角度探明温胆汤干预肥胖痰湿证炎症状态的作用机制。

1材料
1．1仪器
AEＲOSET2000型全自动生化分析仪(美国Instrument la-boratory公司提供)，Synergy2型酶标仪(美国BioTek仪器公司提供)，TG16W型微量高速离心机(湖南吉尔森科技发展有限公司提供)，GNP－9080型隔水式恒温培养箱(湖南湘鑫仪器仪表有限公司提供)，ABI－7300型Ｒeal－time检测仪(美国ABI公司提供)，TG－16M型低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司提供)，K30型旋涡振荡器(青浦泸西仪器厂提供)，PＲO200型电动匀浆机(德国FLUKO公司提供)，mini protean3cell型电泳仪(美国Bio－Ｒad公司提供)，TE77XP型电转仪(美国HOEFEＲ公司提供)，MK3型酶标仪(芬兰雷勃集团提供)，HI1210型水浴锅(德国Leica公司提供)，Tanon－5200型成像系统(上海天能科技有限公司提供)，UC7型超薄切片机(德国Leica公司提供)，Ultra45ʎ型钻石切片刀(日本Daitome公司提供)，Tecnai G20TWIN型透射电子显微镜(美国FEI公司提供)。

1．2试剂
血TC、TG、LDL－C和HDL－C测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供，批号依次是AD20180109、AD20180109、AD20180105、AD20180109);TNF－α、IL－6、IL－1β、MCP－1测定试剂盒(美国Andygene公司提供，批号依次是20190816、20190812、20190812、20190820)，Trizol(美国Ambion公司提供，批号117303)，SYBＲGreen荧光定量PCＲ试剂盒(美国KAPA Biosystems公司提供，批号005196－21－1)，反转录(ＲT)试剂盒(日本Takara公司提供，批号AK5017)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190813)，ＲIPA组织细胞快速裂解液(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190722)，Tris－HCl 电泳缓冲液(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190715)，10%SDS(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190710)，
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10%过硫酸铵(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190710)，四甲基乙二胺(北京索莱宝科技有限公司提供，批号20190623)，812包埋剂(美国SPI公司提供，批号90529－77－4)，Beclin－1抗体(美国abcam公司提供，批号GＲ145000)，LC3抗体(美国CST生物公司提供，批号1806416)。

1．3动物
SPF级SD大鼠100只，雄性，体质量(60ʃ10)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(湘)2016－0002。

本实验所用动物已获江西中医药大学实验动物伦理委员会批准，编号JZLISC2018－028。

2方法
2．1动物模型制作
按文献方法采用高脂喂养建立大鼠肥胖痰湿证模型［9］。

高脂饲料配方:由普通饲料47．7%、猪油15%、蛋黄粉10%、全脂奶粉10%、白砂糖10%、胆固醇2%等组成，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司加工，B级。

大鼠在江西中医药大学基础医学院动物中心屏蔽环境中喂养。

适应性喂养7d后，随机分成两组，其中模型制作组(简称造模组)70只、空白组30只。

造模组选用高脂饲料喂养，空白组选用基础饲料喂养，持续喂养6周。

造模组大鼠投放的高脂饲料以次日略有剩余为度。

6周后称重，根据体质量，依次淘汰过轻者。

以肥胖模型建立标准(肥胖率=造模动物体质量－正常动物体质量/正常动物体质量≥20%)纳入动物。

以血脂显著改变作为判定痰湿证形成的微观指标［11］。

2．2药物与制备
温胆汤组成遵原方:陈皮10g，半夏10g，茯苓10g，竹茹10g，枳实10g，炙甘草3g，加生姜5片、大枣1枚，原药材按照2015年版《中华人民共和国药典》依法炮制，由江西中医药大学岐黄国医书院门诊部提供，并经本校曹岚副教授鉴定为正品。

全方经水煎、浓缩后，配制成质量浓度为含温胆汤生药1g·mL－1，密封无菌包装，放置于4ħ冰箱保存备用。

2．3给药方法
按照文献方法在造模成功后停喂高脂饲料［12］，并将大鼠随机分成模型组和药物组，另设正常组，每组8只，各组均采用基础饲料喂养。

药物组采用温胆汤(15g·kg－1量，该剂量为前期实验中确定的最佳剂量［13］)灌胃，模型组和正常组均采用等量蒸馏水进行灌胃，1次/d，自由饮水，共持续6周。

2．4样本采集与保存
造模6周后，称重，测量大鼠鼻尖至肛门长度。

温胆汤干预6周后，称重，禁食不禁水12h，采用2%戊巴比妥钠(45 mg·kg－1量)腹腔注射麻醉，处死大鼠，测量鼻尖至肛门长度;将大鼠固定在鼠夹板上，逐层开腹，分离出腹主动脉，采用5 mL含EDTA采血管取血(约3mL)，放置于4ħ的环境下，待提取上清液后用于检测血脂水平。

取肾周脂肪组织，剪成米粒大小后置于1．5mL离心管，放置在－20ħ环境下保存，用于后续提取检测自噬活性标志物Beclin－1、LC3mＲNA与蛋白水平表达。

另在其它同一部位取肾周脂肪组织，剪碎成米粒大小，放置在电镜专用戊二醛固定液中保存，用于后续透射电镜观察脂肪细胞超微结构与自噬状态变化。

2．5指标检测
2．5．1Lee’s指数和肥胖率Lee’s指数计算公式:Lee’s指数=(末次体质量ˑ1000)^(1/3)/体长(cm);肥胖率计算公式:肥胖率=(造模组体质量－正常组体质量)/正常组体质量。

2．5．2血脂提取备用血上液清后，按照试剂盒说明书，使用全自动生化分析仪进行血脂检测。

2．5．3脂肪组织促炎细胞因子TNF－α、IL－6、IL－1β和MCP－1水平肾周脂肪组织经匀浆器匀浆后，采用ELISA技术检测促炎细胞因子TNF－α、IL－6、IL－1β、MCP－1的表达水平，按酶标仪程序测定各孔的OD值检测(参见《Synergy2型酶标分析仪的使用操作方法》)，细胞因子的表达水平表示为pg·mL－1蛋白。

2．5．4肾周脂肪组织自噬基因Beclin－1、LC3mＲNA水平
每只大鼠取肾周脂肪组织样本100mg，以GAPDH为内参，以ＲT－PCＲ方法检测Beclin－1、LC3的mＲNA水平。

具体方法:采用Trizol法抽提总ＲNA，清除DNase I之后，用紫外分光光度计测定其浓度，取1μg总ＲNA，以Oligo(dT)18为引物、M－MuLV为逆转录酶进行反转录反应(反转录反应程序:42ħ，60 min;70ħ，15min;16ħ，hold;反转录产物置于－20ħ保存备用)，参照GenBank中靶基因mＲNA的序列设计引物(见表1)，靶基因和内参分别在最佳条件下及PCＲ循环的线性期内扩增(扩增反应程序:95ħ，3min;95ħ，5s;56ħ，10s;72ħ，25s;39cycles;65ħ，5s;95ħ，50s)。

采用2－△△Ct法计算自噬基因Beclin－1、LC3mＲNA相对表达量。

表1PCＲ引物序列
Primer名称碱基序列(5＇to3＇)
扩增片段
大小(bps) Beclin－1－F ACCGACTTGTTCCCTATG241 Beclin－1－ＲCCTCCAGTGTCTTCAATC241
LC3－F CTATGCCTCCCAAGAAAC142
LC3－ＲCACATCTCTGCCTAATCC142 GAPDH－F GTCGGTGTGAACGGATTTG181 GAPDH－ＲTCCCATTCTCAGCCTTGAC181 2．5．5肾周脂肪组织自噬基因Beclin－1、LC3蛋白表达水平采用裂解液将脂肪组织至完全裂解，裂解后的样品进行蛋白质定量后贮存于－80ħ冰箱。

根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度制备电泳胶。

按照每孔上样量为15μg蛋白进行上样，进行120V60min的电泳跑胶，电泳之后进行25V转膜30min。

之后进行膜的封闭及抗体孵育，Beclin－1蛋白的一抗稀释比为1ʒ2000，LC3蛋白的一抗稀释比为1ʒ800，内参抗体为GAPDH，稀释比为1ʒ2500。

抗体孵育之后进行ECL化学发光检测，将其放入成像系统中进行扫描和结果记录分析。

2．5．6透射电镜观察脂肪细胞超微结构与自噬状态变化在电镜专用戊二醛固定液充分固定后，将脂肪组织进行漂洗，再用1%锇酸固定液2h，再次漂洗后，进行梯度脱水，条件为: 50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min。

100%丙酮2次，各15min。

脱水之后采用丙酮/包埋剂进行渗透，再经过包埋剂进行包埋，包埋之后采用超薄切片机进行80 100nm的切片。

经过铀铅双染色15min，最后将切片室温干燥过夜，进行电镜观察。

2．6统计学方法
采用SPSS21．00软件统计分析，所有数据均采用 xʃs表示，两组比较采用两独立样本的t检验;多组比较用单因素方差分析法，若方差齐采用LSD检验，若方差不齐采用Tamhane’s T2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3结果
3．1造模6周后两组大鼠体质量、Lee’s指数和肥胖率的改变
与正常组比较，造模组肥胖大鼠的体质量、Lee’s指数存
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在显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。

造模组肥胖率为26．36%，超出了20%，符合肥胖的判定标准［14］。

证实了肥胖大鼠造模效果较好。

见表2。

表2造模后两组大鼠体质量、Lee’s指数比较( xʃs)组别n体质量/g Lee’s指数
造模组16433．87ʃ38．191)3．07ʃ0．092)
正常组8343．35ʃ24．603．00ʃ0．06
注:1)与正常组比较，P＜0.01;2)与正常组比较，P＜0.05。

3．2温胆汤对各组大鼠体质量、Lee’s指数和肥胖率的影响与正常组比较，模型组体质量显著升高(P＜0.01);与模型组比较，药物组大鼠体质量和Lee’s指数显著下降(P＜0.01，P＜0.05)。

温胆汤干预后肥胖率仅为1．06%，而模型组肥胖率仍有15．50%。

说明改用基础饲料喂养后，模型组和温胆汤组肥胖率虽有下降，但温胆汤组体质量和肥胖率下降更为显著，表明温胆汤具有较好减肥效果。

见表3。

表3温胆汤对各组大鼠体质量、Lee’s指数的影响( xʃs)
组别n体质量/g Lee’s指数
温胆汤组8446．28ʃ32．872)2．90ʃ0．093)
模型组8510．10ʃ32．481)2．99ʃ0．04
正常组8441．61ʃ23．952．92ʃ0．07
注:1)与正常组比较，P＜0.01;2)与模型组比较，P＜0.01;3)与模型组比较，P＜0.05。

3．3温胆汤对各组大鼠血脂水平的影响
与正常组比较，模型组大鼠血TC、TG、LDL－C和HDL－C 水平呈显著改变(P＜0.01)，表明大鼠肥胖痰湿证造模成功。

与模型组比较，温胆汤干预后血TC、TG、LDL－C和HDL－C 水平呈显著改善(P＜0.01)。

提示温胆汤对血脂水平具有较好的调节作用，能有效改善肥胖痰湿病理状态。

见表4。

表4温胆汤对各组大鼠血脂水平的影响( xʃs)
单位:mmol·L－1组别n TC TG HDL－C LDL－C
温胆汤组244．36ʃ0．222)2．59ʃ0．302)0．41ʃ0．062)2．91ʃ0．262)
模型组246．41ʃ0．311)3．35ʃ0．291)0．31ʃ0．061)4．74ʃ0．381)
正常组241．33ʃ0．181．07ʃ0．320．56ʃ0．060．56ʃ0．21
注:1)与正常组比较，P＜0.01;2)与模型组比较，P＜0.01。

检测时，每个样品设有3个复孔，故有24个标本数。

3．4温胆汤对各组大鼠肾周脂肪细胞促炎细胞因子表达的影响
与正常组相比，模型组大鼠的TNF－α、IL－6、IL－1β和MCP－1的表达水平显著升高(P＜0.01)。

与模型组比较，温胆汤干预后能显著降低TNF－α、IL－6、IL－1β、MCP－1的表达水平(P＜0.01)。

即说明温胆汤可改善脂肪组织促炎细胞因子的表达水平。

见表5。

表5温胆汤对各组大鼠肾周脂肪组织炎性细胞
因子表达的影响( xʃs)单位:ng/L 组别n TNF－αIL－6IL－1βMCP－1
温胆汤组891．02ʃ7．152)43．24ʃ3．352)9．03ʃ0．792)210．16ʃ27．922)
模型组8142．66ʃ9．701)55．24ʃ4．811)9．81ʃ1．051)317．65ʃ33．771)
正常组873．20ʃ7．6932．23ʃ8．965．93ʃ0．74128．38ʃ21．31
注:1)与正常组比较，P＜0.01;2)与模型组比较，P＜0.01。

3．5温胆汤对各组大鼠肾周脂肪细胞自噬基因mＲNA和蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠肾周脂肪细胞自噬基因Beclin－1、LC3mＲNA与蛋白水平显著升高(P＜0.01)。

与模型组比较，温胆汤组能显著降低自噬基因Beclin－1、LC3的mＲNA与蛋白表达水平(P＜0.01)。

见表6、图1。

表6温胆汤对各组大鼠肾周脂肪组织自噬
基因表达的影响( xʃs)
组别
Beclin－1
mＲNA蛋白
LC3
mＲNA蛋白
温胆汤组2．40ʃ0．762)(24)0．87ʃ0．112)(8)2．65ʃ1．352)(24)0．81ʃ0．082)(8)
模型组2．54ʃ0．871)(24)1．12ʃ0．091)(8)4．27ʃ1．141)(24)0．87ʃ0．091)(8)
正常组1．07ʃ0．64(24)0．62ʃ0．08(8)1．05ʃ0．27(24)0．69ʃ0．08(8)注:1)与正常组比较，P＜0.01;2)与模型组比较，P＜0.01。

()内为样本数。

检测mＲNA时，每个样品设3个复孔，故有24个标本数;检测蛋白时，只取1个样本，故仅有8个标本数。

注:A和D正常组，B和E是模型组，C和F是温胆汤组
图1温胆汤对各组大鼠肾周脂肪组织Beclin－1、
LC3蛋白表达电泳图
3．6温胆汤对各组大鼠脂肪细胞超微结构与自噬状态变化的影响
正常组的细胞结构完整，表面突起，细胞核不规则，细胞器较丰富。

模型组的细胞表面突起严重，细胞核不规则，细胞器较丰富，线粒体嵴破坏显著，出现碎解和分离现象，胞浆内有空泡，自噬体较多。

温胆汤组的细胞表面稍微突起，细胞核不规则，部分线粒体嵴破坏，部分胞浆内有空泡，自噬体减少。

见插页Ⅰ图2。

4讨论
中医虽无“肥胖”病名，然观其病证，当属“肥人”“脂人”“膏人”“肥满”等范畴，且“痰湿”为其主要病理改变［15］。

如朱丹溪在《丹溪治法心要》中有“肥白人多痰湿”、喻嘉言在《医门法律》中有“肥人湿多”、王燕昌在《王氏医存》中有“肥人之病，皆因脾湿致胃生痰”等的论述。

临证时也多从痰湿入手，如宋代官修方书《太平圣惠方》中有用利湿化痰之天星散、竹沥饮子等治疗肥人中风，朱丹溪《丹溪心法》中有:“若是肥盛妇人，禀受甚厚，恣于酒食之人……闭塞子宫，宜行湿燥痰，用导痰汤之类”的记载，明代万全在《妇人秘科》中也认为肥胖者以痰湿内盛居多，可引起血运障碍导致月经不调或不孕，多选用二陈汤加芎归汤、苍术导痰丸等来治肥胖妇人不孕。

而温胆汤被誉为经典治痰名方，祛痰化湿效果显著，采用本方或加减化裁方可用治肥胖等相关代谢性疾病。

本项目组前期研究发现，温胆汤可通过改善体质量、血脂、血糖等指标从而达到减肥效果［13］。

本实验结果也显示，造模组大鼠体质量、Lee’s指数和肥胖率显著升高，且血脂水平呈显著改变;而采用温胆汤干预后，肥胖大鼠体质量、Lee’s指数均明显下降，血脂水平亦呈明显改善，这与本课题组前期研究结果相似。

上述实验结果也再次验证了经典治痰名方温胆汤对肥胖痰湿证大鼠具有较好的治疗效果。

现代研究表明，自噬是细胞进化过程中一种保守的胞内异化系统，可通过清除受损或长寿的细胞器等来维持细胞自稳［16］。

一方面自噬能快速动员内源性储存，可阻断必要的合成代谢反应以回收ATP来实现饥饿状态下的能量供给;另一
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第40卷第1期2022年1月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol．40No．1
Jan．2022
方面自噬体能吞噬细胞质内坏死或损伤的细胞成分和细胞器，与溶酶体融合后，在溶酶体酶的参与下消化降解，从而起到维持细胞内代谢物的更新和环境稳态的作用［17］。

且自噬对未被内质网相关途径降解的蛋白、错误折叠蛋白和损伤细胞器起到降解作用，发挥改善内质网应激作用，在能量过剩环境下可起到细胞管家作用［18］。

然而自噬过程是在多种蛋白复杂而有序的精细调控下完成的，研究者对自噬活性的观察和判定主要通过观察自噬各阶段关键的蛋白含量，即将Beclin1、LC3等作为衡量自噬活性的标志蛋白［19］。

近年来研究发现，自噬活性的改变可影响到炎症细胞的存活、发育和稳定，在炎症的发病机制和发展中起着关键作用［20－23］。

且自噬能介导和调节肥胖患者脂肪组织中炎性因子的表达［6］，因此，自噬活性的改变是诱发炎症反应和炎症性疾病的一个重要因素，调控脂肪细胞自噬有望改善肥胖的慢性低度炎症状态。

本研究结果证实，肥胖大鼠肾周脂肪组织促炎因子TNF－α、IL－6、IL－1β、MCP－1的表达水平显著升高，同时肾周脂肪组织中自噬相关基因Beclin－1、LC3mＲNA与蛋白表达水平亦显著升高，透射电镜观察发现肾周脂肪组织中自嗜体显著增多，表明自噬与炎症在肥胖发生过程中具有同升的变化趋势，提示肥胖状态下脂肪组织自噬激活可能是限制过度炎症反应的代偿机制，此结论与赵永军的研究结果基本一致［19］。

且通过经典化痰名方温胆汤干预后，炎症细胞因子TNF－α、IL－6、IL－1β、MCP－1的表达水平显著降低，肾周脂肪组织中自噬相关基因Beclin－1、LC3 mＲNA与蛋白表达水平亦呈显著下降，透射电镜下肾周脂肪组织细胞结构损伤程度有明显改善，自噬体数量减少。

结果表明，温胆汤干预后自噬与炎症反应总体上呈现同降的变化趋势，提示脂肪细胞自噬水平在模型、药物干预和正常组间呈现递次下降的现象，且与肥胖水平呈正比，这可能与脂肪组织的累积刺激细胞自噬的代偿机制有关。

上述结果表明，一方面肥胖痰湿证大鼠确实存在脂肪细胞炎症状态和自噬活性增强。

这与刘杰民等［24］的研究结果比较近似，他们认为痰属于病理性生化物质(糖浊、脂浊和蛋白浊等)在体内堆积的结果，这种内生痰浊之邪可通过自噬的“自我消化”来加以降解，并为细胞提供一定的能量和合成底物，故而认为细胞自噬是中医气化功能的微观体现。

另一方面也提示温胆汤的“治痰”作用可能与调控肥胖大鼠脂肪细胞自噬活性进而改善其炎症状态有关。

综上可知，温胆汤减肥降脂效果明显，且其对肥胖痰湿证的干预可能是通过调控脂肪细胞自噬的活性来改善脂肪组织的炎症状态，从而起到消除体内病理性生化物质(糖浊、脂浊和蛋白浊等)的效果，这为温胆汤的药理药效及临床应用研究提供了参考依据。

然而温胆汤在干预肥胖痰湿证时是否存在着量效关系，温胆汤是如何调节脂肪细胞自噬活性，是否存在基于某条或某些信号通路来调控自噬活性，且对脂肪组织炎症状态的调节是否还存在着其它作用机制，这些仍然不是十分明确，那么是否可以在基于文献的基础上采用自噬相关信号通路阻断剂或激动剂，并通过设置多剂量组进一步来明确温胆汤的作用靶点和量效关系，深入阐明温胆汤干预肥胖痰湿证炎症状态的内在机制，尚需深入研究。

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