孕期限食对子代小鼠生长代谢及卵母细胞dna甲基化水平的影响

摘要
孕期限食对子代生长代谢及卵母细胞DNA甲基化水平的影响
硕士研究生张婷婷
导师张翠莲葛照嘉
生殖医院
郑州市450003
摘要
背景：
随着“减肥热”的流行，孕妇在妊娠期间控制饮食的现象也开始出现，因此，宫内营养不良不再局限于物质匮乏地区的孕妇中，也出现在妊娠期限制饮食的孕妇中。

宫内营养不良不仅会直接导致胎儿在子宫内的发育和生长受到限制，也会增加子代在成年后患代谢性疾病的风险。

“表观遗传学”是指在DNA序列没有发生任何改变的情况下，环境变化与个体表型改变之间的关系。

这一概念的提出为宫内不良环境对子代产生影响的机制提供了合理的解释。

越来越多的研究结果都表明，表观遗传学修饰可稳定遗传给后代。

而亲本代系间遗传的唯一途径就是通过生殖细胞。

孕期不仅是胚胎发育的重要时期，也是原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）开始形成并分化成为生殖细胞的重要时期，同时伴随着细胞内DNA甲基化大规模地擦除与重建。

DNA甲基化的发生和去除需要DNA甲基转移酶、活性甲基、去甲基化酶的参与。

环境不利因素有可能影响机体内DNA甲基转移酶、去甲基化酶的活性或者活性甲基的数量而干扰DNA甲基化的正常发生与去除。

在胚胎期，发生DNA甲基化水平变化的基因包括调控胚胎在子宫内发育的印记基因和调控糖脂代谢的代谢基因。

目的：
为探究孕期宫内营养不良对子代的影响及相关机制，我们建立了孕期限食
摘要
的小鼠模型，通过观测子代小鼠生长代谢的相关指标及卵母细胞内印记基因、代谢基因甲基化水平来探究孕期营养不良对子代的影响及其表观遗传学机制。

方法：
正常见栓的孕鼠自E0.5至E12.5监测每日消耗食物量，E12.5天，随机将孕鼠分为实验组和对照组，实验组孕鼠给予日常消耗食量的一半食物量至分娩日，对照组孕鼠自由摄食。

两组孕鼠分娩后均在给予正常食物量。

观测子代小鼠的出生数量、体重、性别比，同时监测子代小鼠在不同生长时期的体重。

待子代小鼠性成熟后，行葡糖糖耐量实验（GTT）、胰岛素耐量实验（ITT）检测子代小鼠的葡萄糖及胰岛素代谢情况。

最后，取子代雌鼠的卵母细胞，经重亚硫酸盐处理后检测印记基因H19、IGF2r、瘦素基因（Leptin，lep）及脂联素基因（adiponectin,adip）的甲基化水平。

结果：
（1）与对照组的孕鼠相比，限食孕鼠越接近分娩日状态越差，活动量极少，个别状态极差的孕鼠在分娩前死亡。

妊娠第19天左右，限食孕鼠与对照孕鼠相比体型偏小，早产发生率明显增加（P＜0.05）。

（2）两组孕鼠所分娩的子代小鼠数量及雄鼠所占比例相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。

但是限食孕鼠的子代整体出生体重偏低，与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。

（3）限食孕鼠的子代在3周龄时体重仍然低于对照组子代小鼠的体重，但在6周龄时却赶超对照组子代小鼠的体重，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

6-8周龄时期，对照组子代小鼠的体重增长进入平台期，增长缓慢。

但是限食孕鼠的子代小鼠的体重值仍在迅速增加，并在8周龄时明显高于对照组子代小鼠，两组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。

根据子代小鼠雌雄性别的不同分别绘制生长曲线，结果显示与对照组子代小鼠相比，限食孕鼠的子代雄鼠超重或肥胖，而雌鼠体重偏低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

（4）子代小鼠性成熟后，GTT、ITT实验结果显示，实验组和对照组子代小鼠的血糖曲线趋势一致，各时间点血糖值的差异也无统计学意义。

（5）重亚硫酸盐处理结合限制性内切酶反应结果显示，限食孕鼠的子代卵母细胞内印记基因H19、IGF2r的甲基化水平与对照组一致，未见异常。

对照组子代小鼠卵母细胞中Leptin的甲基化水平为1.76％，
摘要
限食孕鼠的子代小鼠卵母细胞中Leptin的甲基化水平为1.18％，差异无统计学意义（P＞0.05）。

adiponectin基因在限食孕鼠的子代小鼠和对照组子代小鼠的卵母细胞内甲基化比例分别是32.5％和35.0％，差异无统计学意义（P＞0.05）。

（6）子二代F2-UC和F2-CU在产仔数量及雄性小鼠所占比例上与对照组小鼠无统计学差异。

F2-UC出生体重偏低，但是差异无统计学意义（P＞0.05）；F2-CU 的出生体重则明显高于对照组子代小鼠的出生体重（P<0.05）。

结论：
孕期限食明显增加早产率，并且造成子代低出生体重。

子代雄鼠在性成熟后有明显的肥胖趋势，而雌鼠体重值偏低。

子代小鼠尚未表现出明显的葡萄糖及胰岛素代谢异常。

尽管限食子代的卵母细胞印记基因H19、IGF2r及代谢基因Leptin、adiponectin的甲基化水平未发现异常，但子二代的出生体重异常，可能存在其他机制经卵母细胞跨代遗传从而影响了子二代胚胎的发育。

关键词：孕期限食；DNA甲基化；卵母细胞；印记基因
Abstract
The effect of maternal dietary restriction on growth and metabolism in offspring and the DNA methylation in their
oocytes
By Tingting Zhang
Supervisor:Prof.Cuilian Zhang Prof.Zhaojia Ge
Reproductive Medicine
People’s Hospital of Zhengzhou University
Abstract
Background:
With the popularity of“lose weight”recently,be on a diet become common in pregnant women too.Therefore,intrauterine malnutrition is no longer present in pregnant women of the poverty-stricken areas,also appear in the pregnant women who're dieting.Intrauterine malnutrition can cause the growth restriction of fetal in utero and increase the risk of metabolism disorders when they grow up.
The term‘‘epigenetic’’was pointed out to document the association between environment and phenotypically changes without any change in DNA sequence. Furthermore,it proffered an explanation of how intrauterine malnutrition influence the growth and metabolism of their offspring.More and more evidences showed that the epigenetic modification can be stably inherited to the offspring through germ cells. Gestational period is not only the important period of embryo development,but also an important period of the primordial germ cells(PGCs)form and differentiate to germ cells,accompany by the large scale DNA methylation reprogramming.DNA methyltransferase(DNMTs)、active methyl and demethylation enzymes are take part in the DNA methylation reprogramming.Adverse environmental factors may affect
Abstract
the activity of DNA methyltransferase or the number of active methyl,and so that the DNA methylation reprogramming are interfered.Genes involved in the DNA methylation reprogramming include the imprinting genes that regulate the development of the embryo in utero and the metabolic genes that regulate the metabolism of glucose and lipid.
In order to investigate the effect of adverse intrauterine environment on the development of fetal and the mechanisms of epigenetics,we established a mouse model of maternal food restriction to explore the impact of intrauterine malnutrition on the growth and development and the DNA methylation level of genes in their offspring.
Objective:
we established a mouse model of maternal food restriction to explore the impact of intrauterine malnutrition on the growth and development and the DNA methylation level of genes in their offspring.
Methods:
ICR mice were mated with the normal male mice(1:1)in the first day.Next day, the mice with vaginal plug were considered as pregnancy.The pregnancy mice were grouped into the intrauterine malnutrition group and the control group randomly.The day found vaginal plug was seen as the0.5day of pregnancy(E0.5),the food eaten by pregnant mice every day was monitored from E0.5to E12.5.The mice in the intrauterine malnutrition group were given half food of the daily consumption during E0.5-E12.5.The mice in control group were given normal amount food.The pregnant mice of both groups were given normal food after delivery.The number, birth weight and sex ratio of the offspring were observed,and the weight at different growth stages too.Once the offspring was8weeks,the glucose tolerance test(GTT) and insulin tolerance test(ITT)were conducted to detect the carbohydrate and insulin metabolism.Finally,the oocytes of female offspring mice were obtained to detect the DNA methylation level of genes with bisulfite treatment.
Abstract
Results:
(1)Compare to normal feeding pregnant mice，mice with food restricted were less active,some of them were died before delivery.The pregnant mice with food restricted were smaller than the control mice at the delivery day.And the incidence of premature delivery was significantly increased(P<0.05).Abortion,stillbirth were common in pregnant mice with food restriction,but the difference was not statistically significant(P>0.05).(2)The number of offspring between this two groups was similar(P>0.05).As well as the number of male offspring between the two groups(P>0.05).However,the offspring of food restricted pregnant mice showed significant low birth weight(P<0.05).(3)At the age of3weeks,there was still a low weight in the offspring of the food restricted pregnant mice,but the difference had no significant difference between groups(P>0.05).After weaning at 3weeks,the offspring of food restricted pregnant mice began the catch-up growth.At the age of6weeks,the average body weight of offspring of food restricted pregnant mice was higher than that of the normal offspring,but the difference was not statistically significant(P>0.05).During the period of6-8weeks,the weight of offspring of normal pregnancy mice increased slowly.But the body weight of offspring of food restriction pregnancy mice increased rapidly.At the age of8weeks, the body weight of offspring of food restriction pregnancy mice was significantly higher than that in control group(P<0.05).According to the growth curve of male and female offspring,the male offspring mice of food restriction pregnancy mice were overweight or obese,but the weight of the female mice was low.The difference was not statistically significant(P>0.05).(4)The metabolic curve of GTT and GTT experiments were similar between offspring of both groups.(5)The methylation level of H19and IGF2r in oocyte from offspring of both groups were similar.The methylation level of leptin in oocyte from offspring of normal pregnancy mice was 1.76%,with it was1.18%in oocyte from offspring of food restriction pregnancy mice, but the difference was not statistically significant(P<0.05).The methylation ratios of adiponectin gene in the offspring of food restriction pregnant mice and normal pregnant mice were32.5%and35%,respectively.The difference was not statistically significant(P>0.05).(6)Compare to the control group,the whole number and the
Abstract
male mice number of F2-UC and F2-CU had no significat difference between groups. Though the difference was not statistically significant,the birth weight of F2-UC was lower.The birth weight of F2-CU was significantly higher than control group (P<0.05).
Conclusion:
Food restriction at pregnancy period not only affect the outcome of pregnancy, but also increased the rate of stillbirth and premature birth.It also cause the low birth weight of offspring.The male offspring demonstrated obesity at8weeks,but the body weight of female rats was low,they all have normal glucose and insulin metabolism.Although the methylation level of H19,IGF2r and leptin,adiponectin were normal,the second generation offspring showed abnormal birth weight.There may be other mechanisms affect the growth and development of second generation offspring.
Key words:Food restriction;DNA methylation;oocytes;imprinting genes
目录
目录
正文部分
1前言 (1)
2材料与方法 (5)
3结果与分析 (18)
4讨论 (24)
5结论 (28)
参考文献 (29)
综述部分
宫内营养不良对子代生长代谢的影响及其表观遗传学机制研究进展 (33)
参考文献 (39)
附录部分
个人简历及在校期间发表论文 (43)
致谢 (44)
前言
孕期限食对子代生长代谢及卵母细胞DNA甲基化水平的影响
硕士研究生张婷婷
导师张翠莲葛照嘉
生殖医院
郑州市450003
1前言
胎儿期作为生命体形成和发育的最早时期，可塑性强，易受环境的影响。

大量的研究结果表明胎儿所处的子宫内环境，不仅会直接影响胎儿在子宫内的发育，也会影响子代成年后患糖尿病、高血压、肥胖及脂类代谢异常等代谢性疾病的概率,这就是胎儿起源假说（Fetal Programming Hypothesis）[1]。

胎儿起源假说（Fetal Programming Hypothesis）是在80年代由英国著名学者Baker提出的，该假说认为胎儿为了适应周围欠佳的子宫内环境会产生代谢或激素水平的变化，而这些变化将持续至出生后，并在子代成年时期引起机体代谢功能障碍。

1998年Lucas根据以上观点又提出了营养程序化(nutritional programming)的概念，进一步支持了胎儿起源假说。

营养程序化假说认为在个体发育的关键时期，营养状况将使机体产生适应性的改变，永久性地改变细胞数量或比例，从而对机体或个体的组织器官产生可持续终生的影响[2]。

之后又有学者提出代谢程序化(metabolic programming)假说，主要为2型糖尿病及其他慢性代谢性疾病的发病机制提供了胚胎起源的解释，该假说认为胎儿为适应宫内营养不良的环境而不得不发生胰岛结构或其他内分泌器官功能的改变，导致靶器官对这些内分泌激素的敏感性下降,这些改变持续至成年期，造成糖尿病或某些慢性代谢性疾病的发生[3]。

21世纪后，健康与疾病的发育起源假说(the developmental origins of health and disease，DOHaD)的提出，比较完整地阐述了机体在发育过程中早期经历的不良因素与成年期糖尿病及其他代谢性疾病、心血管疾病、神经精神性疾病发生发展的关系[4]。

该假说是胎儿起源学说、营养程序化假说及代谢程序化假说的进一步完善和拓展，不仅将机体早期发育关键时期的致病因素从宫内扩展到宫外，而且将后代易患的疾病范围从糖尿病、心血管等慢性代谢性疾病拓展
前言
到神经、精神性疾病，并且早期的不良环境不仅涵盖了营养不良，也包括其他不良刺激，如行为和精神因素等。

关于胎儿起源等相关假说的细胞分子学机制，目前尚无定论。

部分学者认为早期营养不良可能使胚胎期细胞数量永久性减少，从而影响成年后器官的结构和功能。

也有假说认为母体营养不足时，为保证脑和心脏等重要脏器充足的葡萄糖供应，胎儿胰岛素分泌减少，对胰岛素抵抗增加，这种胰岛素抵抗持续到胎儿出生后就引起了相应的代谢表型[5]。

更多的学者认为孕期不良环境可以造成胚胎细胞的DNA甲基化等表观遗传学修饰的改变，导致基因表达异常从而对机体造成了永久性的改变[6]。

而且后续研究结果发现这些表观遗传学修饰的改变可传递给下一代[7]。

孕期不仅是胚胎发育的重要时期，也是原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）开始形成并分化成为生殖细胞的重要时期。

原始生殖细胞是一种类似于胚胎干细胞的多潜能分化细胞，可根据性别染色体的不同增殖分化形成相应的生殖腺和器官。

小鼠的原始生殖细胞在交配后第7.5天（E7.5）左右开始出现，并逐渐向生殖嵴迁移，迁移过程中伴随着大量的细胞增殖。

在交配后第10.5天（E10.5）左右，大部分原始生殖细胞到达生殖嵴，失去迁移能力，继续分化最终形成性原细胞[8]。

卵原细胞在第13.5天（E13.5）左右停止增殖，开始进入减数分裂，停留在第一次减数分裂的双线期直至出生后随着排卵过程的发生完成减数分裂，经上述过程卵原细胞最终形成成熟的卵母细胞。

雄原细胞则在第12.5天（E12.5）停止减数分裂，进入有丝分裂，并停留在G0/G1期，出生后完成减数分裂形成精子[9,10]。

在哺乳动物受精卵形成后的卵裂时期和原始生殖细胞形成的过程中，都伴随着细胞内DNA大规模去甲基化的发生[11]。

经过这两个时期的去甲基化，几乎来自亲代的所有甲基化修饰均被去除。

去甲基化的方式有两种，一种是主动去甲基化，是在DNA分子上去除从亲代遗传来的甲基化标记，该过程需要在去甲基化酶的催化作用下发生，与DNA的复制无关。

在去甲基化酶的作用下，胞嘧啶上的甲基能被脱甲基成为羟基、羧基和醛基[12,13]。

另外一种去甲基化的方式是被动去甲基化，是由于甲基化的维持机制缺失导致。

如果在DNA复制时新合成的子链被阻止带上甲基化标记，那么随着复制后总遗传物质的增多，被甲基化标记的DNA被动稀释，这种被动去甲基化是受精卵形成后卵裂时期主要的去甲基化方式[14-17]。

前言
原始生殖细胞形成的过程中大规模的去甲基化现象发生在E7.5至E13.5天，并且全基因组DNA的甲基化水平在E13.5天时达到最低，只有约5%[18,19]。

这个时期的大规模去甲基化又可以概括地分为两个阶段：第一阶段是指发生在原始生殖细胞迁移过程中的大规模去甲基化，这一阶段去甲基化的主要原因是DNA甲基化维持机制的缺失，大部分基因的甲基化修饰在这个过程中被擦除[18-21]。

第二个阶段是指到达生殖嵴后的去甲基化过程。

在经历了第一阶段的大规模去甲基化后，此时原始生殖细胞中仍存在甲基化修饰的区域主要包括基因组印迹的区域、X染色体上的CpG岛和生殖细胞特异基因的差异甲基化区域[19,22][72, 76]。

这些区域的DNA甲基化主要通过去甲基化酶的作用被去除。

经过这两次的去甲基化后，只有很少部分区域的甲基化修饰被保留，这些区域包括IAP和CpG 岛[22]，这些保留甲基化修饰的区域为表观遗传信息的跨代遗传提供了相应的分子学依据。

经过上述提及的大规模的去甲基化，原始生殖细胞随后开始根据雌雄性别的不同在生殖细胞中重新建立起新的DNA甲基化模式，主要发生在印记基因上。

雄性生殖细胞父源特异的甲基化印迹的建立是从E14.5到小鼠出生时期逐步建
立起来的，主要由甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3L参与建立[23,24]。

但是在雌性生殖细胞的发育中，母源特异的DNA甲基化的重新建立发生在小鼠出生后，从卵母细胞处于有丝分裂前期的双线期开始，持续到性成熟时期卵母细胞发育成熟的整个过程中[25,26]。

其建立机制也主要是Dnmt3a和Dnmt3L催化的从头甲基化过程[27-29]。

这些在雌雄生殖细胞发育中重新建立的不同的甲基化状态，形成了亲本来源特异的差异甲基化的状态，在生殖细胞的发育分化及受精后子代胚胎发育的过程中持续维持。

因此，妊娠期胚胎在子宫内发育的过程不仅是原始生殖细胞形成的重要过程，同时也是表观遗传学修饰尤其是DNA甲基化擦除和重建的重要时期。

孕期胚胎对环境影响极其敏感，不良的子宫内环境可能导致表观遗传学修饰的改变，并通过生殖细胞传递给后代。

目前较为常见的宫内不良环境主要是由于营养状态的异常和毒害物质暴露造成。

最常见的有妊娠期合并糖尿病或者肥胖导致的宫内高糖环境及妊娠期营养不良造成的宫内营养不良。

战争饥荒时期的孕妇的流行病学资料是关于宫内营养不良对子代影响的最早研究。

孕期营养不良可增加子代患心血管疾病、代谢性疾病、情感障碍性疾病的风险[30-33]。

有研究表明宫内环境对子代的影响可通过改变精子DNA甲基化水平进而导致子代代谢的异常
前言
[34]。

卵母细胞作为另一种生殖细胞，携带有更多的遗传物质，我们通过建立孕期限食的小鼠模型，研究孕期宫内营养不良对子代生长代谢的影响，同时研究子代小鼠的卵母细胞内基因甲基化水平的影响，探究孕期不良环境表观遗传学修饰跨代遗传的分子机制。

材料与方法
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
本实验以普通ICR小鼠为实验对象，购于青岛大任富城动物养殖有限公司，饲养于青岛农业大学动物科技学院的动物房内，饲养条件为：12小时光照/黑暗周期变化，鼠房温度保持在恒温22～23℃左右，湿度在35±4％左右。

自由摄食、饮水，饲料为普通小鼠生长繁殖饲料。

2.1.2实验试剂
表2.1.2.1实验中所用试剂
试剂名称生产厂家
M2培养液Sigma
孕马血清促性腺激素PMSG宁波第二激素厂
人绒毛膜促性腺激素HCG宁波第二激素厂
生物合成胰岛素注射液Novo Nordisk A/S
透明质酸酶Sigma
重亚硫酸盐（Sodium metabisulfite）Sigma
对苯乙酚(Hydroquinone)Sigma
蛋白酶K（Proteinase K）Roche diagnostics
石蜡油北京索莱宝科技有限公司
Tris碱上海生工生物工程有限公司
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）Sigma
NAOH莱阳市康德化工有限公司
Taq Hot Start Version TaKaRa
无水乙醇烟台三和化学试剂有限公司
材料与方法
续表2.1.2.1实验中所用试剂
试剂名称生产厂家
4s red Plus核酸染色剂上海生工生物工程有限公司琼脂糖上海生工生物工程有限公司TaqαI、RsaI、BstUI内切酶New England Biolabs
2K DNA Marker TaKaRa
6ⅹloading buffer TaKaRa
pGM-T Fast连接试剂盒天根生化科技(北京)有限公司
琼脂（Agar）Sigma
胰蛋白胨OXOID
酵母提取物(Yeast extract)OXOID
Nacl上海生工生物工程有限公司
氨苄青霉素SDS 北京索莱宝科技有限公司上海生工生物工程有限公司
2.1.3实验用溶液的配制
20％葡萄糖溶液：根据所需，称取适量葡萄糖粉末，用灭菌去离子水配制20％的葡萄糖溶液，0.22μM过滤器过滤后使用。

为防止污染，每次配制少量，现用现配。

胰岛素溶液的配制：取1μL胰岛素加入1ml生理盐水，即为1IU/ml的胰岛素溶液。

为防止胰岛素失效，每次配制少量，现用现配。

PMSG及HCG的配制：取12.5mL生理盐水完全溶解1000IU PMSG或HCG 的冻干粉，即为浓度为80IU/mL的PMSG或HCG工作液，300μL/管分装待用，-20°存放，防止反复冻融。

胰蛋白酶消化液的配制：准确称取0.01g胰蛋白酶粉末，加入M2培养液10mL，每100μL分装于PCR管内，置于-20°存放，避免反复冻融。

1％的琼脂糖溶液的配制：称取1g琼脂糖加入100ml灭菌超纯水后微波炉融化，完全溶解后快速分装至200μL的PCR管内，4°保存待用。

材料与方法
重亚硫酸盐溶液的配制（避光操作）：准确称量3.8g重亚硫酸盐，加入4mL 灭菌超纯水溶解。

称取0.11g对苯乙酚用1mL超纯水溶解后加入上述重亚硫酸盐溶液中。

混匀后再加入适量3M NAOH调节溶液PH值为5.0左右。

3M NAOH溶液的配制：称取NAOH粉末0.6g，加入灭菌超纯水5mL即为3M NAOH溶液。

为防止溶液长时间存放PH值发生变化，使用时现用现配。

1M Tris-Hcl溶液的配制：称取Tris碱粉末60.55g，用超纯水定容至500mL，加入浓HCL溶液调整溶液PH至8.0左右，4°保存。

0.5M EDTA溶液的配制：准确称取乙二胺四乙酸二钠粉末37.22g，少量灭菌超纯水溶解后用灭菌超纯水定容至500mL，加入NAOH调整PH至8.0左右，4°保存。

20％SDS溶液的配制：称取SDS粉末20g，加入100mL灭菌超纯水，缓慢溶解，避免SDS起泡现象，4°存放。

蛋白酶K工作液的配制：称取0.4g蛋白酶K，加入由100μL1M Tris-Hcl 溶液、200μL0.5M EDTA溶液、500μL20％SDS溶液、9.2mL超纯水配制成的裂解缓存液，即为20mg/mL的蛋白酶K浓储液。

使用前取部分浓储液，利用裂解缓存液等比例稀释为40μg/mL工作液，分装待用，-20°放置，避免反复冻融。

在此过程中，小心溶解蛋白酶K，尽量避免SDS起泡现象。

Tris-EDTA缓冲液的配制：取1M Tris-Hcl溶液（PH=8.0）5mL，加入1mL 的0.5M EDTA溶液（PH=8.0）后，超纯水定容至500mL。

50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制：准确称量Tris碱242g，EDTA粉末18.612g于1L烧杯中，加入适量超纯水搅拌，使其完全溶解后加入57.1ml的冰乙酸，最后用NaOH调pH至8.3，用超纯水定容至1L后，室温保存。

使用时稀释50倍即为1×TAE缓冲液。

LB固态培养基的配制：准确称量胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，琼脂3g，NaCl固体2g，加入200mL超纯水，高压蒸汽灭菌后置于4°保存待用。

LB液态培养基的配制：准确称量胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl固体2g，加入200mL超纯水，高压蒸汽灭菌后置于4°保存待用。

0.01g/mL的氨苄青霉素（AMP）溶液的配制：精确称量氨苄青霉素粉末0.01g，加入1mL灭菌超纯水，每50μL分装后-20°保存。

氨苄青霉素放置时间过长或反复冻融均易失效，每次配制不宜过多，且要分装避免反复冻融。

材料与方法
2.1.4实验仪器
表2.1.4.1实验所用仪器
仪器名称生产厂家
生物体式显微镜OLYMPUS
高速冷冻离心机Eppendorf
PCR仪Thermo
超纯水仪Millipore Milli-Q
制冰机SCOTSMAN
超净工作台北京东联哈尔仪器有限公司
注射器
0.22 M过滤器常州悦康医疗器械有限公司北京智杰方远科技有限公司
培养皿碧云天生物科技有限公司
恒温培养振荡器上海智诚分析仪器制造有限公司
恒温热台上海精宏实验设备有限公司
DNA电泳仪北京六一仪器厂
DNA凝胶成像系统君意生物科技有限公司
恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂
微量移液器Eppendorf
电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司
2.2实验方法
2.2.1孕期限食模型的建立
于第一天下午5点左右，挑选性成熟（6周龄，体重在30g左右）未经交配和生产的发情雌鼠与正常性成熟公鼠合笼。

发情雌鼠的鉴定：外阴部开放，皱璧明显，颜色为粉红色，充血肿胀，潮湿。

第二天早上8点左右检栓，若合笼雌鼠阴道内发现阴道栓（乳白色固态胶状颗粒物）则视为孕0.5天（E0.5），阴
材料与方法
道栓是交配后雄鼠精液与雌鼠阴道分泌物凝固形成的，随着交配时间的延长会消融或脱落，宜尽早观察。

出现阴道栓的雌鼠单笼饲养，给予充足饮食，并监测每日消耗食物量。

正常小鼠的妊娠周期为19天，由于小鼠交配行为发生在午夜12点，故见栓当天视为孕0.5天（E0.5）。

根据胚胎发育的特点将孕期分为孕早期（E0.5-E7.5）、孕中期（E7.5-E12.5）和孕晚期（E12.5-E19.5）。

由于在孕早期限食，无法准确估量孕鼠的日常食量，所以在预实验中，我们设置了孕中期和孕晚期限食两组。

经过孕中期限食的孕鼠成功分娩子代的数量极少，增加限食数量，模型成功率仍然极低。

孕晚期限食组虽然也有一定的孕鼠死亡率和流产率，但经大批量孕鼠限食仍能获得一定数量的限食模型，因此本实验研究的主要是孕晚期限食对子代的影响。

日常饮食量的监测具体是指在孕早中期（E0.5-E12.5）每日晨8:00放入已知重量的小鼠饲料，次日晨8:00对饲料重新称重，两次饲料称量值的差值即为当日小鼠消耗食物量。

为保证日常食物量数据的准确性，建议每日称重，并观察小鼠笼内有无大量残余鼠料，如有，及时清理。

由此而得的小鼠每日进食量取平均值，视为小鼠正常食量。

在孕E12.5天，更换新鼠笼，实验组孕鼠每日给予正常食量的一半饲料直至分娩日，对照组孕鼠不作限食处理。

两组孕鼠在分娩子一代小鼠后均给予正常饮食。

为保证子代断奶前的生长发育，对出生子代数量多于8只的，随机淘汰掉一定数量的子代小鼠，使每只母鼠哺乳的子代小鼠只数不超过8只。

子代小鼠由母鼠哺乳，不做任何处理。

子代小鼠3周龄后断奶，根据雌雄性别的不同分入新的鼠笼饲养，每笼小鼠只数不得超过4只。

2.2.2观测指标
观察两组孕鼠在妊娠期间的体型变化及状态，并在子代小鼠分娩后，统计子代小鼠总数，雌雄比例(根据肛门距离生殖器官的距离判断：距离较长者为雄性，距离较短者为雌性)以及出生体重。

监测子代小鼠在断奶（3周龄）、性成熟（6周龄）、体成熟（8周龄）的体重。

并在8周龄时行糖耐量（GTT）、胰岛素耐量（ITT）实验检测子代小鼠有无糖类或胰岛素代谢异常。

子代雌鼠8周龄后取卵母细胞进行后续卵母细胞印记基因及瘦素基因甲基化水平的检测。

糖耐量（GTT）实验：第一天下午17:00对拟行GTT实验的小鼠予禁食处理（更换新鼠笼，保证彻底禁食），禁食16小时后，于第二天早上9:00称取小。