基因工程步骤课堂PPT

非编码区 编码区上游
编码区
非编码区 编码区下游
启动子
终止子
与RNA聚合酶结合位点
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基因工程的基本操作程序
目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
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一、目的基因的获取
用3分钟阅读P8-11，并思考下列问题，然后用 2分钟与同桌交流、讨论。 1、获取？ 4、何谓PCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？
如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基
因或目的基因已经转录。
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2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: 分 子 杂 交 ②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,
若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原-抗体杂交（蛋白质是抗原）
（二）鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
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个人观点供参考，欢迎讨论
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
启动子
编码区下游
外显子
内含子
(能编码蛋白质) (不能编码蛋白质)
调控遗传信息的表达 (调控序列)
终止子
1
非编码区 与RNA聚合酶
结合位点
mRNA前体
成熟mRNA
编码区
非编码区
1
2
34
5
外显子
内含子
转录
加工
切除内含子转录部分 2
原核细胞的基因结构
能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质
力
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整
合到受体细胞染色体的DNA上。
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③转化过程:
Ti质粒 目的基因
构建
表 达
转入
农 杆
导入
载
菌
体
植 物 细 胞
插入 植物细胞 表达 新
染色DNA
性
状
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（2）基因枪法
单子叶植物适用此方法
基因枪法又称微弹轰 击法，是利用压缩气体 产生的动力，将包裹在 金属颗粒表面的表达载 体DNA打入受体细胞中， 使目的基因与其整合并 表达的方法。
– 是否插入目的基因 – 是否转录 – 是否翻译
• 个体生物学水平鉴定
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（一）检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程:
① 首先取出转基因生物的基因组DNA； ② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等 作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示 出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。35
合成与模板互补的__D_N_A_链___。
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PCR总结： PCR的基本反应步骤
变性 90-95˚C
延伸 70-75˚C
退火 55-60˚C
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3、化学方法人工合成目的基因
基因比较小,已知核苷酸序列，直接利 用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
蛋白质 的氨基 推测 酸序列
mRNA 的核苷 酸序列

⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万
倍地扩增
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⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板
在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A_
b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引
物与DNA模板结合，形成局部__双___链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，
① 概念：PCR全称为__聚__合__酶__链__式__反__应_，是一项在生物 __体__外___复制_特__定__DN__A片___段____的核酸合成技术
②原理：__D_N_A_双__链__复__制_____ ③条件：已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列__(_前__提__条__件__)_ ___四__种__脱__氧__核__苷__酸___、 _成__对__引__物____ 、 __D_N_A_聚__合__酶__(_T_a_q_酶__）__ ④方式：以_指__数__方式扩增，即_2_n __（n为扩增循环的次数）
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三、将目的基因导入受体细胞
1、原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径
2、方法
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——感受态细胞
微生物细胞
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（1）农杆菌转化法
①特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，
对大多数单子叶植物没有感染能
①方法：显微注射法
②程序：
目的基因表达载体提纯
取卵（受精卵）
显微注射
受精卵
新性状动物
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3.将目的基因导入微生物细胞
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、
遗传物质相对少
过程：
Ca2+处理大 肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收DNA
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四、目的基因的检测与鉴定
• 分子水平检测:
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（3）花粉通道法 适用于被子植物
植物花粉在柱头上萌 发后，花粉管要穿过花柱 直通胚囊。花粉管通道法 就是在植物受粉后，花粉 形成的花粉管还未愈合前， 剪去柱头，然后，滴加 DNA（含目的基因），使 目的基因借助花粉管通道 进入受体细胞。
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柱头
雌 蕊 花柱
胚珠 子房
子房壁
花药
雄 蕊
花丝
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2、将目的基因导入动物细胞
• （1）生物之间进行基因交流，只有使 用受体生物自身基因的启动子才能有 利于基导入受体细 胞无法转录。
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终止子的作用是什么？
终止子是位于基因尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录。
标记基因有什么作用？
是为了鉴别受体细胞中是否含有目 的基因，从而将有目的基因的细胞筛选 出来。基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
按外源DNA片段的来源分基因分为： 基因组DNA：包含了某物种的DNA分离纯化→限制酶切
2）供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化→酶切法→分离特定大小DNA片段
目的基因与运载体的结合过程，实际上是
不同来源的基因重组的过程。
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2.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代 （2）使目的基因能够表达和发挥作用。
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3、基因表达载体的组成：
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因等
思考：它们有什么作用？ 23
表达载体为什么一定要有启动子？cDNA基因组小大
无
有
无
有
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以
部分基因可以12思考：怎样从基因中得到我们所需的目的基因？
根据基因的有关信息如根据基因的转录 产物mRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产 物蛋白质等来获取目的基因。
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2、利用PCR技术扩增目的基因
—聚合酶链式反应
PCR 14
推测
基因的 核苷酸
化学 合成
序列
目 的 基
因
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方法人工合成
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二、基因表达载体的构建—— 核心
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1、基因表达载体的构建方法
质粒
DNA分子
同一种 限制酶
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
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一、目的基因的获取
1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构 基因，也可以是一些具有调控作用的因增目的基因； （3）通过DNA合成仪用化同基因的许多DNA片段， 导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不 同接
4）重组DNRNA
反转录酶
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA(目的基因)
接到载体11③基因组和部分基因的比较类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间基因交流