吡格列酮对肾小球系膜细胞ROS和p38MAPK的影响

吡格列酮对肾小球系膜细胞ROS和p38MAPK的影响汪姗;叶山东;孙文佳;刘皆;胡圆圆
【摘要】目的观察吡格列酮(PIO)对高糖培养的肾小球系膜细胞(MCs)p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表达和活性氧(ROS)水平的影响,探讨PIO肾保护作用及机制.方法体外培养MCs,随机分为正常对照组(NG组)、高糖(HG组)及高糖+不同浓度吡格列酮组.应用流式细胞术检测细胞ROS水平,半定量RT-PCR测定MCs p38MAPK mRNA表达情况.结果与NG组比较,HG组细胞内ROS水平明显增加,p38MAPK mRNA表达增多(P<0.01);各PIO干预组上述变化明显受抑制
(P<0.01或P<0.05),且呈剂量依赖性.结论吡格列酮可拮抗高糖诱导的MCs内ROS和p38MAPK高表达.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2014(030)001
【总页数】4页(P82-85)
【关键词】p38MAPK;活性氧;氧化应激;吡格列酮;系膜细胞;糖尿病肾病
【作者】汪姗;叶山东;孙文佳;刘皆;胡圆圆
【作者单位】安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽,合肥,230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽,合肥,230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽,合肥,230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽,合肥,230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽,合肥,230001
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R322.61;R329.24;R345.57;R692.39;R916.4
近来研究发现胰岛素增敏剂吡格列酮(pioglitazone，PIO)除降糖外尚具有抗炎、
抗氧化等的作用［1－2］，其肾脏保护作用日益受到关注，确切机制尚未明确。

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)
是糖尿病多种致病因素的共同信号通路的交汇点，参与了糖尿病肾脏细胞外基质重构和肾脏进行性纤维化［3］。

有关吡格列酮是否通过p38MAPK发挥肾保护作用尚少见报道。

本实验通过体外培养大鼠肾小球系膜细胞，观察PIO对高糖培养下
的肾小球系膜细胞氧化应激及p38MAPK的影响，探讨PIO的肾保护机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源大鼠肾小球系膜细胞(MCs)购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要药物及试剂 DMEM培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青公司;吡格列酮由江苏恒瑞医药公司惠赠;2'，7'-二氯双氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自美国Sigma公司;TRIzol购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒及PCR试剂购自大连宝生物公司;PCR所用引物由广州瑞真生物技术有限公司设计。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 MCs常规培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM液中(Glu 5.6 mol·L－1)，置37℃，5%CO2培养箱中培养。

取对数生长
期的细胞以2×105/孔的密度接种于6孔细胞培养板，培养24 h，待细胞达到亚
融合状态，换用含1%胎牛血清的DMEM培养液(Glu 5.6 mol·L－1)继续培养24 h，使细胞生长同步化，然后按下列分组进行处理:①正常对照组(NG组):DMEM
细胞培养液(Glu 5.6 mol·L－1);②高糖组(HG组):DMEM细胞培养液(Glu 2 mol·L －1);③吡格列酮1组(PIO 1 组):HG+ 吡格列酮(10－7mol·L－1);④吡格列酮2组
(PIO 2组):HG+吡格列酮(10－6mol·L－1);⑤吡格列酮3组(PIO 3组):HG+吡格列酮(10－5mol·L－1)。

不同浓度吡格列酮预先干预24 h。

以上各组标本培养48 h 后，分别收集细胞和培养上清液，每个检测指标均设6个重复组。

1.2.2 RT-PCR检测系膜细胞p38MAPK mRNA表达 TRIzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定A260/A280值在1.8～2.0之间，计算 RNA含量。

取2 μg
总RNA按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，反应体积为10 μl。

逆转录产物分别
进行p38MAPK及管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的扩增。

所用引物由大连宝生物有限公司合成。

p38MAPK引物序列上游5'-TGT TGA CCG GAA GAA CGT TGT-3'，下游 5'-CAA AGT AGG CAT GCG CAA GAG-3'，反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min的热循环，循
环35次后，终末72℃延伸10 min。

以GAPDH为内参照，94℃预变性3 min 后，进入94℃ 30 s变性、52℃ 60 s退火、72℃ 60 s延伸的热循环，循环35次，终末延伸72℃10 min。

PCR产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳后拍照，进行吸光度扫描，以p38MAPK/GAPDH条带光密度比值表示各因子mRNA的相对表达量。

1.2.3 流式细胞术检测系膜细胞内活性氧(ROS)水平 DCFH-DA本身无荧光，可
自由进出细胞膜，在细胞内可被ROS氧化为荧光物质DCF，其形成量与细胞内ROS成正比。

待细胞长满培养板底面80%时，去除原培养液，每孔加入2 ml培
养液浓度为20 μmol·L－1的 DCFH-DA 工作液，37℃ 避光孵育30 min，PBS
冲洗3遍，用含3%FBS的PBS悬浮细胞，立即上机检测。

产生荧光的细胞为阳
性细胞，不产生荧光的细胞为阴性细胞，以阳性细胞占所有细胞百分比表示各组细胞的相对荧光强度。

1.2.4 统计学分析计量资料以±s表示，应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。

采用单因素方差分析比较各组间差异，采用SNK检验进行组间两两比较，相关性
分析采用Pearson相关分析。

2 结果
2.1 PIO对高糖培养的系膜细胞内ROS水平的影响流式细胞术结果显示，未加入DCFH-DA的阴性对照组有极微量自发荧光。

与NG组相比，HG组细胞内ROS生成量明显增多(4.28±0.50 vs 17.3±0.49，P＜0.05)。

不同浓度PIO预先干预后，细胞内ROS生成量较HG组明显减少，分别为PIO 1组(7.34±0.89)、PIO 2组(9.25±0.65)、PIO 3组(10.9±0.97)，差异有统计学意义(P＜0.05)，且组间差异有统计学意义。

见Fig 1。

2.2 PIO对高糖培养的肾小球系膜细胞内p38MAPK mRNA的表达 NG组系膜细胞可低水平表达p38MAPK(0.73±0.06)，高糖刺激后，p38MAPK mRNA表达明显增加(1.09±0.13 vs 0.73±0.06，P＜0.01)。

与HG组比较，不同浓度PIO预先干预后，p38MAPK mRNA表达量较HG组明显降低，分别为PIO 1组(0.98±0.09，P＜0.05)、PIO 2组(0.87±0.12，P＜0.01)、PIO 3组(0.81±0.08，P＜0.01)。

PIO 1组与 PIO 2组(P ＜0.05)、PIO 3组(P＜0.01)之间差异有统计学意义，但PIO 2、3两组间差异无统计学意义。

见Fig 2。

2.3 相关性分析根据Pearson相关分析，MCs内p38MAPK表达与ROS水平呈正相关(r=0.62，P＜0.01)，见 Fig 3。

3 讨论
糖尿病肾病(DN)是以肾小球系膜细胞增殖、肥大以及细胞外基质过度积聚为特点的肾脏病变。

不少研究表明ROS和p38MAPK参与了糖尿病肾小球硬化的发生和发展，且两者之间密切相关［3－4］。

高糖状态下ROS产生过度，增强
p38MAPK活化程度，后者通过上调转化生长因子β1(TGF-β1)、核因子-κB(NF-κB)、纤维黏连蛋白(FN)的表达，加剧肾脏进行性纤维化。

Fang等［5］报道高糖刺激下细胞内p38MAPK磷酸化水平明显增强，且能被抗氧化剂NAC阻断，提示
氧化应激与p38MAPK信号通路的活化有着密切的关系。

因此减轻氧化应激，阻
断p38MAPK通路，对DN的防治具有重要意义。

Fig 1 Levels of ROS in mesangial cells of all groups evaluated by flow cytometry
Fig 2 Expressions of p38MAPK mRNA in MCs in different groups evaluated by RT-PCRM:Maker;1:Group NG;2:Group HG;3:Group PIO 1;4:Group PIO
2;5:Group PIO 3
Fig 3 Correlation between p38MAPK mRNA expression and levels of ROS
in MCs
研究表明［1－2］，PIO 除降糖外，还可对抗高糖引起的氧化应激，抑制体内炎
症因子表达。

Ji等［6］在对小神经胶质细胞的研究中发现，PIO可抑制
p38MAPK活化，降低脂多糖诱导的iNOS的表达和NO的生成，调节炎症过程
而发挥对神经细胞的保护作用。

本实验研究显示，高糖刺激后，MCs ROS生成明显增多，p38MAPK mRNA表达上调，细胞处于明显的氧化应激状态。

PIO预先
干预后，高糖诱导的ROS和p38MAPK mRNA高表达均有所缓解，提示PIO可
减轻高糖诱导的MCs p38MAPK表达和氧化应激程度，并具有一定的浓度依赖性，与文献报道一致［5］。

有关PIO抑制MCs p38MAPK表达确切机制尚未明确，
可能与其上调PPAR-γ表达，拮抗p38MAPK 有关［7］。

总之，本研究结果提示PIO可降低高糖诱导的MCs p38MAPK mRNA表达和氧
化应激水平，且呈浓度依赖性，该作用可能与其肾脏保护部分有关。

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