Westernblot试剂配制及操作流程

Westernblot试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程
试剂配制
1.RIPA裂解液：
10mM Tris（，）
1%NP40
%TritonX-100
%脱氧胆酸钠
2 mM EDTA
1 mM PMSF
20%⽢油
调pH值⾄。

混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。

使⽤时，加⼊蛋⽩酶抑制剂cooktail。

制胶⽤（1-6）：
1.L Tris·HCl （）
Tris 12.114g
蒸馏⽔ 100ml
溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。

2.L Tris·HCl（）
Tris 18.671g
蒸馏⽔ 100ml
溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。

3.10％SDS
SDS 10g
蒸馏⽔⾄ 100ml
如溶解困难，可在50℃⽔浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，⽔浴溶化后，仍可使⽤。

4.10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺
蒸馏⽔ 1ml
（现⽤现配，可先将过硫酸胺⼲粉称好分量后放在管中，⼀次性多装⼏管，使⽤时加⼊蒸馏⽔⽔即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5．四甲基⼄⼆胺原液（TEMED）： 4?C保存。

6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。

10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据⾃⼰所做蛋⽩的⼤⼩确定依次加⼊去离⼦⽔
30%丙烯酰胺 5ml
1.5M Tris-HCl（）
10%SDS 150µl
10%AP 150µl
TEMED 6µl
每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。

灌胶后加异丙醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
依次加⼊去离⼦⽔
30%丙烯酰胺 1ml
1M Tris-HCl（）
10%SDS 60µl
10%AP 60µl
TEMED 6µl
每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。

7．5X电泳液缓冲液
Tris（） 15.1g
⽢氨酸（） 94g
SDS 5.00g
蒸馏⽔⾄ 1000ml
溶解后室温保存,⽤时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。

8．10X转膜缓冲液
⽢氨酸（）
Tris（） 30.3g
蒸馏⽔⾄ 1000ml
溶解后室温保存,⽤时稀释10倍，并加⼊甲醇⾄20%。

通常取80ml母液，加560ml蒸馏⽔，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。

（先加甲醇易产⽣沉淀）
9．10XTBS缓冲液
Tris（） 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏⽔⾄ 1000ml
（浓盐酸调pH⾄），溶解后室温保存。

10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏⽔ 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20⽐较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉⼀块，即可防⽌产⽣⽓泡。

溶解后室温保存。

11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂⽜奶)：
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存，可于⼀周内使⽤。

步骤：
SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。

（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。

然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。

2、按前⾯⽅法配12％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在7ml左右），加⼊TEMED后⽴即摇匀即可
灌胶。

灌胶后胶上加⼀层异丙醇醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。

3、当⽔和胶之间有⼀条折射线时，说明胶已凝了。

弃去异丙醇，⽤⽔冲洗，并⽤吸⽔纸将⽔吸
⼲。

4、等待胶凝期间可计算含10-100ug蛋⽩的溶液体积即为上样量（根据⾃⼰的实验需要进⾏选择，
没有固定的量）
取出上样样品⾄EP管中，加⼊5×上样缓冲液⾄终浓度均为1×。

上样前要将样品于沸⽔中煮5-10min使蛋⽩变性。

5、按前⾯⽅法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌
满浓缩胶然后将梳⼦插⼊浓缩胶中（从梳⼦的⼀头开始插）。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有⽓泡产⽣。

插梳⼦时要使梳⼦保持⽔平。

由于胶凝固时体积会收缩减⼩（也提⽰胶已经凝固），从⽽使加样孔的上样体积减⼩，所以在上层胶凝固的过
程中要在两边补胶（不补胶问题也不⼤）。

等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。

6、加⼊1×电泳缓冲液，两⼿分别捏住梳⼦的两边竖直向上轻轻将其拔出。

*电泳缓冲液⼀定要加⾄超过玻璃板的上缘（量要⾜够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进⽽影响电泳的效果。

7、上样
Marker 7µl
样本根据⾃⼰的样品决定
实验所⽤Thermo 26619# Marker电泳后出现9条带：10，15，25，35，55，70，100，130，250KDa （具体条带数⽬会因为胶的浓度不同⽽不同），最少4条带（6%的分离胶时出现70，100，130，250KDa）。

（3）电泳：开始恒压，电压80V，电泳跑到分离胶以后可调节电压到120V
电泳⾄溴酚兰刚跑出即可终⽌电泳，进⾏转膜（⼀般要让⽬的条带跑过分离胶的1/3⽐较好）。

电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。

（四）转膜
（1）转⼀张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时⼀定要戴⼿套（因为⼿上的蛋⽩会污染膜）。

将切好的硝酸纤维素膜现在甲醇中浸泡激活，后和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。

（2）夹⼦⿊的⼀⾯：海绵-2张滤纸-胶-PVDF膜-2张滤纸-海绵（顺序⼀定注意）
将夹⼦打开使⿊的⼀⾯保持⽔平。

在上⾯垫⼀张海绵垫，⽤玻棒来回擀⼏遍以擀⾛⾥⾯的⽓泡。

在垫⼦上垫⼆层滤纸，先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，⼩⼼剥下下层胶盖于滤纸上，⽤⼿调整使其与滤纸对齐，轻轻⽤玻棒擀去⽓泡。

将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除⽓泡。

在膜上盖2张滤纸并除去⽓泡（膜盖下后不可再移动）。

最后盖上另⼀个海绵垫，擀⼏下就可合起夹⼦。

要不断的擀去⽓泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发⽣短路。

如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。

（3）将夹⼦放⼊转移槽槽中，要使夹的⿊⾯对槽的⿊⾯，夹的⽩⾯对槽的红⾯。

电转移时会产热，故放冰来降温。

⼀般⽤恒流400mA转膜。

实际上应该根据蛋⽩分⼦量的⼤⼩确定转膜时间，如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。

转膜后，膜要分正反⾯，转膜时靠胶的⼀⾯为正⾯。

转膜结束前配制封闭液（5%脱脂⽜奶)及1X TBST缓冲液。

如果做磷酸化抗体等，需要⽤⾎清封闭，具体情况可参考抗体说明书。

（五）免疫反应
（1）封闭：将膜⽤移⾄含有封闭液的平⽫中，室温下脱⾊摇床上摇动封闭1-2h。

（2）⼀抗
. 将⼀抗⽤封闭液稀释⾄适当浓度；加⼊抗体， 4度过夜，次⽇⽤1X TBST在室温下脱⾊摇床上洗三次，每次5min。

（3）⼆抗
同上⽅法准备⼆抗稀释液，室温下孵育1-2h后，⽤1X TBST在室温下脱⾊摇床上洗三次，每次10min。

（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量等体积混合；
打开X-光⽚夹，铺上保鲜膜，将膜正⾯朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）
（2）将1×显影液，⾃来⽔和定影液分别到⼊盘中；
在红灯下
取出X－光⽚，⽤切纸⼑剪裁适当⼤⼩（⽐膜的长和宽均需⼤1cm）；把X－光⽚放在膜
上，⼀旦放上，便不能移动，关上X-光⽚夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光
时间，⼀般为1min到5min，也可选择不同时间多次压⽚，以达最佳效果；
曝光完成后，打开X-光⽚夹，取出X-光⽚，迅速浸⼊显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终⽌显影。

显影时间⼀般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适
当延长显影时间；
显影结束后，先⽤⾃来⽔洗⼀下X-光⽚，然后再放到定影液中进⾏定影（这样可以延长定影液使⽤时间，从⽽节约定影液）。

定影时间⼀般为5～10min，以胶⽚透明为⽌；。