乳酸发酵——精选推荐

实训四乳酸发酵
一、实训目的
1、了解乳酸菌的生长特性；
2、了解乳酸发酵及其检测；
3、了解乳酸菌饮料的制作。

二、实训原理
乳酸菌是一类能发酵利用糖类物质而产生大量乳酸的细菌，它是一类对人体有益的菌群。

乳酸菌发酵能产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌等生理功效。

酸奶是以鲜牛奶或奶粉为主要原料，经乳酸菌发酵而制得的，具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品，具有一定保健作用。

原料乳经加热杀菌（一般采用90℃、30min）和均质后，降低到适宜的温度，添加糖和稳定剂搅拌均匀，接种乳酸菌发酵剂在适宜温度下发酵。

通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白（约占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％）变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。

同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味（与形成乙醛、丁二酮等有关）。

发酵完毕后，置于4℃左右的冷库内冷却成熟，即得成品酸乳。

应用于酸乳生产的乳酸菌主要属于乳杆菌属、链球菌属，此外还有双歧杆菌属。

生产中常用的有保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳链球菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌等。

可单菌种发酵，但一般两种或两种以上菌种混合使用。

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种纯培养发酵剂在生产中很常用。

本实验的具体内容包括：从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化，乳酸发酵及检测，乳酸菌饮料制作。

三、实训器材
1、菌种：从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离，或购买嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌、乳酸菌。

2、培养基：BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管（直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5％蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1／3为宜，115℃灭菌15min备用）。

3、试剂：脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙、10％H2SO4溶液，2%KMnO4溶液，含氨的AgNO3溶液，氯化钠，革兰氏染液。

4、仪器和器具：恒温水浴锅、pH试纸、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200~280mL)、培养皿、试管、500mL三角瓶、接种环、玻璃涂布器、载玻片、显微镜。

四、实训步骤（2人/组）
（一）乳酸菌的分离纯化
1、乳酸菌分离：取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，取其中的10-4、10-5两个稀释度的稀释液各0．1～0．2mL，分别接人BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h。

如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步判定为乳酸菌。

2、乳酸菌鉴别：选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。

若牛乳出现凝固、无气泡、呈酸性、涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入）、革兰染色呈阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。

（二）乳酸发酵及检测
1、发酵：在无菌操作下将分离的l株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，40～42℃静止培养。

2、打开三角瓶，嗅闻瓶中有无酸味，用pH试纸测定pH值。

3、乳酸定性测定：取酸乳上清液的10mL于试管中，加入10％H2SO4 1mL，再加2%KMnO41mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上，微火加热试管至沸，若滤纸变黑，则说明有乳酸存在，这是因为加热使乙醛挥发的结果。

2KMnO4+3H2SO4→K2SO4+2MnSO4+3H2O+5[O]
CH3CHOHCOOH+[O]→CH3CHO+CO2+H2O
CH3CHO十2Ag(NH3)2OH—CH3COONH4+2Ag↓+H2O+3NH3↑
（三）乳酸菌饮料的制作
1、将脱脂乳和水以1：（7~10）（质量比）的比例，同时加入5％～6％蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

2、将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2％～5％的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。

接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

3、把接种后的酸乳瓶置于40~42℃恒温箱中培养3～4h。

培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。

然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。

经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中（pH4～4．5），
凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

4、以品尝为标准评定酸乳质量：采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。

品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。

比较项目按表4-1要求。

5、注意事项
（1）当采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，利于高效分离筛选乳酸菌。

（2）制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。

（3）牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。

（4）作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。

经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7天。

五、实训结果
1、乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。

2、记录定性测定是否存在乳酸。

3、将发酵的酸乳品评结果记录于表4-1中。

表4-1 乳酸菌单菌及混合菌发酵的酸乳品评结果
六、结果讨论
1、发酵酸乳为什么能引起凝乳?
2、为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳?
3、试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌的制作乳酸菌饮料的程序。