猪细小病毒检测基因芯片的构建及初步应用

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Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ；ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＬＩ Ｗ ｅｎ－ｇａｎｇ
猪 细小病 毒 病是 由猪 细小病 毒 （ＰＰＶ）引起 的一 种猪繁殖障碍性疾病 ，怀孕母猪发生 流产 ，产死胎 、 木乃 伊 胎 。该 病 在 世 界 许 多 国家 和 地 区都 有 不 同 程度 的发 生 和 流 行 ，严 重 影 响 了养 猪 业 的 健 康 发 展 。 因此 ，建 立一 种 敏 感 、快 速 、准 确 的猪 细小 病 毒检 测方 法就 尤为 重要 。
摘要 ：本研究 以猪细小病毒 ＶＰ２基 因为 目的基 因设计 引物和探针 ，通 过不对称 ＰＣＲ扩 增 Ｃｙ３标 记的 ＤＮＡ片段 与 固定 于芯片上 的探针进行 杂交 ，对杂交芯片进行 扫描 分析 ，根据荧光信号 的强度来 确定是否存在猪细小病毒 。结果 表明 ，采用浓 度为 ５ Ｉｘｍｏ］／Ｌ的探针 与 ＰＣＲ产物 于 ４７℃ 杂交 １ ｈ即可得到清 晰的荧光 信号 ，检测灵敏 度可达 ３４．５ ｒｉｇ／ ，同时用 制备 的 基因芯片对临床 ２Ｏ份 疑似猪 细小病毒病感染 的病料进行检测 ，检测结果与 ＰＣＲ检测结果符合率达 １００％ ，表明基 因芯片检 侧技术是一种灵敏度 高、特异好 的检侧方法 。该方法 的建立可以快速有效地对猪细小病毒做 出诊 断 ，具有较好 的应用前景 。
基 因芯 片 点 样液 、杂交 液 、醛 基 基 片 、芯 片杂 交 盒 （博 奥 生 物 集 团有 限公 司 ）；Ｅｚｕｐ柱 式 病 毒 ＤＮＡ 抽提 试剂 盒 （上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 ）；５× 电泳 储 存 液 （５ ｘ ＴＢＥ）、洗 脱 液 １、２、３等 均 由 河 南 牧 业 经 济 学 院 猪 病 防 控 中 心 实 验 室 配制 。 １．３ 基 因 组 ＤＮＡ 的提 取 按 照 常 规 细胞 培 养 方 法 ，在 ＰＫ一１５细胞上增 殖病毒 ，按照基 因组 ＤＮＡ 提取试 剂 盒说 明书 提取 猪细小 病 毒 ＤＮＡ模板 。 １．４ 引物及 探 针 的设 计 与合成 参照文 献 ，以猪 细 小 病毒 （ＧｅｎＢａｎｋ序列 号 为 ：ＮＣ一００１７１８）ＶＰ２蛋 白 的基 因序 列 为靶 序列 ，利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０引 物 设 计 软件设 计 特异性 引 物和探 针 。
收稿 日期 ：２０１７—０７—２６ 基金项 目：河南省科技厅科技攻关项 目（１５２１０２２１０３１９） 作者简介 ：吴凤笋 （１９７７一），女 ，硕 士 ，主要从事动 物疫病 防制 研 究 ，Ｅ·ｍａｉｌ：ｗｆｓｕｎ２００８＠ １６３．ｓｏｎ 通讯作 者 ：李文 刚，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｇａｎ—ｌｉ＠ １２６．Ｃｏｒｎ
关键词 ：猪细小病毒 ；基 因芯片 ；检侧方 法
中图分类 号：￥８５４．４４
文献标志码 ：Ａ
文章编 号 ：０５２９—６００５（２０１８）０１－００３７－０３
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｍ ｅｔａｒｖｏｖｉｒｕｓ
ＷＵ Ｆｅｎｇ—ｓｕｎ ，ＬＹＵ Ｙｕ－ｊｉｎ ，ＬＩＵ Ｌｉｎｇ—ｌｉｎｇ ，ＺＨＡＯ Ｄｉ ，ＬＩ Ｗｅｎ—ｇａｎｇ
本研究将荧 光标记 的猪 细小 病毒 ＶＰ２基 因 ＰＣＲ 扩增产物 与 固定 于基 因芯 片上 的探 针进 行 杂交 制作 基 因检测 芯片 ，以达 到能 快速 、准 确 的检 测 到猪 细小 病 毒 ，为生产实践提供一种检 出率高 的诊断方法。
１ 材料 与 方法
１．１ 分离 毒株 猪 细小 病 毒 分 离 毒 株 由河 南 农 业 大学 魏 占勇教 授惠 赠 。
（１．Ｈｅｎａｎ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｕｉｍｕｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００４６ ，Ｃｈｉｎａ ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ＨｕＳｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ ，Ｃｈｉｎａ）
１．２ 主要仪器及设备 基 因芯 片点样仪 （美 国 Ｂｉｏ— Ｄｏｔ公司）；Ｉｎｎｏｓｃａｎ７００型 基 因芯 片 扫描 仪 （法 国 Ｉｎ． ｎｏｐｓｙｓ公 司 ）；ＰＣＲ仪 （苏州 东 胜 兴业 科 学 仪 器 有 限 公 司 ）；恒温 培养 箱 （上 海 一恒 科 学仪 器 有 限公 司 ）； ＤＹＹ一１２型 电脑 三 恒 多 用 电 泳 仪 （北 京 六 一 仪 器 厂 ）；Ｔａｎｏｎ ２５００全 自动 数 码 凝胶 成 像 分析 系统 （上 海 天能科 技有 限公 司）。
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ Ｉ ｈｏｕｒ ｇｏｔ ｃｌｅａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａ１．Ｔｈｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ ｆ ｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｏｒ－
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ｃｌｎｅ ｐａｒｖｏｖｌｒｕｓ·
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｏｆｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ．Ａｍｐｌｉｆ ｉｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇ－ ｍｅｎｔｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ３ ｗｅｒｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐｆｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ ｐｒｏｂｅｓ．Ｔｈｅｎ ，ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＷａＳ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｃａｎ— ｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｆ ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａ １．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ５ ｔ￣Ｍ／Ｌ ｏｆ ｐｒｏｂｅ ｔｏ ｈｙｂｒ ｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｆ ｉｎａ￣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
中国兽医杂志 ２０１８年 （第 ５４卷 ）第 １期 ３７
猪 细 小 病 毒 检 测 基 因 芯 片 的 构 建 及 初 步 应 用
吴凤 笋 ，吕玉金 ，刘玲玲 ，赵 迪 ，李文 刚
（１．河南牧业经 济学 院动物医学院 ，河南 郑州 ４５００４６；２．河南农业 大学 牧医工程学院 ，河南 郑州 ４５０００２）