miR-19a调控血小板反应蛋白在结肠癌淋巴转移中的机制

miR-19a调控血小板反应蛋白在结肠癌淋巴转移中的机制殷茜;王佩佩;彭睿;周航
【摘要】目的探讨miR-19a调控血小板反应蛋白(THBS1)在结肠癌淋巴转移中的机制.方法采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测不同结肠癌细胞株(LOVO、HT116、SW480、HT29)中的miR-19a的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)/免疫共沉淀(CO-IP)技术检测LOVO与HT29细胞中THBS1及血管内皮生长因子C/D(VEGF-C/D)蛋白结合及表达情况;Western blot法检测转染后细胞中THBS1、VEGF-C/D的表达情况;细胞划痕法检测转染后细胞的迁移能力.取shRNA、shRNA-NC转染后的LOVO细胞以及正常LOVO细胞分别接种于裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模型观察成瘤情况,免疫组化法检测肿瘤组织中CD34的表达,Western blot法检测瘤体中THBS1、VEGF-C、VEGF-D蛋白的表达.结果细胞株LOVO和HT29的miR-19a的表达量分别为最高和最低;THBS1蛋白在
HT29细胞中高表达,VEGF-C/D蛋白在LOVO细胞中高表达;LOVO和HT29细胞中THBS1和VEGF-C免疫共沉淀反应为阳性;转染miR-19a后,LOVO细胞的迁移能力显著下降,而HT29细胞迁移能力有显著上升.注射了miRNA抑制物组的裸鼠瘤块明显变小;瘤块组织中THBS1的蛋白表达显著上升,VEGF-C的蛋白表达显著下降,CD34的阳性表达降低.结论 miR-19a能够通过下调THBS1促进VEGF-C的表达,从而促进结肠癌淋巴结转移.
【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(048)001
【总页数】6页(P42-47)
【关键词】miR-19a;THBS1;结肠癌淋巴转移;VEGF-C/D
【作者】殷茜;王佩佩;彭睿;周航
【作者单位】遵义医科大学附属医院腹部肿瘤科,遵义 563003;遵义医科大学附属医院腹部肿瘤科,遵义 563003;遵义医科大学附属医院腹部肿瘤科,遵义 563003;遵义医科大学附属医院腹部肿瘤科,遵义 563003
【正文语种】中文
【中图分类】R735.3
结肠癌在全球恶性肿瘤的发病率为第3位，死亡率为第2位，严重威胁人类健康[1-2]。

淋巴转移是结直肠癌治疗失败的主要原因之一[3]。

大量研究表明microRNA通过调控癌基因和抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管生成、蛋白裂解等生物程序的调控，决定癌细胞的恶性特征[4-5]。

近年来研究表明miR-19a与肿瘤淋巴结转移密切相关[6]。

血小板反应蛋白(THBS1)抗肿瘤血管生成作用近年研究较为广泛，被认为是抑制血管生成最重要的一种蛋白[7]。

已有课题组从细胞水平探究了miR-19a调控THBS1进而影响肿瘤淋巴结转移的机制[8]。

本文旨在通过体内外实验对miR-19a调控THBS1在结肠癌淋巴转移中的机制进行进一步的探究，从而可以更好地预测结肠癌患者转移风险，为提高临床治疗效果提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 实验材料
LOVO、HT116、SW480、HT29细胞系(CTCC)，F12K/DMEM/McCOY′s
5A(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(上海碧云天公司)，Trizol(Invitrogen公司)，
DEPC处理水(无锡菩禾公司)，氯仿/异丙醇/无水乙醇(上海国药公司)，DAB显色液(中杉金桥公司，ZLI-9017)。

实验所需抗体均购自Abcam公司，实验所需限制性内切酶均购于TaKaRa公司。

SPF级Balb/c裸鼠(雌性，6～8周龄)由遵义医学院动物实验中心提供。

无水乙醇、二甲苯、固定液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)均购于无锡菩禾公司。

1.2 细胞实验
1.2.1 miR-19a在结肠癌细胞株中的表达情况采用qRT-PCR检测培养细胞miR-19a表达情况，筛选出最高和最低表达miR-19a的细胞株。

用含10%
FBS(Hyclone)的DMEM高糖培养液(Hyclone)，于37℃，5% CO2培养箱(Thermo Scientific 8000)中培养LOVO、SW480、HT116和HT29细胞。

使用Trizol提取结肠癌细胞总RNA，采用qRT-PCR方法以U6作为内参检测miR-19a mRNA的表达。

RNA样品用反转录试剂盒(Thermo #K1622)，根据厂家说明书反转录为cDNA，所得cDNA模板用SYBR Green PCR试剂盒(Thermo F-415 XL)进行实时荧光PCR分析。

逆转录的反应参数设置为反转录42℃ 60 min，热失活95℃ 10 min。

PCR扩增参数设置为94℃ 10 min，(94℃ 20 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s)40个循环。

引物(杭州擎科公司)序列如下：miR-19a正向引物5′-ACGG-CGTCCTGCAGACGGAC-3′，反向引物5′-TCG-CGACCAGGCATGTCTA-3′；U6正向引物5′-CT-CGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACG-CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 最高和最低表达细胞株中THBS1和VEGF-C/D相结合情况及蛋白表达情况采用免疫共沉淀(CO-IP)技术检测LOVO和HT29细胞株中THBS1和VEGF-C/D 相结合情况。

培养LOVO和HT29细胞，按正常操作处理收集各实验组细胞，将其裂解后提取总蛋白并按BCA蛋白定量试剂盒(Biosharp)进行定量分析，按免疫共沉淀试剂盒(Thermo公司)说明书进行操作，用目标一抗与细胞总蛋白进行免疫
共沉淀，免疫复合物电泳转膜后，用相应二抗进行免疫印迹分析。

采用免疫印迹(Western blot)法检测LOVO和HT29细胞株中THBS1和VEGF-
C/D蛋白表达情况。

培养LOVO和HT29细胞，按正常操作处理收集各实验组细胞，对其裂解后提取总蛋白，并进行蛋白定量，用12%SDS-PAGE凝胶对各实验
组蛋白进行电泳，350 mA条件下转膜40 min，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗Anti-THBS1/Anti-VEGF C/D(按说明书稀释)，GADPH(1∶1000)，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入1∶1000稀释HRP标记的二抗，37℃孵育1 h。

TBST
洗涤3次后，ECT发光液(七海生物公司)显影，一体式化学发光仪(ChemiScope 5300 Pro)拍摄照片。

独立重复实验3次。

1.2.3 Western blot检测转染后的细胞THBS1、VEGF-C/D的表达 (1)miR-19a
沉默及过表达质粒的构建：miR-19a抑制物通过吉玛公司合成，miR-19a的过表
达质粒具体构建方法参照1.2.3(1)中所述，所用限制性内切酶为BamHⅠ、
HindⅢ。

重组质粒分别命名为miR-19a的过表达质粒。

(2)细胞培养及转染：将miR-19a抑制物及miR-19a抑制物NC分别转染至LOVO细胞；将miR-19a过表达质粒及miR-19a过表达质粒NC分别转染至HT29细胞，未转染的LOVO细胞及HT29细胞为对照。

具体操作步骤参照1.2.3(2)所述。

(3)Western blot检测：培养箱内培养48 h后收样进行Western blot检测。

具体操作步骤参照1.2.3所述。

1.2.4 细胞划痕实验检测迁移能力构建质粒及细胞转染，具体操作步骤同
1.2.3(1)(2)所述，于培养箱内培养48 h后进行划痕实验，6孔细胞培养板，每孔
中加入5×105个细胞，37℃，5% CO2饱和温度培养箱培养24 h(满足过夜能铺满)，200 μL枪头划痕，无菌PBS清洗3次。

37℃，5% CO2饱和培养箱培养，
分别于0、12、24 h在倒置相差显微镜(OLYMPUS，IX71)下拍照观察，独立重复实验3次。

1.3 动物实验
1.3.1 小鼠结肠癌LOVO细胞荷瘤小鼠模型的建立收集对数生长期的细胞，将裸鼠随机分为3组，shRNA + miR-19a + LOVO细胞为实验组(shRNA)，shRNA NC + miR-19a + LOVO细胞为阴性对照组(shRNA NC)，以正常LOVO细胞为对照组。

方法:超净台内，75%乙醇消毒裸鼠注射部位皮肤，裸鼠后肢注射含
5×105细胞的细胞悬液，刺入点距注射点约1 cm，形成一隆起皮丘，防止液体漏出后消毒皮肤，术后小鼠继续在SPF环境下饲养，每隔2～3 d测量瘤块的体积，观察成瘤情况。

1.3.2 免疫组化检测移植瘤中CD34的表达实验结束后处死裸鼠，取瘤块，一部分常规石蜡包埋制片，制作石蜡切片，对制备好的石蜡切片进行免疫组化检测，CD34为一抗，按照免疫组化检测试剂盒说明书进行实验，显微镜下观察细胞染色结果。

1.3.3 蛋白印迹法检测移植瘤中THBS1、VEGF-C和VEGF-D蛋白的表达剩余部分新鲜组织采用蛋白裂解液提取总蛋白，蛋白定量后采用Western blot检测THBS1、VEGF-C和VEGF-D蛋白。

具体实验步骤参照1.
2.2中所述。

2 结果
2.1 最高、最低表达miR-19a的结肠癌细胞株的筛选
采用qRT-PCR方法检测结肠癌细胞株LOVO、HT116、SW480、HT29中的miR-19a mRNA表达情况。

结果如图1所示，在结肠癌细胞株LOVO、HT116、SW480、HT29中，LOVO的miR-19a表达量最高，HT29的miR-19a表达量最低。

与LOVO组比较，**P<0.01图1 miR-19a在结肠癌细胞株中的表达情况Fig.1 Comparison of miR-19a expression between colon cancer cell lines
2.2 LOVO和HT29细胞株中THBS1和VEGF-C/D结合情况
采用CO-IP技术检测结肠癌细胞株LOVO、HT29中THBS1和VEGF C/D结合情况。

结果如图2A所示，LOVO和HT29中THBS1和VEGF-C免疫共沉淀反应为阳性，THBS1和VEGF-D免疫共沉淀反应为阴性。

此结果表明THBS1与VEGF-C有相互作用，而与VEGF-D没有相互作用。

采用Western blot法检测结肠癌细胞株LOVO和HT29中的THBS1以及VEGF-C/D蛋白表达水平，结果如图2B所示，HT29细胞的THBS1的蛋白表达量高于LOVO细胞，其VEGF-C/D的蛋白表达量低于LOVO细胞(均P<0.01)。

A:免疫共沉淀；B:Western blot检测；与LOVO细胞比较，**P<0.01图2 LOVO和HT29细胞株中THBS1和VEGF-C/D结合及蛋白表达情况Fig.2 Binding of THBS1 and VEGF-C/D and their expression in LOVO and HT29 cells
2.3 转染后细胞株中THBS1及VEGF-C/D蛋白的表达水平
采用Western blot法检测转染了miR-19a抑制物的LOVO及转染了miR-19a 过表达质粒的HT29细胞株中THBS1及VEGF-C/D蛋白表达水平，结果如图3所示，与对照组相比，LOVO在转染了miR-19a抑制物后，THBS1的蛋白表达显著上升，VEGF-C的蛋白表达显著下降，VEGF-D变化不明显；HT29在转染了miR-19a的过表达质粒后，THBS1的蛋白表达显著下降，VEGF-C的蛋白表达显著上升，VEGF-D变化不明显。

2.4 转染后细胞的迁移能力
采用细胞划痕实验检测不同转染组LOVO及HT29细胞株的迁移情况，结果如图4所示。

结果显示，调控miR-19a表达后，LOVO细胞的迁移能力均显著下降，而HT29细胞的迁移能力有显著上升。

2.5 裸鼠移植瘤生长结果
皮下接种移植瘤结果显示，接种正常LOVO细胞的裸鼠瘤块最大，直径为13～16
mm；注射shRNA NC组的裸鼠瘤块直径为9～12 mm，而注射了miRNA抑制物组的裸鼠瘤块明显变小，最大的直径仅为8.8 mm。

这从体内实验证实了LOVO 细胞中miRNA-19抑制物可以抑制LOVO细胞的生长。

2.6 瘤体组织中CD34的表达结果
取各组裸鼠瘤块组织，采用免疫组化DAB染色实验检测组织中CD34的表达，阳性结果为细胞核或细胞质内出现棕色或棕黄色物质沉积。

结果显示对照组(Control)阳性表达细胞最多、其次为shRNA NC组，而注射了miRNA抑制物(shRNA)的裸鼠瘤体组织中阳性表达细胞最少。

说明LOVO细胞转染miRNA抑制物后，CD34的阳性表达降低。

见图5。

A：Western blot检测结果；B：灰度分析结果；与shRNA组比较**P<0.01；与过表达组比较，△△P<0.01；LOVO中，CK：正常LOVO细胞对照组；shRNA：LOVO+miR-19a抑制物组；NC：LOVO+miR-19a抑制物NC组；HT29中，CK：正常HT29细胞对照组；过表达：HT29+miR-19a过表达质粒；NC：
HT29+miR-19a过表达质粒NC组图3 miR-19a表达抑制前后THBS1及VEGF-C/D的蛋白表达情况Fig.3 Protein expression of THBS1 and VEGF-C/D before and after inhibition of miR-19a expression
与过表达NC组比较，**P<0.01；与shRNA NC组比较，△△P<0.01图4 miR-19a转染前后HT29及LOVO细胞的迁移能力Fig.4 Migration of HT29 and LOVO cells before and after miR-19a transfection
2.7 裸鼠瘤体组织中THBS1、VEGF-C、VEGF-D蛋白水平
采用Western blot法检测瘤体组织中THBS1及VEGF-C/D蛋白表达水平，结果如图6所示。

结果显示，相比于对照组，转染了miR-19a抑制物后，肿瘤组织中THBS1的蛋白表达显著上升，VEGF-C的蛋白表达显著下降，VEGF-D变化不明显；相比于对照组，转染了shRNA NC后，肿瘤组织中THBS1、VEGF-C、
VEGF-D蛋白表达变化均不明显(均P>0.05)。

图5 移植瘤组织中CD34免疫组化染色及对比(×200)Fig.5 Immunohistochemical staining of CD34 in transplanted tumor tissues and the comparison(×200)
与shRNA组比较，**P<0.01图6 THBS1、VEGF-C、VEGF-D蛋白的Western blot测定结果Fig.6 Western blot analysis of THBS1，VEGF-C，and VEGF-D proteins
3 讨论
目前结肠癌严重威胁着人类健康[9-10]。

而淋巴转移是结肠癌治疗失败的主要原因，因此淋巴结转移的机制一直是肿瘤研究的热点之一[11-13]。

近年来随着淋巴管生
成特异调控因子以及淋巴管内皮细胞特异性标志物的发现，大量相关实验研究表明VEGF-C、VEGF-D可通过调节淋巴管生成而在肿瘤淋巴结转移的过程中起着重要作用。

其中VEGF-C可主要通过VEGFR-3结合调节淋巴管生成，VEGF-D可与VEGFR-2和VEGFR-3结合促进淋巴管生成[14-17]。

近年来有研究表明THBS1
是目前为止发现的最重要的一种抗血管生成因子，有可能通过调节VEGF-C/D的
生成而影响肿瘤淋巴结转移[18-19]。

大量研究表明microRNA通过调控癌基因和抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管生成、蛋白裂解等生物程序的调控，决定癌细胞的恶性特征。

研究表明miR-19a与肿瘤淋巴结转移密切相关[20]。

本文通过体外实验发现，miR-19a在LOVO细胞中表达最高，在HT29细胞中表达最低，提示miR-19a表达与结肠癌细胞恶性程度一致。

其次，THBS1蛋白表达HT29细胞高于LOVO细胞，此与miR-19a的表达相反；VEGF-C/D蛋白表达
HT29细胞低于LOVO细胞，此与miR-19a的表达呈正相关。

说明miR-19a、THBS1及VEGF-C/D的表达情况与结肠癌细胞恶性程度关系密切。

有研究报道
[21-22]miR-19a在LOVO细胞中呈现高表达，且与LOVO细胞增殖能力正相关，与本文结果一致。

以上实验结果表明，miR-19a可通过下调THBS1表达使
THBS1与VEGF-C结合减弱促进VEGF-C表达，进而促进淋巴转移。

为了进一步验证这一结果，课题进行了体内实验，成瘤结果表明沉默了miR-19a 后，成瘤体积明显变小，瘤体组织中CD34蛋白表达降低(淋巴管密度减小)，THBS1的蛋白表达显著上升，VEGF-C的蛋白表达显著下降，而VEGF-D变化不
明显。

提示miR-19a可通过下调THBS1表达促进VEGF-C表达，进而促进肿瘤
生长，验证了细胞实验结果。

综上所述，本实验通过体内外实验研究发现miR-19a可通过下调THBS1表达，
促进VEGF-C表达进而促进淋巴管转移，揭示在结肠癌淋巴结转移中存在miR-
19a-THBS1-VEGF-C的调控途径。

本研究结果对现有的结肠癌淋巴结转移机制进行了进一步的验证以及更深入的探究。

从而可以更好地预测结肠癌患者转移风险，为提高临床治疗效果提供理论依据。

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