中药及其优化培养基对双歧杆菌增殖的影响

中药及其优化培养基对双歧杆菌增殖的影响
摘要:采用比浊法确定枸杞和山药浸提物对青春双歧杆菌生长具有显著的促进作用.通过正交实验选择了该菌的两种增值培养基,其中50%枸杞浸提物的添加量为2%,25%山药浸提物的添加量为3%.对处于最佳培养基条件下,对该菌生长曲线进行了测定,稳定期时采用Hungate厌氧滚管技术计数,最高活菌数达到2.21@108cfu/mL.
关键词:青春双歧杆菌;中药;增殖;培养基优化
双歧杆菌(Bifidobacteria)是人体内不产生内外毒素的优势益生菌之一.1899年法国巴斯德研究院
Tissier博士,首次从健康母乳喂养的婴儿大便中分离到了该菌.自那以后,经过科学工作者多年不懈地研
究,认识到该菌具有营养、抗肿瘤、延缓衰老、维持肠道菌群平衡、抑制内毒素产生、增强人体免疫力等多重
功效[1,2].近年来,国内外出现了许多含双歧杆菌和其他益生菌的活菌制剂,有药品、保健饮品和乳制品
等.这些活菌制剂中的活菌数及其存活期是产品质量的关键所在.根据5卫生部关于印发真菌类和益生菌
类保健食品评审规定的通知(卫法监发〔2001〕84号)6,活菌类益生菌保健食品在其保存期内活菌数目不
得少于106cfu/mL.
双歧杆菌是严格厌氧菌,培养条件苛刻,生长十分缓慢.如何促进双歧杆菌增殖一直是研究的热点.我
们选用几种富含营养成分的天然中药(均是卫生部公布为药食同源的中药),通过将其作为双歧促进因子
(bifidus factor,简称BF)添加进培养基中[3],达到优化培养基的目的;同时,为开发新的双歧保健饮品提供
理论基础.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 中药材枸杞(Lycium barbarum),甘草(Glycyrrhiza uralensis),葛根(Pueraria lobata),山药
(Dioscorea oppositaThunb)等几种天然中药原料,均购自成都同仁堂大药房.
1.1.2 菌种青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis),由中科院微生物研究所提供,我们对该菌种
进行了活化.
1.1.3 培养基采用TPY培养基[2]作为基础培养基,配置固体培养基时,另按1.8%加琼脂粉.
1.2 方法
1.2.1 中药原料处理准确称量中药原料y按料水质量比1B10加入三角瓶中,置于80~90e水浴锅中
煎熬3h后用细密纱布过滤除渣,即得浸提物[4].浓缩浸提物至每毫升含药量为,将此浓度定为100%,依
次稀释至50%,25%,12.5%,6.25%等几个浓度,115e灭菌30min备用.不同浓度的浸提物按2%加到灭
过菌的5mL液体基础培养基中.
收稿日期:2003-05-15
作者简介:张火云(1973-),男,2001级硕士研究生.
*通讯作者
2004年2月
第41卷第1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Feb.2004
Vol.41 No.11.2.2 菌种活化及培养采用Hungate厌氧滚管技术[5]培养.
1.2.3 记数方法采用比浊法和Hungate厌氧滚管技术计数[5,6].
1.2.4 增菌培养基优化实验设计[7] 根据青春双歧杆菌的特殊营养要求和培养
基设计原则[3],固定下
面成分的用量,MgSO4#7H2O 0.05%,Na2HPO41%,KH2PO40.6%,Tween-80 0.01mL,L-半胱氨酸盐酸
盐0.01%,蒸馏水100mL,初始pH7.0.采用正交实验设计两种增菌培养基,选用正交表L9(33),优化碳源
(A)、氮源(B)、中药浸提物的剂量(C).因素水平表见表1.37e下静置培养48h后测OD600nm和pH作为实
验指标.
表1添加中药浸提物的培养基正交实验因素水平(L9(33))*
水平A:碳源(%)
(葡萄糖,乳糖)
B:氮源(%)
(胰蛋白胨,大豆蛋白胨,酵母膏)
C:浸提物(%)
(中药浸提物)
1 A1:(0.6,1) B1:(0.33,0.2,0.6) C1-1:1,C2-1:1
2 A2:(0.8,0.8) B2:(0.67,0.4,0.2) C1-2:2,C2-2:2
3 A3:(1,0.6) B3:(1,0.6,0.4) C1-3:3,C2-3:3
* C1.枸记浸提物;C2.山药浸提物.
1.2.5 测生长曲线和pH值生长曲线的测定:将活化稀释好的菌种培养液,按0.25mL量用一次性注
射器分别注入各6支5mLTPY和增菌培养基中,混合均匀,置37e恒温箱,分别培养0,12,24,36,48和
72 h,取样按照稀释法滚管计数.以培养时间(t)为横坐标,以每毫升活菌数n的对数值(lgn)为纵坐标绘
生长曲线.pH值测定:用PHS-3C型精密pH计在25e下测定.
2 结果
2.1 不同中药浸提物对B.adolescentis增殖的比较
由表2看出,与空白组相比,不同中药浸提物对B.adolescentis生长具有不同的
影响.加入0.1mL不
同浓度甘草浸提物时,浓度越大,对B.adolescentis的生长抑制越明显,可能由于甘草浸提物的粘度较大
所致.而不同浓度葛根浸提物对B.adolescenti的生长无明显影响.加入0.1mL不同浓度的枸杞和山药浸
提物,对B.adolescentis的生长均有显著促生作用,最大OD600nm值分别是空白对照组OD600nm值的1.84和
1.55倍,此时枸杞和山药浸提物浓度分别为50%和25%.因此,以下实验选用50%枸杞和25%山药浸提
物作为B.adolescentis的促生因子加入到培养液中.
表2 不同浓度中药浸提物对B.adolescentis的促生结果
不同中药浸提物
不同浓度浸提物的OD600nm值
100% 50% 25% 12.5% 6.25%
空白对照
(未加原料)
枸记0.593 0.665 0.610 0.599 0.596 0.361
甘草0.205 0.264 0.265 0.378 0.365 0.361
葛根0.359 0.364 0.366 0.360 0.362 0.361
山药0.566 0.573 0.632 0.561 0.501 0.361
2.2 两种添加中药浸提物培养基的优化结果比较
从表3和表4可以看出:对于添加枸杞浸提物,3个因素对2个考察对象值的影响都是枸杞浸提物的
浓度影响最大,3种氮源次之,两种碳源影响最小.枸杞浸提物浓度、两种氮源对pH值和OD600nm值影响显
著,两种碳源对pH影响不大,但对OD600nm值有一定的影响.最佳组合为:A2B3C2,即最佳培养基组合:葡
萄糖0.8%,乳糖0.8%,大豆蛋白胨0.6%,胰蛋白胨1%,酵母膏0.4%,50%的枸杞浸提物加入量为
2%,MgSO4#7H2O0.05%,Na2HPO41%,KH2PO40.6%,Tween-800.01mL,L-半胱氨酸盐酸盐
0.05%(培养基煮沸后加),100mL蒸馏水;添加山药浸提物对于pH值和O.D600nm 值的作用,3种氮源影
190四川大学学报(自然科学版)第41卷响最大,山药浸提物和两种碳源影响相当.考虑综合因素,最佳组合为A3B3C3,即葡萄糖1%,乳糖0.6%,
大豆蛋白胨0.6%,胰蛋白胨1%,酵母膏0.4%,25%的山药浸提物加入量为3%,MgSO4#7H2O
0.05%,Na2HPO41%,KH2PO40.6%,Tween-80 0.01mL,L-半胱氨酸盐酸盐0.05%(加法同上),100mL
蒸馏水.从所测指标上看,两种增菌培养基相比较,添加枸杞浸提物比山药浸提物增菌效果要好.
表3 实验安排和实验结果
实验号A(碳源) B(氮源) C(浸提物)
实验结果
pH枸杞,山药OD600nm枸杞,山药
1 A1 B1 C1-1,C2-1 5154,5164 01747,01616
2 A1 B2 C1-2,C2-2 5120,5139 01811,01667
3 A1 B3 C1-3,C2-3 5121,512
4 01846,01672
4 A2 B1 C1-2,C2-2 5132,5186 01867,01645
5 A2 B2 C1-3,C2-3 5126,5122 01812,01670
6 A2 B3 C1-1,C2-1 5128,5123 01832,01680
7 A3 B1 C1-3,C2-3 5138,5187 01829,01652
8 A3 B2 C1-1,C2-1 5151,5148 01756,01663
9 A3 B3 C1-2,C2-2 5125,5136 01850,01723
表4 极差分析结果
pH OD600nm
枸杞K15132 5141 5144 01801 01814 01778
K25129 5132 5126 01837 01793 01843
K35138 5125 5128 01812 01843 01829
R 0109 0116 0118 01036 01050 01065
山药K15142 5179 5145 01652 01638 01653
K25144 5136 5154 01665 01667 01678
K35157 5128 5144 01679 01692 01665
R 0113 0151 0110 01027 01066 01025
2.3 几种不同培养基中B.adolescentis生长曲线的比较
附图B.adolescentis的生长曲线
p:枸杞增菌培养基;w:山药增菌培养基;u:TPY培养基
从附图可以看出,两种优化后的添加中药浸
提物培养基和TPY相比较,前者培养B.adoles-
centis,在稳定期时活菌数都高于TPY培养基.且
枸杞增菌培养基在达到稳定期时,其活菌数明显
高于其它两种培养基,活菌数达到2.21@108cfu/
mL,是TPY培养基活菌数的6倍左右,所以枸杞
增菌培养基适合该菌的生长.
3 讨论
双歧杆菌培养基有几十种之多.在比较众多
培养基基础上,考虑到B.adolescentis的营养要
求,一般可以在培养基中加入BF达到增菌目
的[8].目前,在培养基中应用BF主要是纯低聚糖,生产成本十分昂贵.为此,人们从含多糖类的中药原料
中寻找BF如黄芪、芦根、刺五加、五味子等,取得了良好的效果,但中药对菌种具有选择促生性[9].
191第1期张火云等:中药及其优化培养基对双歧杆菌增殖的影响我们通过比浊法初步选择了枸杞和山药浸提物作为BF,采用正交实验设计,优化出B.adolescentis
的培养基,即枸杞增菌培养基和山药增菌培养基.枸杞浸提物主要含枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素及类胡
萝卜素酯、维生素C、莨菪亭、多种氨基酸及微量元素K、Na、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、P等成分.山药浸提物
中,含有粘多糖、皂甙、胆碱、盐酸多巴胺、山药素、尿囊素等,枸杞和山药浸提物具有明显的抗氧活
性[10~12].而双歧杆菌是通过分泌细胞外各种酶来分解利用不同的BF,并促进其生长繁殖.如:A,B-半乳糖
苷酶、A,B-葡萄糖苷酶、B-呋喃果糖苷酶、甘露糖苷酶、D-木糖苷酶、D-木糖异构酶等[12].
枸杞和山药浸提物的丰富营养成分和抗氧活性,加上双歧杆菌较强的生理活性特征,可能是两种浸提
物对严格厌氧菌B.adolescentis具有显著促生长影响的关键所在.至于枸杞和山药浸提物的各种营养成
分是如何与双歧杆菌互相作用,还要借助其它手段如气-质谱、核磁共振等作深入研究,这无疑对扩大枸杞
和山药保健产品资源开发具有十分重要意义.
参考文献:
[1] Gibson G R, Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria[J]. J.Appl.Microbiol,
1994,77(2) : 412 -420.
[2] 凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999.108.
[3] 居述林.两歧双歧杆菌培养基成分的改进[J].复旦学报(自然科学版),1998,37(2):186-190.
[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993.
[5] Norris J R. Methods in Microbiology vol[M]. London and New York:3B Academic Press. 1969.117-132.
[6] 沈萍.微生物学实验(第三版)[M].北京:高等教育出版社,2001.95 -96.
[7] 汪锡孝.试验研究方法[M].长沙:湖南科学技术出版社,1988:118-122.
[8] 康白.双歧杆菌[M].大连:大连海事大学出版社,1998:159-160.
[9] 魏林.不同浓度的中药合剂对双歧杆菌增殖的影响[J].中国微生态学杂志,1997,9(5):29-30.
[10] 刘玉鹏. 30种中草药的抗氧化活性研究[J].烟台大学学报(自然科学与工程版),2000,13(1):70-73.
[11] 钱彦丛,宇文萍.枸杞子的化学成分及药理研究新进展[J].中医药学报,2000,4:33- 36.
[12] 刘蓉.双歧杆菌糖苷酶的研究[J].中国微生态学杂志.1996,8(6):42 -47. The Effecting of Chinese Traditional Medicine and Optimization
of Culture Medium onBifidobacteriumMultiplication
ZHANG Huo-yun1, SUN Qi-ling1, YUAN Yue-xiang2,LIUXiao-feng2, CHEN Fei2 (1. College of Life Science, Sichuan University,Chengdu 610064,China;2 .Chengdu Inst. Biol. Ch-i
nese Academy of Sciences, Chengdu 610041,China)
Abstract:Spectrophotometric method was used to determine the growth promoting effect ofLycium bar-
barumandChinese yam.s extracts onBifidobacterium adolescentis. Two optimum reproducible culture
medium was optimized by quadratic design. The adding concentration of 50%Lycium barbarum.s extract
was 2%, and 25%Chinese yam3% . Under optimum culture condition , growth curve for strain was mea-
sured. By Hungate anaerobic cultivition and a concrete roll tube method detecting CFU in stationary phase,
CFU got to 2.21 108cfu/mL.
Key words:Bifidobacterium adolescentis;Chinese traditional medicine; multiplication;optimization of culture
medium
192四川大学学报(自然科学版)第41卷。