酶联免疫吸附实验(ELISA)实验

酶免疫测定是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立一种非放射性标记免疫分析方法。

由于ELISA具有灵敏度高、
特异性强，酶免疫试剂的性质比较稳定，操作方法简便快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点，在医学基础理论研究，临床病毒学和生物化学检验等工作中应用十分广泛。

该法需将纯化的抗原包被在固相载体，与一定稀释度的待侧血清反应，然后与酶标记的第二抗体（抗人IgG，IgA，IgM或抗人IgG.A.M的混合物）反应，酶可催化色原反应，在酶标测定仪一定波长下进行比色，测定吸光度。

详细
实验方法
∙酶联免疫吸附实验（ELISA）实验
实验材料
∙血清样品
∙细胞样品
试剂、试剂盒
∙碳酸盐包被缓冲液
∙PBST
∙BSA
∙Formalin（福尔马林）
∙ ddH2O
∙碳酸盐包被缓冲液
仪器、耗材
∙96 孔酶标板
∙酶标仪
一、包被抗原
1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，加100 μ l/孔到96 孔酶标板，4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后，用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μ l 1％BSA 37℃封闭1 小时。

3. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃孵育 2 小时。

4. PBST 洗涤5 次后，加入100μ l 稀释后的HRP 标记的二抗，37℃孵育1 小时。

5. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A 405 吸收值。

二、包被细胞
1. 在96 孔培养板上接种细胞数为1 x 104cells/well，37℃过夜培养。

2. 第二天用PBS 洗涤培养板2-3 次。

3. 加入125 μ l/well10% Formalin（1:10 稀释），室温下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗涤培养板3 次，并晾干，储藏在2- 8 ℃备用。

5. 用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％BSA 37 ℃封闭1 小时。

6. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃孵育 2 小时。

7. PBST 洗涤5 次后，加入100 μl 稀释后的HRP 标记的二抗，37 ℃孵育1 小时。

8. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A 405 吸收值。

①50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na2CO30.15 克，NaHCO30.293 克,蒸馏水稀释至100 ml。

②ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：0.2M Na
2HPO42.4ml ；0.1M 柠檬酸
2.6ml ；ddH2O 5ml ；ABTS 5mg；H2O2(30%) 4 ul （用前加入）注意：
1. 一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。

2. 不同的显色系统对应不同的光吸收值。