fgfr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

fgfr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的
筛选与鉴定
医学分子生物学杂志,2005,2(5):331-336JMedMolBio1.2005,2(5):331—336
fffr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定
苏楠,宋维威,王建民,宋瑞华,刘志君,苟元彬,杜晓兰,陈林
第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军创伤中t2,,创伤,烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市,
400042
【摘要】目的构建成纤维细胞生长因子3型受体(fibroblastgrowthfactorreceptor一3,FGFR3)基因敲除载
体,并对中靶Es细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR3条件性敲除小鼠模型或FGFR3功能减低小鼠,研
究FGFR3在小鼠骨骼等器官发育,损伤修复过程中的作用打下基础.方法在分析小鼠fffr3基因组DNA序
列结构的基础上,设计并构建了针x~/l,鼠fffr3外显子9,10的条件性基因敲除载体,采用电穿孔法转染Es
细胞,用G418与Ganeyclovir对电转的Es细胞进行正负筛选,最后对Es细胞克隆做Southern与PCR鉴定.
结果对Es细胞正负筛选后共挑取180个克隆;用5端探针进行Southern杂交鉴定后发现2株阳性克隆;经
PCR检测发现这两株克隆fffr3的8号内含子内的LoxP序列丢失.结论得到两株fffr3基因中只含有neo基
因的Es细胞克隆,fgfr3的表达是降低的,可用来建立FGFR3功能降低的小鼠. 【关键词】成纤维细胞生长因子3型受体;条件性敲除;同源重组;Cre蛋白;Es细胞【中图分类号】Q78 ConstructionofTargetingVectorforKnockoutofMurinefgfr3andthe ScreeningofTargetedESCells
suNan,SONGWeiwei,WANGJianmin,SONGRuihua,LIUZhijun,GOUYuanbin,DUXia olan,
CHENLin
TheCenterofPLATraumaReseach,theThirdMilitaryMedicalUniversity,theLaboratoryof Trauma,
BurnsandComplexWoundResearch,Chongqing,400042,China
【Abstract】objectiveToexplorethefunctionsofFGFR3signalsinmouseorganogene—sis.MethodWefirstmadeafgfr3knockoutconstruct,inwhichtheexon9and10offgfr3were floxedandcouldbedeletedbyCre.mediatedrecombinationofLoxP.Then.weobtainedandid entified
thetargetedESclones.OnthebasisofanalysisofCre.mediatedrecombinationofLoxP.acond itional
targetingconstructwasmade.Atfirst,theCre.mediateddeletionoffloxedexon9and10offffr 3was
confirmedbyintroductionofthetargetingvectorintoCre.expressingAmIbacteria.Thetrans fectionof targetingvectorintoEScellswasthencarriedoutbyelectroporation,transfectedEScellswere screenedwithG418andGancyclovir.andfinally,theEScloneswithcorrecttargetingeventw erei.
dentifiedbySouthernblotandPCR.ResulIsPCR,restrictionenzymedigestionandsequence analy.
sisconfirmedthatatargetingvectorforknockoutofmurinefgfr3wassuccessfullymade.180 ESclones
werecollectedafterscreeningbybothG418andGancyclovir.andtwopositiveEScloneswere f0und
bySouthernblotof5'endflankprobe.buttheirLoxPinsideintron8werefoundlostby PCR.Conclutsion'Aftersuccessfulmakingoftargetingconstructforknockoutofmurinefgfr 3,two
targetedEScloneswereobtainedwithneoinsertioninintron8offgfr3.whichcanbeusedtogen erate
amousestrainwithdownregulatedexpressionoffgfr3.
资助项目:国家重点基础研究发展规划项目((973计划)No.2005CB522604);国家杰出青年科学基金(No.30425023);重庆市科技计划项目
(No.CSTC.2004BA5016)
作者简介:苏楠,女,1980年生,硕士研究生
通讯作者:陈林(电话*************,E—mail:*****************) TheworkwassupportedbytheSpecialFundsforMajorStateBasicReseachProgramofChina (973Program)(No.2005CB522604),agrantfromNational ScienceFundforDistinguishedY oungScholars(No.30425023)andCommitteeofSciencea ndTechnology.ofChongqing(No.CSTC.2004BA5016)
Author'sbriefintroduction:SUNan,female,bornin1980,Graduatestudentformasterdegree Correspondingauthor:CHENLin(Tel:86—23-68757572,E—mail:******************)
332'楠.等./基破除载的建技I化细胞的筛选鉴定
【Keywords]fit)r(1t)laslgro+vthfa(?l.rre(pt()r一3(FGFR3);knock.ut;re(..mbina—
tion;CI'e;EScells
成纤维细胞生长因子3型受体(fibroblastgrowth
factol'receptor一3,FGFR3)在骨骼等器官的发育过程
中具有重要作用.Deng等建立的fgfi3基因敲
除小鼠中的fgfr3在昕有组织均被敲除,不易用该模
型区分FGFR3在特定细胞表型中的作用和机制,而
且该小鼠生命周期较正常小鼠短,不利于长期动态
研究FGFR3在器官发育和疾病中的作用条件性基
因敲除或仅部分降低.功能的小鼠可分别避免
述问题:我们利用c—lJoxp系统,设计并构建了
旨在呵条件性敲除fgfr3外显子9,10的载体,若与
载体发生同源重组(中靶)的Es细胞保留丫插入
NIJf~)3内含子8中的Ix~xP,则可以用此细胞来建立fgfi-3条件性敲除小鼠;若中靶Es细胞中该LoxP丢失,则可用来建立fgfi-3功能减低的小鼠
1材料和方法
1.1材料
质粒:pBluescriptⅡSK一(Stratagene公司),
基因敲除载体ploxpneo,ES细胞株(美国NIH邓初
夏博士惠赠);含有C57BL/6J小鼠fgfi-32号内含子到l9号外显子的载体pBShFR3B(本实验室保存); DH5a(本实验室保存);组成型表达Cre重组酶的
大肠杆菌AmI菌种(美国密苏里大学Rucker博士惠赠),G418抗性的小鼠胚胎成纤维细胞(本实验
室制备保存).工具酶为NewEngland,Roche, TaKaRa公司产品;k/Hindmmarker,DL2000marker
为TaKaRa公司产品;质粒DNA抽提试剂盒为Ome- ga,Qiagen公司产品;胶回收试剂盒为Qiagen, TaKaRa公司产品;测序由本实验室自行完成
(ABI310型基因测序仪);引物由上海博亚公司合成;电穿孔仪,电穿孔杯为BioRadGenePulserlI System(BioRad公司)LIF,DMEM高糖培养基,
L一谷氨酰胺,非必需氨基酸,青一链霉素溶液,(一巯基乙醇,胎牛血清,丝裂霉素C,DMSO,PBS缓冲
液(pH7.2),EDTA一胰酶,G418,Gancyclovir,明
胶等试剂分别购自GibcoBRL,Sigma和HyClone公司.
1.2fgfr3基因敲除载体的构建及鉴定
1.2.1fgfr3基因敲除载体的构建用EcoRI+Sinai
从pBShFR3B克隆中切取3.2kb的EcoRI/SmaI片
段,该片段起于5号外显子的oRI位点,止于l0
号内含子的Sinai位点,将该片段插入pBluescriptII
SK一得到P25质粒P25质粒经Ⅱ酶切后于该位
点插入LoxP3,得到P25LX质粒,通过测序确定
Ix~xP3的插入方向正确P25LX质粒经ClaI+XbaI
酶切后作为一个同源臂插入也用ClaI+XbaI酶切过
的ploxpneo中,得到PloxP25CX质粒;另从上述pBSh.FR3B克隆中用Sinai+XbaI切取3.8kI】的片段, 该片段插入pBluescriptIISK一得到P26质粒.P26
质粒用SmnI+Nod酶切后作为另一同源臂插用坳nI
+fI酶切过的PloxP25CX质粒中得~Jfgfi3基因敲
除载体
1.2.2fgfr3基因敲除载体的酶切鉴定用限制性内
切酶NotI+XhoI,XbaI+ClaI,BamH1分别对此
载体进行酶切消化,以对所构建的载体进行初步鉴
定.
1.2.3~gfr3基因敲除载体的测序鉴定分别以
5Tone(5一AATGCAGCTGGCACGACAGG一3),NR.36 (5一TAGGTAGTCCATAACTCGG.3)和R3E5R1(5. GCCACGATCGGAGGGTACCACAC-3)为0序弓I物, 采用ABI310型基因测序仪,对敲除载体的部分序列
进行测序.引物及探针位置见图l.
1.3Cre介导fgfr3基因敲除载体重组功能的鉴定
1.3.1AmI细菌电击基因转染取AmI感受态细菌
40l,加入200ng上述fg/~3基因敲除载体DNA,
混匀后移入电穿孔杯中,用BioradGenePulserⅡElectroporation系统进行电击.电击条件为25kV,
2.5F.37℃振荡培养lh后取少量接种于含Amp
的LB培养基上,37℃培养过夜后随机挑取40个
Amp抗性克隆用于鉴定重组情况.
1.3.2PCR筛选重组细菌用位于Ix~xP35端的引
物R3ISF2(5.TGACCTCCAG(ICAATGC.3)和
LoxPl3端的引物NR36(5.TGTAAAAGGGGT.
GGGGTGGTAG一3)进行PCR,从所挑取的细菌克
隆中筛选外显子9,10和选择性标记基因neo基因
同时被剔除的克隆.
1.3.3酶切验证将所得的阳性细菌克隆菌液进行
扩增,提取质粒后用XbaI~行酶切,验证重组情况.
1.3.4测序鉴定用LoxP35端的引物R318F2对
PCR,酶切验证是阳性的细菌质粒进行测序,验证
重组情况
1.4滋养层细胞的制备和ES细胞的培养
取小鼠原代胚胎成纤维细胞,扩增后用丝裂霉素
C(MitomycinC)处理2～3h,丝裂霉素C终浓度为l0
医学分子生物学杂志,2005,2(5):331—336JMedMolBio1.2005.2(5):33I一336?333. 图1敲除载体与fg#3基因同源重组示意图
1:线性化后的基因敲除载体;2:野生型基因;3:同源重组后的鬼基因,10号外显子后多
了一个I位点.5端探针大小1,9kb:线条示I酶切后5端探针做Southern印记后显示的条带:l7
kh(野生型带)与8.8kb(突变型带)=方框表示外显子(用数字标记),//eO基因和琅;箭头示LoxP位
置及方向,自左至右分别为LoxP1～3
~w/ml,处理后的滋养层细胞分装冻存于一80℃.
1.5电击转染ES细胞
复苏的Es细胞传代后2d进行转染,转染前
2h更换新鲜培养液.传代扩增的ES细胞用胰酶消
化后重悬于PBS中,使细胞密度达到2×10个细
胞/升以上.将50g线形化的上述敲除载体DNA
与1ml细胞混匀装入电穿孔槽中电击,电击参数
为600V,25txF,200n,电击时间为32ms,电
击后的细胞分入长满滋养层的培养皿中,24h后
换成Es细胞筛选培养液(含G418,280g/ml; Ganeyelovir,2p~mol/L).
1.6ES克隆的挑取和扩增
转染后第9天挑取Es细胞克隆.将挑取的单
个未分化Es克隆置于96孔板中,充分消化后将每
个克隆一分为二,一份冻存,另一份培养后转移至
24孔培养板上扩增并提取基因组DNA.
1.7电转后中靶ES细胞的鉴定
1.7.1Southern杂交鉴定将上述G418/Gancyclo-
vir抗性的ES细胞克隆于24孔板上扩增提取基因
组DNA后,采用SpeI酶切消化,用敲除载体5
端外侧的探针进行Southern杂交.
1.7.2PCR鉴定为了检测同源重组后位于内含
子8中的LoxP3是否丢失,我们采用位于LoxP3两
倾0的弓l物R3loxPF(5.GATGCCTCAACAATACTGG—TAGCCC-3),R3loxPR(5一CCAGACAGATGGA TG. GACAGGAA-3)对LoxP3进行检测.
2结果
2.1fgfr3基因敲除载体的构建及主要酶切位点鉴定
构建完成的基因敲除载体的短臂(5
Arm)3.2kb,长臂(3Arm)3.8kb,除neo基因
5,3端各有一pLoxpneo载体本身携带的LoxP
(LoxP1,2)外,新引入的LoxP(LoxP3)位于内
含子8内.经重组酶(Cre)介导后可将外显子9,
10及(或)选择性标记基因neo基因同时剔除.
构建好的载体及主要酶切位点见图2.经NotI酶
切可呈线性化;经NotI/XhoI双酶切后得到1.4,
2.4,11kb3个片段;经XbaI/ClaI双酶切后得
到3.2,5.6,5.7kb3个片段,由于其中两个片段
大小相近,电泳时难以分开,因此电泳图中观察到
两条带;经BamHI酶切得到60bp,1.4,1.9,
11kb4条带,第一条带太小,电泳图中难以观察
到,因此只显示有3条带.上述结果与预期的酶切
结果相符(图3).
334?苏楠,
等.fgfr3荩因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定图2fgfr3基因敲除载体示意图
LoxP3位于5端同源臂内部,三角型代表LoxP
序列,rteo基因位于3与5端两同源臂之间,
基因位于5端两同源臂外侧
l234bp
23l30
94l6
6557
436l
2322
2027
图3fgfr3基因敲除载体主要酶切位点的鉴定
1:XbaI+ClaI酶切;2:NotI+XhoI酶切;
3:BamHI酶切;4:k/Hindmmarker:
2.2fgfr3基因敲除载体的测序鉴定
测序范围为两个同源臂和ploxpneo两端的3个
交界区,测序结果如下:
用5Tone测序
ACCGCGGTGGCGGCCGC(NotI)1TCTAGA(XbaI)
AfA TfATAffAAfTf『rAAfTAA(CAAAA CAACITGTAAAAA
框后序列为l9号外显子的一部分,其前端是NotI,
XbaI酶切位点(接头处),说明此载体的交界区1正确:
用NR-36测序
兀'GCACCTCAGAGAAAACCTGAGCTCCATA TGGA. GATAAGGAGGCATCAGCCCAACCACAGAAACTAT. GTICCCAAC]
TATGCTA T CTACTCGAGATAACITCGTATAATG.
CCCAAC为接头处,其前面部分为同源臂上序列的l0
号内含子,划线部分为pLoxpneo载体上的序列
用R3E5R1测序TITCTITCCCAGACCTACCTFGATGCCCCCAATGC—GATGCTCCCCTCGGAAITrCGATATCAAGCTAGCI'r
A TcGATl(ClaI)IGGA TCCCCGGGTACCGAGCTCG
AArr
ATCGA T为接头区,其前面部分序列为5号外显子的
一
部分,其后框q-序列为pLoxpneo载体上的序列.
2.3在表达Cre的细菌中鉴定fgh'3基因敲除载体Loxp间的重组情况'
2.3.1PCR鉴定用引物R3I8F2和NR36进行
PCR,筛选出外显子9,10和选择性标记基因neo
同时被剔除的克隆.电泳图谱见图4.阳性菌为
450bp左右的条带,重组失败的无条带.
l234
一bp2000l000750500250l00图4PCR鉴定基因敲除载体在AmI—Cre菌中的重组情况
1:fgfr3基因敲除载体,为阴性对照:2:fgfr3
基因敲除载体9,10外显子和.基因未被剔除
的细菌;3:fgfr3基因敲除载体9,10外显子和
.基因被剔除的细菌;4:DL2000marker
2.3.2酶切鉴定将从PCR阳性细菌中提取的质
粒用XbaI酶切后得到一条l1kb的条带,而未重
组的质粒用XbaI酶切后得到5.6kb,8.9kb2条
条带(图5),说明外显子9,10和选择性标记基
因neo可在Cre重组酶的作用下被有效剔除.结果
表明所构建的fgfr3基因敲除载体符合设计要求,
可以用于ES细胞的转染和筛选.
2.3.3测序鉴定用引物R3I8F2对PCR,酶切验
证是阳性的细菌质粒进行测序,结果如下:
CAAA TGACCTGAGGAAAACTGCCTGTTTCTCCAAC. TCTACATFGATGATGCCTCAACAATACTGGTAGCCC
CCAGI'rACCCCTGACTGACTGmGCITrCAGCGCCA CCCTCTCCAAAGGACCTGTGCTGAGTCTCTGTGCCT CACCCACACTATGCA TACTCACGAAGATCTGGATCC
TAA TAACITCGTA TAGCA TACAITA TACGAAGITATC GTGcAGGrrrGGGACATAG1TrCTGTGG1TrGGGTGAG
划线部分为SmaI后的片段.测序从起始端到这个位
置只有约230bp,未测到9,10号外显子和neo基因,与理
:分牛物学杂志,2005,2(5):331—336JMedMolBiol,2005,2(5):331—336?335?
论推测是一致的,因此重组成功
图53基因敲除载体在Aml—Cre菌中重组后
的酶切鉴定
I,3,4:重组菌中fgfr3基因敲除载体9,10号
外显子和no基因未被剔除时用XbaI酶切的情况;2:重组茵中fJr3基因敲除载体9,l0号外
显子和rle(基因都被剔除时用XbaI酶切的情况;5:3基因敲除载体用XbaI酶切的情况,
为阳性对照;6:入/Himlmmarker
2.4中靶ES细胞的初步筛选
2,4.1Southern印迹药物筛选后得到的180个
Es细胞克隆,经eI酶切消化后用敲除载体5端
外侧的探针进行Southern杂交(探针位置及eI
位点见图1),野生型出现一条17kb的非特异性条带(图6中带3).因ES细胞基因组与fgfr3敲除载体发生同源重组后,其fgfr310号内含子中多了一个SpeI位点(图5),使得其酶切后与探针杂交会
出现一条8.8kb的条带,然而同源重组一般只发生在一条同源染色体上,因此中靶Es细胞有两条带(图6).经过初步筛选,得到2株阳性ES细胞
克隆
l23kb
l7《)
88
图6el酶切后用5端探针Southern杂交结果
l,2:Bll,1341号的中靶Es细胞DNA.杂交后有
两奈带;3:野生型基因组DNA
2.4.2PCR检测LoxP采用位于LoxP3两侧的引
物R31oxPF,R31oxPR对LoxP3进行PCR检测.由
于插入的LoxP序列约63bp,在野生型仅出现一约230bp大小的条带(图7),而中靶Es的等位基因
上由于LoxP序列的插入,可出现一约290bp大小的条带,因此中靶ES细胞可出现230bp,290bp
两条带,但这两株细胞仍只含有一条230bp大小的带,说明在同源重组过程中LoxP3丢失(图7). 0
《)
《_)
《)
《)
f】
图7中靶ES细胞LoxP的PCR鉴定
l:BIl的中靶ES细胞DNA;2:B4l的中靶ES细
胞DNA;3:fg/i-3基因敲除载体阳性对照:4:野生
型基因组DNA阴性对照;5:DL2000marker
3讨论
FGFRs是一类与骨骼和其它多种重要器官发育和疾病有密切联系的跨膜酪氨酸激酶受体,包
括含3个免疫球蛋白样区(IgI,IgⅡ,IgⅢ)的
胞外区,跨膜区以及含酪氨酸激酶区的胞内区. FGFRs与FGFs有较强的亲和力,其与FGFs的结合位点包括Ig1I和igm.FGFR1-3均有不同的剪接体.fgfr3有19个外显子,其中IgⅢ由7,8,9
外显子编码,包含lgIIIb(7,8外显子编码),lg
IIIc(7,9外显子编码)两种不同的剪切体;跨膜
区由l0号外显子编码.
在人体中fgfr3的突变可引起一系列骨骼发育
缺陷性疾病,如软骨发育不全(achondroplasia,
ACH),季肋发育不全(hypochondroplasia,HCH)
和致死性骨发育不全(thanatophoricdysplasia,TD)
等¨.深入研究fgfr3在骨骼发育中的作用有重要
的临床意义,而用遗传工程小鼠模型来研究其功能
是一个很好的途径.目前,Deng等_2已经建立了
fgfr3基因敲除小鼠,该小鼠所有组织中的fgfr3均
被敲除,和其它常规基因敲除小鼠一样,在分析这
类敲除小鼠表型时不易区分被敲除基因在特定细胞
表型中的作用和机制.比如已经发现fg)Cr3基因敲
除小鼠同时存在软骨形成和骨形成异常,由于居一
fr3主要在软骨细胞表达,在成骨细胞表达较少,
难以弄清该小鼠成骨过程异常是由成骨细胞直接缺
失fgfi-3引起的,还是由fgfr3缺失所致软骨形成异
常间接引起的.此外,该小鼠因为脊柱等严重畸
形,生命周期较正常小鼠短,不利于长期动态研究
336?苏柏..脚_r3)bH敲除载f1^的迎J支I,靶}s细眦的筛选?J定FGFR3在器官发育和疾病中的作用!/3条件
性敲除小鼠和功能部分降低fl~/l,鼠可以分别避免这
些问题鉴于上述原因,我们利用Cre—Loxp系统,
设计并构建针对条件性敲除小鼠fdr3基闽外显子
9,10的载体,以期获得能同时作为fgff3条件性
敲除及/或其功能减低的小鼠模型:即若发生同源
重组(中靶)的Es细胞保留了插入到/gfi-3内含
子8中的第3号I,oxP,则可以用此细胞末建詹.
3条件性敲除小鼠,若中靶ES细胞中该I,oxP丢
失,则可用来建直3功能减低的小鼠
在本实验中所用pLoxpneo敲除载体含有nCO基
因和基【大1,可分别作为正负选择螭因,用
于筛选电转敲除载体后的ES细胞:即基组中整
合有llCO基因的Es细胞可在含有G418flg~-ff养液中存活:而在同源重组中晴基因没有丢失的ES细胞
(即随机插入等1F中靶情况)不能在含Gan('v.(-lovir
的培养液中存活,因此通过G418和Gainclovir两
种药物筛选可得到含有)'leo基因,不含f基因的
ES细胞.在Ileo基因的5和3端各含有一个
LoxP(LoxP2,1),经Cre酶作用后可将rico基
因去除,以消除IlCO基因对被敲除基因表达的干
扰根据以往基因敲除载体设计的经验,其同源臂
的总长度可在5～8kb之间,每个同源臂长度至少
0.5kh…我们将fgfr3基因敲除载体的两个同源
臂长度设计为3.2kI)和3.8kll:为能够将外显子
9,10敲除,我们在内含子8中引进了另一个LoxP
序列(LoxP3)..10号外显子编码跨膜区,因此敲
除后的fdr3由于去除r跨膜区,不能锚定在细胞
膜上,将使相关信号传导途径中断,从而达到使
FGFR3功能完全丧失的目的.Cre酶可通过介导同
一
条DNA链上两个方向相同的LoxP序列间的重组
而切除两重组LoxP之间的DNA序列,在fgj~3基
因敲除载体构建时,我们通过测序验证了3个
LoxP的序列和方向,并在表达Cre蛋白的AmI细
菌中证明Cre酶能将LoxP1,3之间的DNA序列
(包括外显子9,10,lleo基因)成功剔除,说明我
们构建的Jko~3基因敲除载体在整合至小鼠体内后
可发牛Cre介导的条件件敲除
基因敲除载体线性化后进行ES细胞电转,筛
选,鉴定,获得发生同源重组的ES细胞克隆,最
后还需要用PCR或Sout[1Prn鉴定重组后8号内含
子内的LoxP3序列是否丢失我们向ES细胞转染
敲除载体并经G418与Ganeyclovir正负双向选择培
养后,共挑取了180个Es细胞克隆-9经5端探针Southern杂交鉴定,得到了2株阳性ES细胞克隆,
经PCR鉴定LoxP时发现丫这两个ES细胞克隆的LoxP3均丢失,可用此Fs细胞来建立fdr3功能减
低的小鼠下一步我们将继续筛选同源重组后仍保
留LoxP3的克隆,为建立条件性基因敲除小鼠打下
基础,,
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